Name: real-time monitoring of aurora kinase a activation using conformational fret biosensors in live cells
Uploaded: 2020-07-30T15:00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells at JoVE.com

אנו מודים למהנדסי המרכז להדמיית מיקרוסקופיה-רן (MRic, BIOSIT, Rennes, צרפת) על הייעוץ והעזרה, ובמיוחד ל- X. Pinson על קריאה ביקורתית של כתב היד. MRic הוא חבר בתשתית הלאומית France-BioImaging הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04). עבודה זו נתמכה על ידי המרכז הלאומי דה לה Recherche Scientifique (CNRS), ליגה Contre le Cancer Comités d'Ille et Vilaine, des Côtes d'Armor et du Finistère, והאגודה pour la Recherche Contre le Cancer (ARC) to G.B.

ג.B ביצע את הניסויים, כתב וסקר את כתב היד, וסיפק מימון, M.T. סקר את כתב היד וסיפק תמיכה. מ.ט. הוא יועץ מדעי ובעל מניות בחברת Inscoper (צרפת), המייצרת את הפתרונות למדידות FLIM מהירות המוצגות בכתב יד זה. אינסקופר תמך חלקית בפרסום הגישה הפתוחה של כתב היד. אינסקופר לא היה מעורב בתכנון ניסיוני, בטיפול בנתונים ולא בכתיבת כתב היד.

biosensors FRET מקודדים גנטית הם כלים אמינים למדידת ההפעלה של חלבונים בודדים או של מסלולי איתות שלמים41. במיוחד, הביו-סנסור AURKA FRET מהווה דרך מועדפת לחקור את ההפעלה של הקינאז בזמן ובמרחב. עם זאת, אלמנטים מסוימים ראויים לתשומת לב מיוחדת בעת תכנון או אופטימיזציה של ביו-סנסור FRET, לא רק במונחים כלליים אלא ליתר דיוק עבור AURKA.
ראשית, ניתן להתאים את האופי ואת המיקום היחסי של זוג FRET התורם / מקבל עבור פונקציות ספציפיות של קינאז זה. AURKA מועשרת מאוד בציר המיטוטי במהלך מיטוזה, אך היא קיימת לאורך מחזור התא ובמיקומים תת-תאיים שונים (למשל, צנטרוזומים, הגרעין והמיטוכונדריה)1,2. אם יש להשתמש ב- biosensor בתאים ספציפיים כמו מיטוכונדריה, אשר יכול להגיע pH חומצי, הבחירה של pH-insensitive תורם-מקבל זוג FRET כמו mTurquoise2 / shadowG צריך להיעשות. יתר על כן, הצבת תורם FRET בטרמינל C יכול לאפשר הדמיה טובה יותר של biosensor בתא תת-תאי זה, ואולי אפילו לייעל את זיהוי FRET בהתחשב בכך AURKA N-terminus הוכח לבקע חלקית במיטוכונדריה16,42.
שנית, דרך שטרם נחקרה לייעל את הביו-סנסור של AURKA FRET תדרוש תכנון זהיר יותר של מקשרים בין AURKA באורך מלא לבין זוג התורמים/מקבלי ההחלטות. לא רק המרחק בין הזוג הפלואורסצנטי, אלא גם המאפיינים של המקשר עצמו הוכחו כגורמים מרכזיים לשיפור יעילות FRET43,44,45,45,46. לאור זאת, הגדלת הנוקשות או הגמישות של המקשר עלולה לפגוע ביעילות FRET, או לשפר אותה עוד יותר.
שלישית, ידוע כי ביטוי יתר של AURKA גורם חריגות ציר מיטוטי בחלק משמעותי של תאים2. זה יהיה מעניין להשוות ΔLifetime המתקבל על ידי ביטוי אותו מבנה FRET תחת מקדם חזק כמו cytomegalovirus (CMV) - אחד היזמים הנפוצים ביותר שנמצאו וקטורים ביטוי יונקים - או תחת רצף מקדם מינימלי AURKA (CTTCCGG)14,47. מקדם זה הוכח בעבר כדי להציל מונופולים או צירים רב קוטביים הנובעים לאחר הפלת קינאז, והשימוש בו לא גרם הפרעות מחזור התאים ל se14,47. למרות ש-FLIM אינו רגיש לרמות ביטוי החלבון ולריכוזים היחסיים בתא11, ההנאה מהשוואה יסודית של שני היזמים באותו מערך ביו-סנסור תרחיב את ההבנה של מאגר AURKA המופעל בכל מקום נתון. בנוסף, הוא יספק תובנות חדשניות על האופן שבו הפעלת AURKA עשויה להשתנות עם הבעת יתר, אשר רלוונטית לפרדיגמות סרטן אפיתל והמטולוגיות.
לבסוף, יש לקחת בחשבון גם את יישום FRET במורד הזרם. נקודת מבט עתידית בתחום של AURKA תהיה לצבור את הביו-סנסור הקונפורמי של קינאז עם ביו-סנסור מבוסס מצע. ניתוח התנהגות FRET של שני ביו-סנסורים בו זמנית – תהליך המכונה מולטיפלקס FRET – דורש מקבל כהה על biosensor הראשון כדי למנוע דימום ספקטרלי דרך בערוץ התורם השני. בהקשר של AURKA, זה יפתח את נקודת המבט החדשה והמרגשת של זיהוי ההפעלה של הקינאז עם הביו-סנסור הראשון, והפעילות האנזימטית שלו כלפי מצע נתון עם השני. ההתפתחויות האחרונות במולטיפלקסינג מאפשרות כעת לצבור עד שלושה ביו-סנסורים בכל פעם48. יישום שיטה דומה בהקשר של AURKA יכול לייצג אסטרטגיה מבטיחה מאוד לא רק כדי לבדוק את יחסי הגומלין הפעלה-פעילות של קינאז, אלא גם לחקור מפלי איתות AURKA עם רזולוציה מרחבית חסרת תקדים.
לסיכום, FRET/FLIM היא דרך נוחה להעמיק את הידע על פעילות החלבון. מצד אחד, הוא מאפשר לדמיין את הלוקליזציה של חלבון נתון בתאים חיים, הודות לפחות moiety פלואורסצנטי אחד. מצד שני, זה יכול לפענח שינויים קונפורמציה חלבון, אשר יכול להיות אינפורמטיבי על הפעלת חלבון ו / או פעילות. לכן, FRET / FLIM ו biosensors FRET קונפורמציה יש את הפוטנציאל של הפיכת שיטות נפוצות לעקוב אחר מסלולי איתות בתאים חיים, ועם רזולוציה spatiotemporal מעולה.

אורורה קינאז A/AURKA הוא סרין רב תכליתי/קינאז תרוניני, פעיל לאורך מחזור התאים ובתאים תת-תאיים שונים1. הבנת ההפעלה המרחבית הרחבה שלה חשובה במיוחד בסרטן, שכן AURKA מתבטאת לעתים קרובות יתר על המידה בממאירות אפיתל והמטולוגית, כאשר חולים מראים היענות לקויה לטיפולים הזמינים כיום2.
מחקרים מבניים גילו כי AURKA עוברת שני שלבים כדי להפוך מ קינאז לא פעיל לקינאז פעיל. ראשית, החשיפה האוטומטית של Thr288 משנה את הקונפורמציה של הכיס הקינטי של הקינאז ומפעילה אותו 3,4,5,6. צעד זה מגביר את הפעילות הקטליטית של AURKA בתאים אנושיים ובקסנופוס לאביס3,6,7, ומכין את הקינאז לפעילות מלאה. לאחר ההפעלה, האינטראקציה של AURKA עם חלבון הפילוח עבור Xklp2 (TPX2) גורמת לשינוי קונפורמציה שני5. שינוי נוסף זה מאפשר לאאורקה להגיע לפעילות אנזימטית מלאה לקראת המצעים שלה בתא 5,8,9,10.
במשך כמעט שני עשורים, תובנות על ההפעלה והפעילות של AURKA התקבלו בעיקר באמצעות שילוב של גישות ביוכימיות. אלה כוללים את הזיהוי של Thr288 זרחן בתאים או ויוו כסימן היכר של הפעלת AURKA, ניתוחים קריסטלוגרפיים, במבחנה או בבדיקות קינאז צלולו כדי לחקור את הפעילות של AURKA1. עם זאת, הרזולוציה המרחבית של גישות אלה היא ירודה או נעדרת, והיה צורך בפתרונות חדשניים כדי להרחיב את הידע על הדינמיקה של שני אירועים אלה.
הפיתוח של בדיקות פלואורסצנטיות בשנים האחרונות הקל על ניטור של AURKA בתאים חיים, ומאפשר את הבא של הפעלתו עם רזולוציה מרחבית גדולה יותר. החיישנים הספציפיים ביותר עבור AURKA שפותחו עד כה מסתמכים על עיקרון FRET (העברת אנרגיית התהודה של Förster)11 כדי להפלות בין AURKA לא פעילה ופעילה. החיישן הראשון שפותח היה ביו-סנסור מבוסס מצע של פעילות AURKA kinase. ביו-סנסורים מבוססי מצע מורכבים על ידי רצף אמינו-סידי קצר המיועד לקינאז נתון לזרחן, ומוכנסים בתוך זוג FRET של תורם/מקבל ותחום מחייב המזהה את שאריות הזרחן, המסייע בקיפול הביו-סנסור לתהליך FRET יעיל12. במקרה של AURKA, שבר 14-aminoacid של KIF2C ממוקד על ידי זרחן הוכנס בין תורם CFP-YFP / מקבל זוג13. עם זאת, לחיישן זה יש כמה חסרונות גדולים. ראשית, רצף KIF2C המשמש בגשוש זה יכול להיות ממוקד הן על ידי AURKA והן על ידי קינאז AURKB הקשורים קשר הדוק, ובכך להקטין את הספציפיות של biosensor זה. שנית, החיישן מסתמך על קינאז אנדוגני עבור זרחן. לכן, יעילות FRET יכולה להיות בלתי ניתנת לגילוי או לא משמעותית אם כמויות הקינאז מגבילות (למשל, בתאים תת-תאיים או בשלבי מחזור תאים). כדי להתגבר על מגבלות אלה, סוג חדש של חיישן AURKA נוצר המכונה "חיישנים קונפורמצונליים". בבדיקות אלה, הרצף באורך מלא של AURKA הוכנס בתוך פלואורופור תורם ב N-terminus, ופלואורופור מקבל ב C-טרמינוס. AURKA הלא פעילה מציגה קונפורמציה "פתוחה", המרחיקה את ה- N וה- C-termini של הקינאז זה מזה. עם מרחק כזה בין שני termini (> 10 ננומטר), זוג התורם / מקבל נמצאים בתצורה לא מתירנית עבור FRET. להיפך, AURKA האוטוספורית מאמצת קונפורמציה "סגורה", כאשר שני טרמיני החלבון ושני הפלורופורים נמצאים בסמיכות. זה הוכח לאפשר FRET בין התורם לבין המקבל, אשר ניתן למדוד באמצעות הווריאציות בחיי התורם14,15. בדיקות כאלה מציגות מספר יתרונות. ראשית, הם מקודדים גנטית, והם יכולים לשמש כדי להחליף את קינאז אנדוגני בתא. שנית, הם מצילים את הפנוטיפים הנגרמים על ידי הנוקאאוט של AURKA, המציין כי הם פונקציונליים בתא. שלישית, הם מאפשרים לעקוב אחר ההפעלה של קינאז בתאים תת-תאיים שונים ולאורך מחזור התא. הבדיקות זיהו את ההפעלה של AURKA במקומות שבהם הקינאז ידוע להיות מופעל (כלומר centrosomes ואת הציר המיטוטי), וגם השתתפו בגילוי ההפעלה של AURKA במיטוכונדריה16. לבסוף, חיישנים אלה אפשרו הקרנות תוכן גבוה המבוססות על FRET / FLIM, שם השינויים הקונפורמציה של AURKA שימשו לזיהוי מעכבים פרמקולוגיים חדשניים17.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים הליך להמחשה של הפעלת AURKA בתאים מתורבתים. ראשית, אנו נעשה תובנה על זוגות פלואורופור פוטנציאליים עבור FRET. הבחירה של זוג התורמים/ מקבל המתאים ביותר תיעשה על פי הגדרת המיקרוסקופ הזמינה, או יישום במורד הזרם מסוים כמו מולטיפלקס FRET18,19. לאחר מכן, אנו מציעים צינור כדי לחקור את ההתנהגות של biosensor(ים) שנבחר בהגדרת מיקרוסקופ FRET / FLIM מהירה. צינור זה יתרחב מתרביות תאים ותהליכי סינכרון לרכישת FLIM וניתוח נתונים. לבסוף, נדון ביתרונות הפוטנציאליים של פרוטוקול זה, שכן אסטרטגיה אנלוגית לעיצוב ביו-סנסור יכולה להיות מיושמת על קינאות אחרות, וניתן להשתמש בה גם עם מערכות הדמיה אחרות המבוססות על FRET.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alisertib (MLN8237)</td>
			<td>SelleckChem</td>
			<td>S1133</td>
			<td>Use at a 250 nM final dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>41966052</td>
			<td>High glucose + L-glutamine + Sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L15</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Leibovitz&#39;s L15 medium + L-glutamine, no Phenol red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabTek</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>2515380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Merck 
			Brand: Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1404</td>
			<td>Use at a 100 ng/mL final dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Penicillin-Streptomycin 10,000 U/mL (100x)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>14190169</td>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>ThermoFischer Scientific 
			Brand: Gibco</td>
			<td>25300096</td>
			<td>Trypsin-EDTA 0.05%, Phenol Red (1x)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time monitoring of aurora kinase a activation using conformational fret biosensors in live cells

סרטן האפיתל מסומן לעתים קרובות על ידי ביטוי יתר של Ser / Thr קינאז אורורה A / AURKA. AURKA הוא חלבון רב תכליתי המופעל על ההתפשטות האוטומטית שלו על Thr288. שפע AURKA מגיע לשיאו במיטוזה, שם הוא שולט ביציבות ובנאמנות של הציר המיטוטי, וביעילות הכללית של מיטוזה. למרות מאופיין היטב ברמה המבנית, ניטור עקבי של ההפעלה של AURKA לאורך מחזור התא חסר. פתרון אפשרי מורכב משימוש בביו-סנסורים של העברת אנרגיית תהודה (FRET) המקודדים גנטית של Förster כדי לקבל תובנה לגבי החשיפה האוטומטית של AURKA עם רזולוציה מרחבית מספקת. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להנדס biosensors FRET זיהוי Thr288 autophosphorylation, וכיצד לעקוב אחר שינוי זה במהלך מיטוזה. ראשית, אנו מספקים סקירה כללית של זוגות FRET תורמים/מקבלים אפשריים, ואנו מראים שיטות שיבוט והכנסה אפשריות של ביו-סנסורים של AURKA FRET בתאי יונקים. לאחר מכן, אנו מספקים ניתוח שלב אחר שלב למדידות FRET מהירות על ידי מיקרוסקופיה הדמיה לכל החיים פלואורסצנטיות (FLIM) על התקנה שנבנתה בהתאמה אישית. עם זאת, פרוטוקול זה חל גם על פתרונות מסחריים חלופיים הזמינים. אנו מסכמים על ידי התחשבות בבקרות FRET המתאימות ביותר עבור ביו-סנסור מבוסס AURKA, ועל ידי הדגשת שיפורים עתידיים פוטנציאליים כדי להגביר עוד יותר את הרגישות של כלי זה.

עקבנו אחר ההליך המתואר לעיל כדי לתעד את הפרסום האוטומטי של AURKA על Thr288 באמצעות שני biosensors עם תכונות ספקטרליות שונות. השווינו את הבדיקה הראשונית GFP-AURKa-mCherry14 עם שני biosensors עם תכונות ספקטרליות שונות. שתי בדיקות אלה מסתמכות על התורם הפלואורסצנטי mTurquoise2 ועל מקבל לא פלואורסצנטי (ShadowG) במקרה אחד, או מקבל צהוב (superYFP) במקרה שני. לאחר מכן הכנסנו את הרצף באורך מלא של AURKA בתוך כל זוג תורמים / מקבלים. כדי לקבל שליטה שלילית להפעלת AURKA, ניתן לנקוט בשתי אסטרטגיות. ראשית, השימוש ATP-אנלוגי קטן (MLN8237) מפריע לכריכת ATP בכיס הקינטי של הקינאז ומונע את הפעלתו38. שנית, המוטציה של Lys162 לתוך Met (K162M), יוצרת גרסה מתה קינאז של כל ביו-סנסור שאינו מסוגל להפעיל 14,15,39. מוטציה זו גורמת לשיבוש של גשר מלח שנקבע בדרך כלל בין Lys162 ו Glu181, אשר גורם לפתיחה יציבה של הכיס הקינטי של קינאז ומפעיל את ההשבתה הכוללת שלה40. כבקרה שלילית עבור FRET, השתמשנו במבנה נטול קבילות (GFP-AURKA או AURKA-mTurquoise2).
לאחר סנכרון תאים ב-G2/M ושחרורם למיטוזה, מדדנו את משך החיים של כל המבנים שהושפעו מהציר המיטוטי (איור 4). שימו לב, מבנה זה נחשב בכללותו, ולא נותחו החזרי השקעה בתוך הציר. לאחר מכן חישבנו את ΔLifetime עבור כל התנאים. כצפוי, אורך החיים של GFP-AURKA או AURKA-mTurquoise2 (התנאים "התורמים בלבד") היה קרוב ל- 0, מה שמצביע על כך שהערכים שנמדדו עבור מבנים אלה נעו סביב הערך הממוצע (איור 4A,4B). לעומת זאת, ערכי ΔLifetime עבור GFP-AURKA-mCherry היו שונים סטטיסטית מהמצב התורם בלבד, כאשר ΔLifetime גדל מ- ~ 130 ps (איור 4A). תצפיות דומות נעשו עבור shadowG-AURKA-mTurquoise2 ועבור superYFP-AURKA-mTurquoise2, עם עלייה של ΔLifetime של ~ 150 ו ~ 220 ps מהמצב התורם בלבד, בהתאמה (איור 4B,4C). ניתן להציג נתונים אלה בקלות בתאים בודדים עם טבלת בדיקת מידע מדומה (LUT). במקרה זה, ערכים של ΔLifetime סביב 0 הם צהוב פסאודוקולרי, בעוד הבדלים משמעותיים יותר הם פסאודוקולור אדום / סגול. ואכן, ה-LUT של פיקסל אחר פיקסל היה קרוב יותר לצהוב בתאים המבטאים את המבנים התורמים בלבד, בעוד שהוא היה יותר בספקטרום האדום/סגול בתאים המבטאים או ביו-סנסור (איור 4A,4B). זה נצפתה גם כאשר GFP-AURKA-mCherry biosensor טופל עם מעכב פרמקולוגי MLN8237.
לאחר מכן ניתחנו את ΔLifetime של ביו-סנסורים מתים קינאז. מבנים אלה הראו ערכי ביניים של ΔLifetime: ΔLifetime היה גבוה משמעותית בהשוואה למצב התורם בלבד (איור 4B,4C), אך הוא גם היה נמוך משמעותית מעמיתיהם הרגילים (איור 4B,4D). ההשוואות עם תאים שטופלו ב- MLN8237 או מבטאים ביו-סנסורים מתים של קינאז נחוצים כדי להעריך אם וריאציות ΔLifetime עבור כל זוג תורמים/מקבלים קשורות אך ורק להפעלת AURKA. במקרה של GFP-AURKA-mCherry, וריאציות ΔLifetime מבוטלות כאשר נעשה שימוש במעכב ספציפי לאורקה. לעומת זאת, וריאציות ΔLifetime הן בעיקר, אך לא קשורות באופן בלעדי להפעלת AURKA במקרה של shadowG-AURKA-mTurquoise2 ושל superYFP-AURKA-mTurquoise2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig01.jpg"> איור 1: GFP (תורם) ו-mCherry (מקבל) עירור וספקטרום פליטה. ספקטרה הושגו והותאמו מאתר בסיס FP (https://www.fpbase.org/), והותאמו לעירור לייזר של 480 ננומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig02.jpg"> איור 2: תמונה של סביבת העבודה הניסיונית. (1) פתרון הבקרה; (2) מקור לייזר לבן; (3) מצלמת CCD; (4) הגדרת מיקרוסקופ; (5) מקור אור חיצוני / מנורה להקרנת עינית של המדגם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig03.jpg"> איור 3: תמונות מייצגות של התוכנה לרכישת FLIM. (א, ב) (1) פרמטרי עירור ופליטה עבור התורם (CFP ב - A, או GFP ב - B); (2) זמן חשיפה; (3) בחירת המטרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61611/61611fig04v3.jpg"> איור 4: תמונות מייצגות של הביו-סנסורים של AURKA FRET ושל הפקדים השליליים שלהם. (A) (מיקרוגרף) פלואורסצנטיות (ערוץ ירוק) ופיקסל אחר פיקסל ΔLifetime (תורם בלבד – biosensor) של תאי U2OS המבטאים GFP-AURKA או GFP-AURKA-mCherry, המסונכרנים ב- G2/M, משוחררים עד שהציר הדו-קוטבי גלוי לאחר מכן מטופל ב- DMSO או עם MLN8237. ΔLifetime מאויר בקנה מידה פסאודוקולור (טבלת בדיקת מידע "אש"). (גרף) כימות מתאים וניתוח ANOVA דו-כיווני עבור התנאים שצוינו. (B) (מיקרוגרף) פלואורסצנטיות (ערוץ ציאן) ופיקסל אחר פיקסל מתאים ΔLifetime (תורם בלבד – biosensor) של תאי U2OS המבטאים shadowG-AURKA-mTurquoise2 (פאנל עליון) או superYFP-AURKA-mTurquoise2 (פאנל תחתון), מסונכרנים ב- G2/M ומשוחררים עד שהציר הדו-קוטבי גלוי לעין. ΔLifetime מאויר בקנה מידה פסאודוקולור (טבלת בדיקת מידע "אש"). (גרף) כימות מקביל וניתוח ANOVA חד-כיווני של התנאים המיוצגים במיקרוגרפים לעיל. (C) (מיקרוגרפים) תמונות של AURKA-mTurquoise2 (פאנל עליון), shadowG-AURKA K162M-mTurquoise2 (פאנל אמצעי) ו- superYFP-AURKA K162M-mTurquoise2 שנרכשו ומיוצגים כמו במיקרוגרף. (גרף) ניתוח ANOVA דו-כיווני לתנאי הטרנספקטיה שצוינו. הסרגל בקופסאות מייצג את החציון; השפם משתרע מהדקה למקסימום n = 10 תאים לכל תנאי של ניסוי מייצג אחד (מתוך שלושה). ערכים בודדים מיוצגים כנקודות. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 כנגד כל מצב מצוין ב-(A) במצב "AURKA-mTurquoise2" ב-(B), ונגד כל מצב מצוין ב-(C). נ.ס. לא משמעותי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61611/61611fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells at JoVE.com

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

ההפעלה של סר/ת'ר קינאז AURKA רב תכליתית מסומנת על ידי ההתפשטות האוטומטית שלה על Thr288. בדיקות פלואורסצנטיות המסתמכות על FRET יכולות להפלות בין המצבים הלא פעילים והפעילים שלה. כאן, אנו מדגימים כמה אסטרטגיות להנדסת בדיקה, יחד עם פרוטוקול FRET מהיר כדי לעקוב אחר הפעלת קינאז לאורך מיטוזה.

ניטור בזמן אמת של אורורה קינאז הפעלה באמצעות Biosensors FRET קונפורמציה בתאים חיים

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...

Research

JoVE Journal

Biology

Combining QD-FRET and Microfluidics to Monitor DNA Nanocomplex Self-Assembly in Real-Time

שילוב QD-סריג ו מיקרופלואידיקה לפקח Nanocomplex DNA הרכבה עצמית בזמן אמת

Advances in genomics continue to fuel the development of therapeutics that can target pathogenesis at the cellular and molecular level. Typically ...

Monitoring Kinase and Phosphatase Activities Through the Cell Cycle by Ratiometric FRET

ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)-based reporters1 allow the assessment of endogenous kinase and phosphatase activities in living cells. Such ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

הדמיה בזמן אמת של יחיד תכנון הנדסי RNA תמלילים בתאים חיים באמצעות משואות bimolecular רציומטרי

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

זיהוי של ביטוי גנים בתאים תאיים חיים של Murine, אדם וחזירי מקור באמצעות חלקיקים שכותרתו פלואורסצנטי

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

G Protein-selective GPCR Conformations Measured Using FRET Sensors in a Live Cell Suspension Fluorometer Assay

G- חלבון סלקטיבית GPCR תצורות נמדדו באמצעות סריג חיישנים ב assay fluorometer השעית תא חי

F&#1255;rster resonance energy transfer (FRET)-based studies have become increasingly common in the investigation of GPCR signaling. Our research group ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

ממשק משתמש גרפי למעקב בסיוע תוכנה של ריכוז חלבון בהפרעות ניידות דינמיות

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...