Name: a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies
Uploaded: 2020-08-13T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبر Vijayanand على المساعدة التقنية والمناقشات البناءة والدكتور شارون سكوازو والسيد جيفري بيرجيه من Diagenode للمساعدة التقنية مع آلة معالج السائل sonicator وChIP والبروتوكولات. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة منح AI108564، R01HL114093، S10RR027366 (BD FACSAria II)، وS10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Mapping+of+in+Vivo+Protein-DNA+Interactions.">Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Mikkelsen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+maps+of+chromatin+state+in+pluripotent+and+lineage-committed+cells.">Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells.</a> Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Seumois, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+of+primary+human+T+cells+reveals+enhancers+associated+with+TH2+memory+cell+differentiation+and+asthma+susceptibility.">Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility.</a> Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17q21+asthma-risk+variants+switch+CTCF+binding+and+regulate+IL-2+production+by+T+cells.">17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells.</a> Nature Communication. 7, 13426 (2016).</li><li>Ai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+chromatin+states+using+single-cell+itChIP-seq.">Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communication. 6, 6033 (2015).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).</li><li>Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+and+Semiautomated+Microscaled+Approach+to+Profile+Cis-Regulatory+Elements+by+Histone+Modification+ChIP-Seq+for+Large-Scale+Epigenetic+Studies.">An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies.</a> Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> Elife. 6, 21856 (2017).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Genetic+Polymorphisms+on+Human+Immune+Cell+Gene+Expression.">Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression.</a> Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drivers+of+Epigenetic+and+Transcriptional+Variation+in+Human+Immune+Cells.">Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells.</a> Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).</li><li>Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEDIPS:+genome-wide+differential+coverage+analysis+of+sequencing+data+derived+from+DNA+enrichment+experiments.">MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments.</a> Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).</li><li>Engel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate-like+functions+of+natural+killer+T+cell+subsets+result+from+highly+divergent+gene+programs.">Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoBATCH+for+High-Throughput+Single-Cell+Epigenomic+Profiling.">CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li><li>Diagenode. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+Guide+for+Chromatin+Shearing+Optimization+with+Bioruptor+Standard+and+Plus.">The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus.</a> Diagenode. , (2012).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

الطريقة الموصوفة هنا تتوسع في إجراء ChIPmentation11، الذي ينفذ بروتوكول إعداد مكتبة الوسم قبل تنقية الحمض النووي ، عن طريق أتمتة البروتوكول وmicroscaling. منذ بداية ChIP-Seq ، تم تخفيض أعداد الخلايا المطلوبة بشكل كبير ، من حوالي 20 مليون خلية لهيستون إلى المئات وحتى الخلايا المفردة1و7و10و 12و18و19و20و21. وقد سمحت هذه الأساليب المطورة حديثا لفهم أعمق لكيفية عمل الآليات التنظيمية لرابطة الدول المستقلةفي الخلايا من خلال زيادة الحساسية والسماح لتجمعات الخلايا السريرية النادرة ليتم اختبارها5و6و12و17. على سبيل المثال، واحدة من الإجراءات الأكثر حداثة وشعبية، ودعا CUT &amp؛ TAG، كما ChIP-Seq قوية وحساسة البديل9. وتنتج نسبة ممتازة إشارة إلى الضوضاء كما يرتبط الإنزيم Tn5 بشكل متناقض إلى البروتين A ويعترف سلسلة FC من الأجسام المضادة ChIP مع خصوصية عالية9. يتم تقليل النشاط الخلفية من Tn5-انزيم كما انزيم ليست وظيفية قبل ربط للأجسام المضادة المستهدفة9. ومع ذلك ، فإن تنفيذ هذه الطريقة في سياق سريري محدود لأنه يتطلب خلايا حية غير ثابتة. أيضا، إزالة شظايا الحمض النووي من نواة هيبوتونيك يمكن أن يكون لها آثار سلبية على الكروماتين كما تتم إزالته من أثناء الفحص. الشرط اللازم للعمل مع الخلايا الطازجة والحية هو مصدر للقضايا لعينات سريرية نادرة والأفواج الكبيرة من العينات، لأن الأفواج الكبيرة يمكن أن يستغرق سنوات عديدة لجمع5. نوع آخر من الأسلوب، قطرة ChIP، يستخدم بأناقة جهاز microfluidics لتوليد tagmention قطرة على أساس قبل معالجة ChIP19. ومع ذلك، فإنه يستخدم جهاز microfluidic متخصصة للغاية، وعلى الرغم من أنه من الممكن لإكمال خلية واحدة ChIP-Seq، فإنه يقتصر أيضا على استخدام الخلايا الحية7،8،9،18،19. أحدث الأساليب التي تعتمد على ChIP-Seq مثل PLAC-Seq أو HiChIP، محاولة لفهم التفاعلات 3 الأبعاد (3D) بين قمم ChIP-Seq22،23. هذه الأساليب ثلاثية الأبعاد مثيرة لأنها تحدد التفاعلات بين رابطة الدول المستقلةأو TF بوساطة عبر الجينوم وفهم أفضل لتنظيم التعبير الجيني في أنواع الخلايا ذات الاهتمام ، في الأنسجة السليمة وفي سياق المرض.
هناك بعض الخطوات الحاسمة للنظر في البروتوكول لتكون ناجحة مثل نوعية الكروماتين سونيكاتيد وجودة الأجسام المضادة. القص كفاءة أمر بالغ الأهمية، إذا لم يتم sonicated الكروماتين بشكل جيد، وكفاءة المقايسة يقلل بشكل كبير24. سونيكيشن هو جانب من جوانب التحدي ChIP- Seq بسبب أرقام الخلايا المطلوبة. على sonicator المستخدمة في البروتوكول ، وخفضت الكفاءة بشكل كبير تحت 300،000 الخلايا. هذا هو جانب من جوانب التحدي في ChIP-Seq كما سونيكاتي تحت هذا المستوى غالبا ما تتطلب تجزئة الأنزيمية، وهو أقل حيادية. ونتيجة لذلك ، سونيكيشن هو عامل محدود رئيسي لChIP - Seq microscaled صحيح. تم اختبار منصات سونيكيشن أخرى ومجموعات متاحة تجاريا لchromatin سونيكاتي، ولكن سونيكاتور المستخدمة هنا كان النتائج الأكثر قوة واستنساخها. ميزة أخرى من sonicator هو عدم الاضطرار إلى شراء أنابيب متخصصة لتشغيل سونيكيشن، مما يقلل من التكاليف عند التعامل مع عدد كبير من العينات. ل sonication الأمثل ، أولا ، من المهم أن ما قبل الحارة sonicator كما هو موضح أعلاه. ثانيا، لlyse بيليه، فمن المستحسن أن يكون طرف ماصة لمس الجزء السفلي من الأنبوب في حين lysing لتفريق الخلايا مع المزيد من القيود المادية. ثالثا، أي تشكيل فقاعة قبل sonication يعوق قدرة العينة أن سونيكاتيد بالتساوي. إذا كان هناك أي فقاعات تشكلت أثناء التحلل ، فمن المهم إزالتها مع ماصة. هذا يمكن أن يكون تحديا دون إزالة الكثير من العينة، ولكن إذا تم الضغط على طرف طفيفة ضد فقاعة يمكن أن توضع ببطء دون فقدان الكثير من العينة. وأخيرا، عند تحديد عدد الدورات، أكمل دورة زمنية حيث تتم إزالة العينة وتنقيتها، ويتم تشغيلها على جل الآغاروز كل ثلاث دورات. تجنب أكثر من / تحت sonication من العينات وهذا يقلل من كفاءة ChIP. إذا كانت العينة تحت sonicated، شظايا كبيرة يمكن أن يكون لها تأثير سلبي على جودة ChIP-Seq24. من ناحية أخرى ، إذا كانت العينة أكثر من sonicated ، هناك خطر من الضياع epitope الهدف في هذه العملية.
جزء أساسي آخر من ChIP-Seq هو جودة الأجسام المضادة. قبل إجراء أي دراسة واسعة النطاق ، من الضروري تحسين الجسم المضاد الذي سيتم استخدامه. والهدف من ذلك هو الحصول على إشارة عالية إلى حد كبير إلى نسبة الضوضاء من المناطق المعروفة من الجينوم وآخر هو استنساخ. إذا كان الجسم المضاد هو سحب الكثير من إشارة الخلفية، قد يكون من المستحسن استخدام مدخلات أكبر أو محاولة الكثير مختلفة / المورد. وهذا سيضيف وقتا قبل البدء في تجربة واسعة النطاق، ولكنه خطوة أساسية. لاختبار الإشارة إلى الضوضاء، يوصى باستخدام qPCR مع المناطق المعروفة بأنها هدف للأجسام المضادة ومنطقة أخرى معروفة بالتغيب. وقد لوحظ تعديلات الهستون هي أكثر قوة وأسهل لتحسين من TFs.
يوفر البروتوكول المذكور أعلاه طريقة قوية لتعديل الهستون عالي الإنتاجية ChIP-Seq بطريقة شبه مستقلة ومصغرة. الأسلوب يحد من مقدار التدريب العملي على الوقت ويزيد من القابلية للاستنساخ على ChIP-Seq اليدوي. الدراسات السابقة التي أنجزت في المختبر تستخدم دليل ChIP على تكرار التقنية وحصلت على متوسط ارتباط سبيرمان من 0.505، ومع ذلك ، مع النظام شبه الموتوم ، وارتباط سبيرمان بين مختلف الجهات المانحة مع متوسط خلايا NK من 0.66(الجدول التكميلي 2). كما تم الانتهاء من ذلك مع حوالي 40٪ أقل التدريب العملي في الوقت المحدد. تم تحسين الطريقة الموضحة هنا لتعديلات الهستون (H3K27ac الموضحة هنا ، ولكن البروتوكول لا ينبغي أن يحتاج إلى أي تعديل للآخرين) وسيتطلب فقط تعديلات طفيفة ليتم تنفيذها ل TF ChIP-Seq. على الرغم من جودة الأجسام المضادة ، فإن التعديل الرئيسي سيكون لوقت سونيكيشن وربما المخازن المؤقتة المستخدمة أثناء IP. عادة، ل TF ChIP المقايسات، قد تعمل هذه الطريقة بشكل أفضل مع شظايا أطول قليلا من الكروماتين (مع مجموعة من حوالي 350-800 نقطة أساس) كما TF:مجمعات الحمض النووي هي على الأرجح أقل قدرة على الحفاظ عليها من خلال سونيكيشنصارمة 6. قد تحتاج المخازن المؤقتة أيضا إلى تغيير إلى مزيج مخصص أو مجموعات أخرى متوفرة في الصناعة ، حيث يمكن أن تتصرف TFs بشكل مختلف عن تعديلات الهستون.
وعلى الرغم من أن المعالج السائل الآلي ل ChIP قد تم اختباره لعدد قليل من الخلايا يصل إلى 10,000 خلية، إلا أنه كان هناك انخفاض ملحوظ في القابلية للاستنساخ بتركيزات الكروماتين المنخفضة. ونتيجة لهذا، لم يوص البروتوكول إلى أقل من 10،000 خلية، مع 100،000 الخلايا هي الظروف المثلى. كما تم الانتهاء من البروتوكول باستخدام مخازن ChIP الصناعية ، والتي كانت نفقات إضافية ولكنها قدمت بيانات ذات جودة أعلى. يمكن تعديل البروتوكول فيما يتعلق بشروط سونيكيشن (طالما يتم الاحتفاظ الكروماتين القص داخل نفس النطاق)، يمكن تخصيص المخازن المؤقتة لprecipitation المناعي (IP؛ قد تكون هناك حاجة إلى التحسين)، أو قد لا يتم استخدام معالج السائل ChIP. وهناك قيود على البروتوكول هو استخدام معالج السائل ChIP، والتي يمكن أن تكون استثمارا مكلفا ويمكن تشغيل 16 عينة فقط في وقت واحد. ويقتصر معالج السائل ChIP على ردود الفعل على نطاق صغير وأرقام الخلايا أكبر من مليون لا ينصح. ومع ذلك، يمكن إكمال البروتوكول بدونه، من خلال إكمال خطوات IP والغسيل يدويا. إذا تم الانتهاء من الملكية الفكرية ويغسل باليد، والوقت لإكمال الفحص سوف تزيد والقابلية للاستنساخ قد تنخفض، ولكن هذا الدليل سوف لا تزال مفيدة تشغيل تجربة عالية الجودة ChIP-Seq. وتجدر الإشارة إلى أنه يمكن تكييف معالجات سائلة أخرى لتشغيل ردود فعل ChIP شبه الفغرة.
وخلاصة الأمر أن الفوائد الرئيسية لهذا النظام هي الطبيعة العالية الإنتاجية، حيث يتم الانتهاء من خطوات الملكية الفكرية والغسيل بشكل مستقل. وعلى هذا النحو، يمكن إكمال جولات متتابعة من تجارب ChIP، مما يسمح بمعالجة ما يصل إلى 48 عينة بالكامل وجاهزة للتسلسل في غضون 5 أيام، مع وقت عملي محدود مقارنة بتجارب ChIP-Seq اليدوية. وثمة فائدة أخرى هي زيادة القابلية للاستنساخ لأن ChIP-Seq يمكن أن يكون من الصعب الحصول على نتائج قابلة للاستنساخ للغاية. وهناك طرق أخرى تتطلب إما خلايا حية، أو أنظمة معقدة للأنابيب الدقيقة، أو العمل الذي يجب إكماله يدويا. يجب تحسين هذا النظام للعينات منخفضة الإدخال (<10,000 خلية)، مما يسمح في نهاية المطاف بتفاعلات ChIP أحادية الخلية. النظام قادر أيضا على التكيف مع أحدث أساليب ChIP ، مثل PLAC - Seq وHiChIP22،23.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Pandurangan Vijayanad
to:
Pandurangan Vijayanand

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.

Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Sara Herrera-da&#160;la Mata
to:
Sara Herrera-de la Mata

الاستخدام الواسع لمقايسات ChIP-Seq لتحديد شظايا الحمض النووي المرتبطة بتعديلات معينة لهستون يرجع جزئيا إلى قدرته على تحديد عناصر الحمض النووي التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، بما في ذلك القدرة النشطة ، والمروجين ، وكواتم الصوت ، والهتيروماتين ، وغيرها1،2،3،4. وقد أظهرت تحديد المناطق التنظيمية غير الترميز عبر الجينوم نظرة قيمة لفهم أفضل لتنظيم الجينات في الصحة والأمراض4. وقد استخدم العمل السابق من المختبر ChIP-Seq لإظهار أن رابطة الدول المستقلة-العناصر التنظيمية يمكن أن تلعب أدوارا هامة في أنواع الخلايا المختلفة5. وقد استخدمت معامل النسخ (TF) ChIP المقايسات لإظهار الأمراض المرتبطة خطر واحد النيوكليوتيدات تعدد الأشكال6.
استخدام ChIP-Seq مع العينات السريرية البشرية أمر صعب ، ويرجع ذلك أساسا إلى الحد من أعداد الخلايا أو عينة الأنسجة المطلوبة. ونتيجة لذلك، كان هناك جهد متضافر في هذا المجال لتحسين وmicroscale هذه التقنيات ونتيجة لذلك، ظهرت العديد من المقايسات، مثل CUT&TAG5،7،8،9،10،11،12. يستخدم هذا المقايسة نقل إلى tagment وعزل المناطق الجينومية ملزمة بأجسام مضادة محددة9. وقد تمكنت هذه التقنية من تقليل أعداد الخلايا إلى 1000s وفي بعض الحالات إلى خلية واحدة ، ومع ذلك ، فإن استخدام هذه التقنية في البحوث التحويلية والايكريرية قد أظهرت قيودا بسبب متطلبات استخدام الخلايا الحيةلهذهالطريقة 9،12. متطلبات الخلية الحية يجعل العينات السريرية من الصعب من الناحية اللوجستية للتعامل مع ويمكن إدخال آثار دفعية إذا لم تتم معالجة العينات في نفس الوقت. وقد الأمثل الآخرين تقنيات microscaled للخلايا الفورمالديهايد الثابتة، بما في ذلك تطوير ChIPmentation11،والتي يتم تكييفها هنا بطريقة عالية الإنتاجية. استخدام الخلايا الثابتة يسمح العينات ليتم تخزينها حتى جمع ومعالجة لاحقة من جميع العينات معا للحد من الآثار الدفعية.
هنا ، يوصف فحص ChIP-Seq شبه المصغر الذي يقلل من الوقت العملي التجريبي لملف تعديلات الهستون10. تسمح الطريقة شبه الذرية بإجراء فحوصات ChIP-Seq عالية الإنتاجية ، مما يسمح بمعالجة ما يصل إلى 48 عينة بالكامل وجاهزة للتسلسل في أقل من 5 أيام ، مقابل عدد قليل يصل إلى 10000 خلية لكل عينة باستخدام معالج سائل ChIP. يكمل المعالج التكفير المناعي (IP) ويغسل لاحقا بطريقة مستقلة ، مما يساعد على تقليل التباين بين العينات. وتخفض الطريقة شبه الذرية الوقت العملي بأكثر من 15 ساعة ل 48 عينة والتباين التقني، مما يتيح إجراء دراسات لاجينية واسعة النطاق بطريقة قابلة للاستنساخ وسريعة للخلايا الأولية أو المستزرعة. البروتوكول يشرح العملية من البداية إلى النهاية للحصول على جودة عالية ChIP-Seq. إذا لم تتوفر أجهزة معينة، سيظل البروتوكول موردا مفيدا لإعداد تجارب ChIP-Seq وتصويرها يدويا.
تم إجراء الفحص بثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا المناعية البشرية الأولية وخط خلية مثقف واحد (HUT78 – ATCC: TIB-161). للوضوح ، تم تقسيم البروتوكول إلى سبعة أقسام: تثبيت الخلايا ، وقص الكروماتين عن طريق سونيكيشن ، والمناعة الآلية للكروماتين ، وإعداد المكتبة عن طريق تصنيف جزء الحمض النووي ، وتضخيم المكتبة ، وتنقية المكتبة ، تليها تحديد كمي للحمض النووي. للحصول على وصفات عازلة يرجى الرجوع إلى الجدول التكميلي 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="950">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">200 &#181;l tube strips (8 tubes/strip) + cap strips</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020002</td>
			<td style="width:288px;">Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">AMPure XP for PCR Purification</td>
			<td style="width:127px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>SPRI beads</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td>0.65 mL low binding tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Bioruptor Pico Sonicator</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B01060010</td>
			<td>Sonicator used in the lab but others can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ChIP DNA Clean &#38; Concentrator (Capped Columns)</td>
			<td style="width:127px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D5205</td>
			<td>DNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA pH 8.0</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Glycine</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">50046-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">H3K27ac polyclonal antibody - Premium</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15410196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES (1 M) pH 7.5</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20027213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20034197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IP-Star Compact Automated System</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B03000002</td>
			<td>Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">KK2601</td>
			<td>PCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">R0971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4551-250ML</td>
			<td>CAUTION - low flash point</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (5 M), RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-4700</td>
			<td style="width:288px;">8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PureLink RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td>Used in the flourescence quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">4485699</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ROX Reference Dye</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12223012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">303410-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td>nucleic acid dye</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Tips (bulk)</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30040020</td>
			<td>Tips for the IP Star</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">True MicroChIP Kit</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C01010130</td>
			<td>Contains all the buffers for the IP; ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies

إن التكفير المناعي للكروماتين يليه التسلسل (ChIP-Seq) هو نهج قوي ومستخدم على نطاق واسع لملف الحمض النووي الكروماتين المرتبط بتعديلات محددة لهستون ، مثل H3K27ac ، للمساعدة في تحديد عناصر الحمض النووي التنظيمية لرابطة الدول المستقلة. العملية اليدوية لإكمال ChIP-Seq كثيفة العمالة ، وصعبة من الناحية الفنية ، وغالبا ما تتطلب أعدادا كبيرة من الخلايا (>100،000 خلية). وتساعد الطريقة الموصوفة هنا على التغلب على تلك التحديات. ويرد وصف مفصل لإجراء كامل شبه دقيق H3K27ac ChIP-Seq بما في ذلك تثبيت الخلايا، وقص الكروماتين، وprecipitation، وإعداد مكتبة التسلسل، لدفعة من 48 عينة لإدخالات عدد الخلايا أقل من 100،000 خلية. تقلل المنصة شبه المستقلة من التباين التقني، وتحسن نسب الإشارة إلى الضوضاء، وتقلل بشكل كبير من المخاض. وبالتالي يمكن للنظام خفض التكاليف من خلال السماح بتقليل أحجام التفاعل ، والحد من عدد الكواشف باهظة الثمن مثل الإنزيمات والخرز المغناطيسي والأجسام المضادة والوقت العملي المطلوب. هذه التحسينات على طريقة ChIP-Seq تناسب تماما للدراسات اللاجينية على نطاق واسع من العينات السريرية مع عدد محدود من الخلايا بطريقة قابلة للاستنساخ للغاية.

كدليل على المفهوم ، تم الانتهاء من ChIP-Seq لستة متبرعين بشريين مع ثلاث مجموعات من أنواع الخلايا المناعية: خلايا CD4 T الساذجة (CD4) ، والخلايا الأحادية الكلاسيكية (MO) والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، التي أثراها فرز FACS كما هو موضح قبل13. ويتكون الإجراء المسطر من تسعة إجراءات متميزة كما هو ممثل في الشكل 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig1.jpg"> الشكل 1: مخطط انسيابي عام للإجراء. (أ) رسم كاريكاتوري للإجراء العام (تم إنشاؤه في BioRender). (ب) مخطط التدفق لجميع الخطوات الرئيسية للبروتوكول والوقت العملي المقدر وإجمالي الوقت المرتبط بكل يوم. يمكن أن يحدث التسلسل في نهاية اليوم الخامس أو في وقت لاحق مع جولات متعددة. يمكن أيضا أن يكون الجدول الزمني متداخلا على مدار الأسبوع ، حيث يمكن إكمال اليوم التسلسلي 3-4 عدة مرات في الأسبوع لتوليد 48 عينة من ChIP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig1large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
بعد عزل الخلية عن طريق قياس التدفقالخلوي 13، تم طرد الخلايا المفرزة وإصلاح الخلايا وتخزينها على النحو المبين أعلاه. وبمجرد جمع جميع العينات، تم تحليل العينات وإعدادها للقص اللوني على دفعات من 12 كما هو موضح أعلاه. لكل عينة، تم الانتهاء من عدد من الدورات للوصول إلى سونيكيشن الأمثل10. القياس الكمي، وكذلك قياسات حجم جزء الكروماتين المقص أظهرت استنساخ كبير لطريقتنا على ثلاث مجموعات من الخلايا المناعية(الشكل 2A). تم سونيكاتيد الخلايا المناعية البشرية المختلفة على دفعات منفصلة وأسفرت بشكل متسق جدا مع > 70٪ من العينة بين 100-500 نقطة أساس لمدة 14 دورة (16 s ON، 32 s OFF لكل دورة). عند هذه النقطة، اعتبرت عينات مع شظايا كبيرة بعد سونيكيشن (< 70٪ من العينة بين 100 -500 نقطة أساس) كما فشلت. يمكن لهذه العينات إما sonicated لدورات إضافية 1-2 أو تم التخلص منها واستبدالها في وقت لاحق مع خلايا من بيليه آخر. أظهرت طريقتنا أيا من العينات المطلوبة أكثر sonication أو تم القضاء عليها، مما يشير إلى قوة مطلقة من الإجراء.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig2.jpg"> الشكل 2: أمثلة مراقبة الجودة قبل التسلسل. (A) 1.2٪ المواد الهلامية agarose تظهر استنساخ سونيكيشن. عينات Sonication ل 6 متبرعين في ثلاثة أنواع من الخلايا: خلايا CD4 T ساذجة (CD4) ، الخلايا الأحادية الكلاسيكية (MO) ، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK). وكانت العينات sonicated لمدة 14 دورة (16 ق على، 32 ق قبالة في الدورة الواحدة). لكل عينة تم تحميل حوالي 200 نانوغرام من الكروماتين decrosslinked على هلام agarose 1٪. واعتبرت عينات جيدة إذا كان أكثر من 70 ٪ من شظايا في حدود 100-500 نقطة أساس. (ب) أعلى -- تحليل qPCR منحنيات التضخيم لتحديد العدد الأمثل للدورات للتضخيم (Ct حيث هناك 1 / 2 الحد الأقصى للكثافة). عينات مثالية لديها Ct من حوالي 15 والتضخيم يمكن أن تكتمل ما يصل إلى 2 دورة أكثر من Ct. قياس السهم هو مثال على مثال سيء حيث Ct هو أكبر من 18. أسفل - يظهر مثال على مجموعة ضعيفة من العينات التي تحتوي على Ct أكبر من 18. وأظهرت هذه العينات أيضا انخفاض كثافة الفلورسينس. (C) اليسار - أظهرت آثار محلل الشظايا الكهربائي توزيع المكتبات التي تم وضع علامات عليها النهائية بعد التضخيم واختيار الحجم. العينات مع أكثر من 85 ٪ من مكتبة جزء تقع ضمن 200-1000 نقطة أساس واعتبرت عينات جيدة. ويعتبر قياس كثافة الذروة من الفلورسينس أيضا كمعلمة مراقبة الجودة الهامة، في الواقع إذا كانت الإشارة منخفضة، العينة من غير المرجح أن تسلسل جيدا. اليمين - يتم عرض أمثلة للعينات الإيجابية في CD4 و MO و NK. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig2v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
بعد القياس الكمي، تم تشغيل العينات على معالج سائل ChIP مع الأجسام المضادة H3K27ac، تليها tagmentation مع انزيم Tn5 transposase. لتحديد العدد المناسب لدورات التضخيم بواسطة qPCR، تم استخدام 10٪ من العينات التي تم وضع علامات عليها. لتحديد عدد الدورات لتضخيم العينات، نجد الدورة التي كثافة العينة هو نصف متوسط الحد الأقصى لتحديد دورة(الشكل 2B). ولم يكن أداء العينات التي تزيد قيمها على 18 ct جيدا بعد التسلسل، وبالتالي فإن قيمتها المقطعية تدل على فشل عينة من برنامج تحسين الأداء. هذه العينات عموما أسفرت أيضا عن كمية أقل من الحمض النووي بعد التضخيم. وكانت العينات (000 100 خلية مدخلة) ذات القيمة المقطعية المتساوية أو الأقل من 15 عينة مثالية وكانت العينات بين 15 و18 عينة مقبولة ولكنها أقل اتساقا في تسلسل ما بعد الخلايا. بالنسبة للعينات التي تحتوي على أقل من 100,000 خلية إدخال، تم العثور على قيم Ct عادة بين 15 و 18 ولكنها لم تكن بحاجة إلى أكثر من 18 دورة لتسفر عن منتج كاف للتسلسل.
بعد تضخيم الحمض النووي، تم تنقية المكتبات واختيار حجمها للحصول على توزيع مثالي للحجم، يتراوح بين 200 إلى 1000 نقطة أساس، لتسلسل NextGen. تم الانتهاء من تقييم توزيع الحجم على كل مكتبة لأنه تم الحصول على أفضل بيانات التسلسل عندما تراوحت أكثر من 85٪ من شظايا الحمض النووي بين 200 إلى 1000 نقطة أساس(الشكل 2C). وتجدر الإشارة إلى أنه كما تم تحميل نفس الكمية من الحمض النووي (تقاس قياس كمي مضان) ، لوحظ أن العينات ذات كثافة الفلورية المنخفضة تسلسلها بشكل سيئ بشكل عام(الشكل 2C).
بعد التسلسل، تم تطبيق ضوابط الجودة القياسية على أساس المبادئ التوجيهية ENCODE ChIP-Seq5،14،15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig3.jpg"> الشكل 3: استنساخ عينات الخلايا المناعية. (أ) مسارات H3K27ac (UCSC Genome Browser، الحد الأقصى للكثافة، وظيفة التنعيم 4، كل ذلك مع محور ص بالتساوي) ل 6 متبرعين (100,000 خلية لكل تكرار) في كل نوع خلية (CD4 و MO و NK). وتظهر أربعة الجراد المثالي، اثنان مع (IL2RA مكان وPTPRC) واثنين من دون تخصيب لH3K27ac (CCR4 و MS4A1). (ب) بيرسون الارتباط بين الجهات المانحة والمؤامرات الارتباط المقابلة المتولدة باستخدام تمديد 300 نقطة أساس ونافذة 500 نقطة أساس داخل حزمة MEDIPS لكل من نوع الخلية يكرر16. (C) دمج ملفات المانحين لكل نوع الخلية التي تظهر المسارات H3K27ac (UCSC الجينوم متصفح أقصى كثافة، وظيفة تنعيم 4) في مناطق نوع الخلية (IL17R لCD4، CCR2 لمو، وKLRC1 لNK) وجين حفظ المنزل B2M، موجودة في جميع أنواع الخلايا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig3v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لمراقبة الجودة البصرية، تم إعداد مسارات تخصيب H3K27ac للعرض في متصفح الجينوم UCSC. بالنسبة لأربعة مسارات جينية، أظهرت المسارات الفردية لكل عينة جودة رسم خرائط عالية ونسبة إشارة إلى ضوضاء تعكس الاتساق العالي وقوة المقايسة لدينا(الشكل 3A). لا يتم التعبير عن اثنين من loci إلى الميناء الأيسر الجينات المعبر عنها بشكل جيد في هذه الأنواع من الخلايا، في حين أن الجينات في loci اثنين إلى اليمين وخدم كعناصر التحكم الخلفية13 (الشكل 3A). وعلاوة على ذلك، تم استخدام حزمة تحليل MEDIPS كمتغير ما بعد التسلسل لتقييم مؤشر الارتباط بين التكرارات التقنية(الشكل 3B)5،16،17، وتحديد درجة الارتباط لمستوى إثراء القراءات ل 500 سلة bp16. بالنسبة لغالبية المقارنات الثنائية، أظهرت مؤشرات ارتباطات بيرسون أكثر من 90٪ ارتباط يشير إلى مستوى عال من الاتساق بين التكرارات البيولوجية(الشكل 3B). تم دمج التكرارات ذات الارتباط المقبول لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. في حين أظهرت الخلية نوع محدد loci إثراء عالية في الخلايا المناسبة، وأظهرت جين حفظ المنزل (B2M) تعديل الهستون متسقة جدا(الشكل 3C). بالنسبة للتحليل ، فإن دمج المسارات من التكرارات سيزيد من الإثراء ، ويعزز الإشارة المحددة ، بما في ذلك القدرة الهامة الخاصة بنوع الخلية ، ويقلل من التباين بين الأفراد المتأصل في العينات البشرية5.
على الرغم من استخدام 100,000 خلية لهذه الدراسة، إلا أنه كان هناك قابلية عالية للاستنساخ لعدد قليل يصل إلى 10,000 خلية في خط الخلية التائية المثقف البشري (HUT78). أظهر تحليل الارتباط بين مجموعة بيانات ChIP-Seq التي أجريت من عينات تحتوي على أقل من 100,000 خلية قابلية عالية للاستنساخ والارتباط إلى 10,000 خلية(الشكل 4A).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig4.jpg"> الشكل 4: استنساخ عينات المدخلات المنخفضة. (أ) أمثلة على اتساق H3K27ac ChIP-Seq للخلايا 100،000 وصولا الى 10،000 في خلايا HUT-78 (خط الخلية الليمفاوية تي الخلية). المسارات (UCSC متصفح الجينوم، والحد الأقصى للكثافة، ووظيفة تنعيم 4، مع كل تحجيم على قدم المساواة Y-محور) تظهر الموضع IL4. (ب) بيرسون الارتباطات من replicates باستخدام تمديد 300 نقطة أساس ونافذة 500 نقطة أساس داخل حزمة MEDIPS16.  (C) Pearson الارتباطات بين مجموعات أرقام الخلايا المختلفة (100,000, 50,000, و 10,000 خلايا) باستخدام نفس معلمات MEDIPS كما هو الحال في (B)16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig4v2large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
أظهر تحليل ارتباط بيرسون مؤشر ارتباط مرتفع (83٪ إلى 92٪)، مما يشير إلى الحفاظ على الإشارة في عينات عدد الخلايا المنخفضة. ومع ذلك، كانت هناك خلفية متزايدة كما تم تخفيض أعداد الخلايا وكذلك إسقاط معاملات الارتباط(الشكل 4B). للحفاظ على إشارات خلفية منخفضة، تم دمج التكرارات التقنية، وتم اختبار الارتباط بين المجموعات(الشكل 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10X الخلية تثبيت المخزن المؤقت</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مركب</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>حل الفورمالديهايد</td>
			<td>11%</td>
		</tr>
<tr>
<td>ناكل</td>
			<td>100 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA، pH 8.0</td>
			<td>1 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA، مؤشر الحموضة 8.0</td>
			<td>0.5 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES، pH 7.5</td>
			<td>50 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>إكمال مخزن تحلل المؤقت</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مركب</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريس-HCI، pH 8.0</td>
			<td>50 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA، pH 8.0</td>
			<td>10 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحزب الديمقراطي الصربي</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>الصوديوم بوتيرات</td>
			<td>20 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>كوكتيل مثبطات بروتياز</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
<tr>
<td>مخزن Lysis المؤقت قصير الأجل</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مركب</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريس-HCI، pH 8.0</td>
			<td>50 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA، pH 8.0</td>
			<td>10 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>الحزب الديمقراطي الصربي</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>مزيج العلامة</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مركب</td>
			<td>التركيز النهائي</td>
		</tr>
<tr>
<td>تريس-HCI، pH 8.0</td>
			<td>10 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 مليون متر</td>
		</tr>
<tr>
<td>N,N-ثنائي ميثيلفورمايد</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>إنزيم إيلامينا للتوسم</td>
			<td>1:24 فول:vol</td>
		</tr>
<tr>
<td>CtD ميكس</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مركب</td>
			<td>لكل عينة (ميكرولتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>مؤشر نكستيرا التمهيدي A (25 ميكرومتر)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>مؤشر نكستيرا التمهيدي B (25 ميكرومتر)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>2X كابا HiFi HotStart جاهزة ميكس</td>
			<td>2.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:1000 SYBR صبغة خضراء</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>ROX صبغ السلبي</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>الماء</td>
			<td>تعبئة إلى 4 ميكرولتر</td>
		</tr>
<tr>
<td>AMP ميكس</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>مركب</td>
			<td>لكل عينة (ميكرولتر)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2X كابا HiFi HotStart جاهزة ميكس</td>
			<td>27.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>الماء</td>
			<td>تعبئة إلى 31 ميكرولتر</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول التكميلي 1: وصفات العازلة. 
الجدول التكميلي 2: سبيرمان وبيرسون عينة الارتباطات للمتبرعين 6 وكل نوع الخلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/Supplementary_Table_2.xlsx">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

تصف هذه الورقة بروتوكول ChIP-Seq شبه دقيق الحجم لمناطق الحمض النووي المرتبطة بتعديل معين لهستون (H3K27ac) باستخدام منصة معالج سائل ChIP ، يليه إعداد المكتبة باستخدام العلامة. ويشمل الإجراء تقييم الرقابة لأغراض الجودة والكمية ويمكن اعتماده لتعديلات الهستون الأخرى أو عوامل النسخ.

إجراء سيميومتوميد ChIP-Seq للدراسات اللاجينية على نطاق واسع

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

على نطاق واسع من شاشات مكتبات Metagenomic

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunostaining دفعي للكشف عن البروتين واسعة النطاق في الدماغ القرد الجامعة

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

العزلة وتوقعات بنمو كبير من الكبار الإنسان خلايا غشائي السلف تشكيل مستعمرة

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

الطفرات والتحليل الوظيفي للقنوات ايون أعربت Heterologously في خلايا الثدييات

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

اسماك الزرد نطاق واسع ، واستنادا في الجسم الحي شاشة جزيء صغير

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

استخراج الحمض النووي من مادة البارافين جزءا لا يتجزأ من التحليلات الجينية واللا جيني

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium الفحص على نطاق واسع لتطبيقات SNP التنميط الجيني

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

استراتيجية للحساسية، مقياس كبيرة الكمية الايض

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

أتمتة التجارب رقاقة وما يليها لتوليد الملامح جينية على خلايا هيلا 10،000

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...