Name: a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies
Uploaded: 2020-08-13T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

Vi takker Vijayanand lab medlemmer for teknisk hjælp og konstruktive diskussioner og Dr. Sharron Squazzo og Mr. Geoffrey Berguet fra Diagenode for teknisk bistand med sonicator og ChIP flydende-handler maskine og protokoller. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II), og S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

Det Institutionelle Revisionsnævn (IRB) under La Jolla Institute for Allergy and Immunology (LJI; IRB-protokol nr. SGE-121-0714) godkendte undersøgelsen. Raske frivillige blev rekrutteret og gav leukferfersisprøver efter skriftligt informeret samtykke.
1. Cellefiksering
<ol><li>Celleaffjedringskoncentrationen op på 1 til 2 x 106 celler/mL med komplet cellekulturmedium i et 15 mL-rør (<10 mL suspension) eller 50 mL rør (10-30 mL celler). Hvis <1 x 106 celler, skal du bruge 0,5 mL af mediet i et 1,5 mL rør.</li>
	<li>Hvirv forsigtigt celleaffjedringen, tilsæt 10x cellefikseringsbuffer dropwise (1:10; vol:vol) og drej ved en lav hastighed i 10 min ved stuetemperatur (RT).</li>
	<li>Stop reaktionen ved forsigtigt at hvirvle og tilsættes 2,5 M glycin i forholdet 1:20 (vol:vol). Inverter rørene et par gange og inkuber på is i mindst 5 minutter.</li>
	<li>Udfør de resterende trin ved 4 °C eller på is. Rørrørene drejes ved 800 x g i 5 min ved 4 °C, og supernatanten kasseres.</li>
	<li>Brug forsigtigt pelleten med 5 mL iskold 1x PBS og inkuber i 2 min på is.</li>
	<li>Gentag 1,4 og 1,5 med 1 mL iskold 1x PBS, og prøven overføres til et forkølet 1,5 mL rør (mærket til langtidsopbevaring). Hvis det er relevant, anbefales forberedelse af aliquots.</li>
	<li>Drej rørene ved 1.200 x g ved 4 °C, og fjern så meget af supernatanten som muligt uden at forstyrre cellepillen. Snap fryse pellet i flydende nitrogen. Opbevares ved -80 °C. FORSIGTIG: Tag passende beskyttelse ved håndtering af flydende nitrogen.</li>
</ol>2. Kromatin klipning
BEMÆRK: Denne protokol er optimeret til kromatin klipning af pellets med 0,3 til 3 x 106 celler i 0,65 mL lavbinding rør.
<ol><li>Prøverne fjernes med frosne cellepiller fra -80 °C, og opbevar på tøris for at undgå optøning af pelleten, før lysisbufferen tilsættes. Dette trin er kritisk.</li>
	<li>Tilsæt 70 μL frisk, RT komplet lysis buffer til pellet og holde på RT i 1 min.</li>
	<li>Brug pelleten igen i 1 min uden indførelsen af bobler, og inkuber derefter celleaffjedringen ved RT i 1 minut, før prøven lægges på is.</li>
	<li>Overfør den genophængte pille til et 0,65 mL lavt bindingsrør, og hold den på is. BEMÆRK: For at opnå reproducerbar sonikering skal sonikerikeren forvarmes ved at køre den med kun tomme rør i 3-6 cyklusser, før prøverne sonikerers.</li>
	<li>Læg prøverne i sonikerens rørholder, og fyld eventuelle huller med balancerør fyldt med 70 μL vand. Lad prøverne stå i vandbadet i ca. 1 minut, før sonikering påbegyndes.</li>
	<li>Udfør sonikering for x cykler (afhængigt af celletypen) med 16 s ON / 32 s OFF per cyklus. BEMÆRK: Dette trin vil kræve valideringseksperimenter for at bestemme det optimale antal cyklusser for effektiv sonikering.</li>
	<li>Efter hver 3 cyklusser, fjerne prøverne fra sonikeren, forsigtigt vortex og puls spin rørene, før du sætter dem tilbage i holderen. Sørg for, at der ikke er små dråber på ydersiden af røret, da det kan forårsage bobledannelse.</li>
	<li>Efter at have afsluttet de nødvendige cyklusser drejes prøverne ved >14.000 x g i 15 min ved 4 °C. Supernatanten overføres til et nyt, forkølet, lavt bindende 0,65 mL lavt bindingsrør, og hold dig på is.</li>
	<li>Decrosslink en brøkdel af de sonikerede prøver for at kontrollere for sonikering effektivitet.<ol>
<li>1-7 μL af supernatanten (svarende til ca. 250 ng forskydningskromatin) overføres til et 0,2 mL PCR-rør, og volumenet fyldes op til 10 μL med korttids lysisbuffer ved RT.</li>
		<li>Der tilsættes 1 μL RNase A, og der inkuberes i 30 min ved 37 °C ved 800 omdr./min.</li>
		<li>Inkuberes i 2 timer ved 55 °C med rysten ved 1.000 omdrejninger.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 μL af den afkoblede prøve til DNA-kvantificering ved hjælp af fluorescerende kvantificeringsanalyse10 (et spektrofotometer anbefales ikke, da sæbe og nedbrudt protein kan give bias i resultaterne).</li>
	<li>Kør den resterende prøve på en 1,2% agarosegel i 1 time ved 70 V. Plet med nukleinsyrefarvestof (1:20.000) og læs gelen ved hjælp af en UV-transilluminator.</li>
	<li>Kromatinlager aliquots til opbevaring (fortynd prøven til 25 ng/μL i 20 μL med komplet lysisbuffer). Opbevar al forskydning af kromatin ved -80 °C.</li>
</ol>3. Automatiseret ChIP-Seq for histone modifikation
BEMÆRK: Denne protokol er designet til at køre på en ChIP-væskebehandler. Selvom systemet kan bruge tilpassede buffere, leveres alle buffere med ChIP-sættet. ChIP-strimlerne med 8 rør, der anvendes i dette afsnit, er specifikke for ChIP-væskebehandleren.
<ol><li>16 prøve aliquots med 500 ng forskydning kromatin i 20 μL fra -80 °C og placere dem på is til langsomt optø kromatin. Når optøet fuldt ud, hvirvle kort og puls-spin.</li>
	<li>Fremstilling af kromatin<ol>
<li>Pipette 100 μL tC1 buffer suppleret med 1x proteasehæmmer og 20 mM natrium butyrat (komplet tC1 buffer) i to ChIP 8-rørs strimler.</li>
		<li>Der overføres 20 μL af hver kromatinprøve til et passende rør af ChIP 8-rørs strimlerne, der indeholder 100 μL komplet tC1-buffer. Kromatinrørene vaskes ved at tilsætte 80 μL komplet tC1-buffer til kromatinrørene, og overfør derefter tilbage til det relevante rør på ChIP 8-rørstrimlerne for et sidste volumen på 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fremstilling af antistoffet<ol>
<li>Mængden af antistof beregnes således, at der er 0,5 μg antistof i hvert rør. Volumen af antistof = (antal prøver x antistof pr. reaktion) / antistofkoncentration
</li>
		<li>Den beregnede mængde antistof tilsættes til 500 μL tBW1-buffer. Hurtigt vortex og puls-spin.</li>
		<li>Pipette 70 μL tBW1 i hver af de to ChIP 8-rørs strimler og tilsæt 30 μL af antistoffet + tBW1 til hvert af rørene. Dette vil bringe det samlede volumen i hvert rør til 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse af den magnetiske perle<ol>
<li>Vortex proteinet En perleopløsning grundigt. For 0,5 μg antistof, pipette 5 μL af perler i et nyt sæt ChIP 8-rør strimler og puls spin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fyld den sidste række i ChIP-væskebehandleren med mærkede, tomme ChIP-8-rørstrimler.</li>
	<li>Følg ChIP-16-IPure-200D-programspecifikationerne for placering af alle strimler i ChIP-væskebehandlermaskinen. Tilføj bufferne i den korrekte position, men brug tW4 i stedet for tE1-bufferen. BEMÆRK: Organiser dagen, så ChIP-væskebehandleren vil udføre ChIP natten over. Programmet vil køre i omkring 16 timer for 16 prøver. Dette markerer slutningen af dag 1.</li>
</ol>4. Transposase integration af bibliotekets adaptere til bibliotek forberedelse
<ol><li>Forudindstillet en termomixer til 37 °C og 500 omdr./min. Køl en magnet ned til 0,2 mL rørstrimler på is.</li>
	<li>For 16 prøver skal der forberedes 440 μL mærkningsbuffer på is. Pipette 53 μL i en enkelt ny 8-rørs strimmel og hold på is.</li>
	<li>I en ny 0,2 mL 8-rørs strimmel tilsættes 220 μL kold tC1 buffer og holdes på is. De 8 strimler rør kan holde dette volumen og stadig være udjævnet.</li>
	<li>Fjern "IP-prøverne" striprøret fra ChIP-væskebehandleren (række 12), og hætterørene, før de blinker. Fang perlerne ved hjælp af magneten til 8-rørs strimler i 2 min og fjern forsigtigt supernatanten.</li>
	<li>Overfør 25 μL af tagmentationsbufferen til perlerne med en multikanal, fjern fra magneten, og bland forsigtigt, indtil perlerne er homogene (ca. 5 gange op og ned med pipetten indstillet til 20 μL).</li>
	<li>Cap rørene og placeres i den forvarmede termomixer og inkubere i 3 min. Øget tid vil reducere effektiviteten af biblioteket forberedelse.</li>
	<li>Rørene overføres til et kølet metalstativ, og der tilsættes 100 μL kølet tC1-buffer til hver prøve. Indstil en flerkanalspipette til 80 μL, og bland prøven, indtil perlerne er homogene, og stop tagmentationsreaktionen.</li>
	<li>Sæt prøverne tilbage i ChIP-væskebehandleren, og fortsæt med vaskeproceduren Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Sørg for, at vasken udføres to gange med tC1 buffer og to gange med tW4. Elutionen skal udfyldes som markeret med programlayoutet med buffer tE1.</li>
	<li>Decrosslinking af DNA<ol>
<li>Fjern ChIP 8-rørstrimlerne i den sidste række i ChIP-væskebehandleren, og tilsæt 2 μL RNase A til hver prøve.</li>
		<li>Cap rørene, puls-spin, forsigtigt blande perlerne med en multikanal pipette, indtil blandingen er homogen, og re-cap rørene.</li>
		<li>Prøverne inkuberes i en termomixer i 30 minutter ved 37 °C og 900 omdrejninger pr. minut.</li>
		<li>Prøverne udtages fra termoblanken, og der tilsættes 2 μL proteinase K. Følg samme procedure som 4.9.2 efter tilsætning.</li>
		<li>Prøverne inkuberes i en termomixer i 4 timer ved 55 °C og 1.250 omdr./min. efterfulgt af 65 °C ved 1.000 omdr./min. BEMÆRK: Dette er slutningen af dag 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tagmented DNA-fragmenter rensning
<ol><li>Mærk seksten 1,5 mL rør med det relevante prøvenummer, og der tilsættes 400 μL DNA-bindende buffer fra DNA-oprydningssættet til hver.</li>
	<li>Fjern 8-rørs strimlerne fra termomixeren, og pulsspin strimlerne for at sikre, at fordampet produkt bevares. Placer strimler på en 8-strimmel magnet for at fange perlerne.</li>
	<li>Overfør 100 μL af decrosslinked DNA til hvert af de 1,5 mL rør. Der tilsættes 100 μL af DNA-bindingsbufferen til 8-rørstrimlerne for at vaske perlerne og derefter overføres til det relevante 1,5 mL rør.</li>
	<li>Vortex for omkring 10 s og puls-spin de 1,5 ML rør.</li>
	<li>Læg kolonnerne med de 600 μL, der indeholder DNA-bindingsbufferen og ChIP-prøven.</li>
	<li>Spin prøver for 20 s ved 10.000 x g og genindlæse kolonnen med flow-through. Drej igen med de samme betingelser og kassér gennemstrømningen.</li>
	<li>Vask kolonnerne to gange med 200 μL vaskebuffer (samme centrifugering som forrige trin) og kassér gennemstrømningen.</li>
	<li>Kolonnerne tørres ved centrifugering i 2 min ved 12.000 x g.</li>
	<li>Kolonnen overføres til et nyt opsamlingsrør på 1,5 mL, og der tilsættes 9 μL varm TE Buffer (foropvarmet til 55 °C) direkte til kolonnematrixen. Lad kolonnen inkubere i 1 minut før centrifugering i 1 min ved 10.000 x g.</li>
	<li>Elutens 9 μL overføres til et passende nyt sæt 8-rørs strimler.</li>
	<li>Udfør elutionen igen med 8 μL TE Buffer som hidtil. Elute overføres til de relevante 8-rørs strimler (sidste bind 17 μL pr. prøve) og holdes på is.</li>
</ol>6. Forstærkning og størrelsesvalg af de rensede prøver
<ol><li>Følgende trin bruger qPCR til at bestemme antallet af cyklusser, der kræves for optimal forstærkning (CtD – Ct-bestemmelse)</li>
	<li>Forbered CtD mix for alle prøver ved at multiplicere indholdet af CtD Mix Buffer med antallet af prøver.</li>
	<li>3,6 μL CtD-blanding i en qPCR-plade og tilsættes 1,4 μL af mærkede DNA-prøver (~10 % af det samlede volumen). Udfør følgende qPCR: 98 °C i 3 min, 72 °C i 5 min, 98 °C i 30 s, 26 cyklusser på 98 °C i 10 s, 63 °C i 30 s og 72 °C for 30 s.</li>
	<li>Forbered Forstærker mix for alle prøver ved at multiplicere indholdet af AMP Mix Buffer med antallet af prøver. Dispenser 14 μL mærkement DNA i separate brønde af en PCR-plade, og tilsæt derefter 2,5 μL af to sekventeringsindeks primere (25 μM) til hver prøve (det endelige reaktionsvolumen er 50 μL).</li>
	<li>Bland prøverne med multikanal pipette og udføre forstærkning program, der anvendes i CtD med det relevante antal cyklusser. BEMÆRK: Dette er et godt stoppested, da de forstærkede prøver kan opbevares ved -20 °C i et par uger. Rensningen kan dog udføres samme dag. For 48 prøver blev trin 3 - 6.5 udfyldt med to andre separate partier og derefter forstærket i et parti som beskrevet nedenfor.</li>
	<li>Udfør postforstærkning, størrelsesvalg og kvantificering af tagmenteret DNA som beskrevet nedenfor. Dette kan normalt afsluttes med 48 prøver (kan afsluttes med færre prøver som ønsket).<ol>
<li>Tilsæt 90 μL af paramagnetiske perler (1:1.8 forhold) i hver brønd, bland, og lad det inkubere på RT i 2 min.</li>
		<li>Fange perlerne ved hjælp af en plade magnet og kassere supernatant. Vask perlerne 3 gange med 200 μL frisk 80% ethanol uden at forstyrre perlepillen.</li>
		<li>Fjern overskydende ethanol med 20 μL spidser efter den endelige vask og lad perlerne tørre i 10 min, eller indtil der opstår revner i perlepillerne.</li>
		<li>Med pladen stadig på magneten tilsættes 40 μL af det forvarmede vand til hver brønd. Forsegle pladen, hvirvle grundigt, og kort puls-spin pladen.</li>
		<li>Fang perlerne ved at placere pladen tilbage på magneten og overfør 40 μL elute til en ny "prøve" Plade. Prøverne er nu renset, og de næste skridt beriger fragmenter fra 200-1.000 bp.</li>
		<li>ValgfriT QC-trin: Fjern 4 μL fra prøverne, og overfør til en QC-plade. Der tilsættes 4 μL vand tilbage til prøverne. Dette bestemmer procentdelen af store fragmenter.</li>
		<li>Der tilsættes 22 μL paramagnetiske perler (1:0,55 forhold) til prøverne, blandes omhyggeligt og inkuberes ved RT i 2 min.</li>
		<li>Placer på magnet for at fange perlerne i 5 min og overføre supernatants til kolonne 7-12 af "prøve" plade. Pladen fjernes fra magneten, og der tilsættes 30 μL perler (det endelige forhold på 1:1.3). Bland forsigtigt og lad det sidde på RT i 2 min.</li>
		<li>Fang perlerne i 5 min og derefter kassere supernatant.</li>
		<li>Alle perler vaskes 3 gange med 200 μL frisk 80 % ethanol som beskrevet tidligere (trin 6.6.2 – 6.6.3).</li>
		<li>Når pellets er tørre, elute DNA med 8 μL forvarmet TE buffer til hver brønd, mens du stadig på magneten.</li>
		<li>Fjern pladen fra magneten, tætning, og vortex grundigt. Lad pladen inkubere i 2 min ved RT, puls-spin, og læg pladen tilbage på magneten i 2 min. Supernatanten overføres til en ny plade (plade 2).</li>
		<li>For maksimal genvinding gentages elutionen med en ekstra 8 μL forvarmet TE-buffer. Læg prøverne i de relevante brønde, således at hver prøve har 16 μL af det endelige bibliotek. BEMÆRK: I slutningen af dette trin skal der være to plader (en, hvis der ikke blev afsluttet en QC-plade). QC-pladen vil have de præ-size-valgte fragmenter, og den anden plade skal have 48 brønde af det endelige bibliotek (16 μL i alt).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Kvantificer de endelige biblioteker og QC-prøver ved hjælp af en fluorescensanalyse
<ol><li>Komplet DNA kvantificering ved hjælp af en fluorescens kvantificering assay eller en lignende metode.</li>
	<li>Hvis QC kvantificeringen blev afsluttet, bestemme procentdelen af tab af prøve, der var < 1.000 bp. Der bør ikke være mere end omkring 20% tab - hvis der var mere, kunne der være et problem med de anvendte perle nøgletal.</li>
	<li>Bestem størrelsen af fragmenter af hver prøve, helst ved hjælp af en kapillær elektroforese maskine. For at beregne molarkoncentrationen skal du bruge følgende ligning: [Bibliotekskoncentration (ng/μL) * 106]/[660 * Median fragmentstørrelse (bp)]). BEMÆRK: Bibliotekerne er klar til at blive samlet (ækvimolar beløb) og sekventeret efter standard næste generation sekventering procedurer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Mapping+of+in+Vivo+Protein-DNA+Interactions.">Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Mikkelsen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+maps+of+chromatin+state+in+pluripotent+and+lineage-committed+cells.">Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells.</a> Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Seumois, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+of+primary+human+T+cells+reveals+enhancers+associated+with+TH2+memory+cell+differentiation+and+asthma+susceptibility.">Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility.</a> Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17q21+asthma-risk+variants+switch+CTCF+binding+and+regulate+IL-2+production+by+T+cells.">17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells.</a> Nature Communication. 7, 13426 (2016).</li><li>Ai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+chromatin+states+using+single-cell+itChIP-seq.">Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communication. 6, 6033 (2015).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).</li><li>Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+and+Semiautomated+Microscaled+Approach+to+Profile+Cis-Regulatory+Elements+by+Histone+Modification+ChIP-Seq+for+Large-Scale+Epigenetic+Studies.">An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies.</a> Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> Elife. 6, 21856 (2017).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Genetic+Polymorphisms+on+Human+Immune+Cell+Gene+Expression.">Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression.</a> Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drivers+of+Epigenetic+and+Transcriptional+Variation+in+Human+Immune+Cells.">Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells.</a> Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).</li><li>Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEDIPS:+genome-wide+differential+coverage+analysis+of+sequencing+data+derived+from+DNA+enrichment+experiments.">MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments.</a> Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).</li><li>Engel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate-like+functions+of+natural+killer+T+cell+subsets+result+from+highly+divergent+gene+programs.">Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoBATCH+for+High-Throughput+Single-Cell+Epigenomic+Profiling.">CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li><li>Diagenode. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+Guide+for+Chromatin+Shearing+Optimization+with+Bioruptor+Standard+and+Plus.">The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus.</a> Diagenode. , (2012).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den metode, der er beskrevet her udvider på ChIPmentation procedure11, som gennemfører en tagmentation bibliotek forberedelse protokol forud for DNA-rensning, ved at automatisere og mikroskalere protokollen. Siden chIP-Seqs begyndelse er de krævede celletal blevet reduceret drastisk fra ca. 20 millioner celler for histoner ned til hundreder og endda enkeltceller1,7,10,12,18,19,20,21. Disse nyudviklede metoder har gjort det muligt at få en dybere forståelse af, hvordan cis-reguleringsmekanismerfungerer i celler ved at øge følsomheden og give mulighed for, at sjældne kliniske cellepopulationer testes5,6,12,17. For eksempel, en af de nyere og populære procedure, kaldet CUT &TAG, som robust og følsom ChIP-Seq alternativ9. Det producerer et fremragende signal-til-støj-forhold, da Tn5-enzymet er kovalent bundet til protein A og genkender ChIP-antistoffets Fc-kæde med høj specificitet9. Baggrundsaktiviteten af Tn5-enzymet reduceres, da enzymet ikke er funktionelt, før det binder sig til målantistoffet9. Gennemførelsen af denne metode i en klinisk sammenhæng er imidlertid begrænset, da den kræver ikke-faste, levende celler. Fjernelsen af DNA-fragmenter fra hypotonkernen kan også have negative virkninger på kromatinen, når den fjernes fra under analysen. Det nødvendige krav om at arbejde med friske og levende celler er en kilde til problemer for sjældne kliniske prøver og for store kohorter af prøver, da store kohorter kan tage mange år at indsamle5. En anden type metode, drop-ChIP, elegant bruger en microfluidics enhed til at generere dråbe baseret tagmention forud for behandling af ChIP19. Det bruger dog en højt specialiseret mikrofluidisk enhed, og selvom det er muligt at fuldføre encellet ChIP-Seq, er den også begrænset til brug af levende celler7,8,9,18,19. Nyere metoder, der er afhængige af ChIP-Seq,f.eks. Disse 3D-metoder er spændende, da de identificerercis-regulatoriske eller TF medierede interaktioner på tværs af genomet og bedre forståelsen af reguleringen af genekspression i celletyper af interesse, i sundt væv og i forbindelse med sygdom.
Der er et par kritiske skridt til at overveje for protokollen at blive en succes, såsom kvaliteten af sonicated kromatin og kvaliteten af antistoffet. Klipning effektivitet er kritisk, hvis kromatin ikke er sonikeret godt, effektiviteten af analysen falder drastisk24. Sonikering er et udfordrende aspekt af ChIP-Seq på grund af de krævede cellenumre. På sonikeren, der anvendes i protokollen, effektivitet blev drastisk reduceret under 300.000 celler. Dette er et udfordrende aspekt i ChIP-Seq med hensyn til sonikering under dette niveau ville ofte kræve enzymatisk fragmentering, som er mindre upartisk. Som et resultat, sonikering er en vigtig begrænset faktor for ægte mikroskaleret ChIP-Seq. Andre sonikeringsplatforme og kommercielt tilgængelige kits blev testet til sonikering af kromatin, men sonikeren, der blev brugt her, havde de mest robuste og reproducerbare resultater. En anden fordel ved sonikeren er ikke at skulle købe specialiserede rør til at køre sonikering, hvilket reducerer omkostningerne, når der beskæftiger sig med et stort antal prøver. For optimal sonikering er det for det første vigtigt at forvarme sonikeren som beskrevet ovenfor. For det andet anbefales det at få pipettespidsen til at røre bunden af røret, mens den lyser for at bryde cellerne op med flere fysiske begrænsninger. For det tredje hindrer enhver bobledannelse før sonikering prøvens evne til at blive sonikeret jævnt. Hvis der dannes bobler under lysis, er det vigtigt at fjerne dem med en pipette. Dette kan være udfordrende uden at fjerne en masse prøve, men hvis spidsen presses let mod boblen, kan den langsomt trækkes op uden tab af meget prøve. Endelig, når du bestemmer antallet af cyklusser, fuldføre et tidsinterval, hvor hver tredje cyklusser, prøven fjernes, renses, og løb på en agarose gel. Undgå over/under sonikering af prøver, da dette reducerer ChIP-effektiviteten. Hvis prøven er under sonikeret, kan de store fragmenter have en negativ effekt på ChIP-Seq kvalitet24. På den anden side, hvis prøven er over sonicated, er der risiko for, at mål epitopen går tabt i processen.
En anden væsentlig del af ChIP-Seq er kvaliteten af antistoffet. Før du kører en storstilet undersøgelse, er det nødvendigt at optimere det antistof, der vil blive brugt. Målet er at opnå et betydeligt højt signal til støjforhold for kendte regioner i genomet, og et andet er reproducerbarheden. Hvis antistoffet trækker en masse baggrundssignal, kan det anbefales at bruge en større indgang eller prøve et andet parti / leverandør. Dette vil tilføje tid, før du starter et stort eksperiment, men det er et vigtigt skridt. For at teste for signal-til-støj anbefales det at bruge qPCR med regioner, der vides at være et mål for dit antistof, og en anden region, der vides at være fraværende. Det er blevet bemærket histone ændringer er mere robuste og lettere at optimere end TFs.
Protokollen beskrevet ovenfor giver en robust metode til høj-throughput histone-modifikation ChIP-Seq i en semiautonom, mikroskaleret måde. Metoden begrænser mængden af hands-on tid og øger reproducerbarheden over manuel ChIP-Seq. Tidligere undersøgelser afsluttet i laboratoriet anvendes manuel ChIP på tekniske replikater og opnåede en Spearman korrelation gennemsnit på 0,505, men med semiautomated system, Spearman korrelation mellem forskellige donorer med en NK celler gennemsnit på 0,66 (Supplerende tabel 2). Dette blev også afsluttet med omkring 40% mindre hands-on tid. Den metode, der er beskrevet her, er blevet optimeret til histone-ændringer (H3K27ac vist her, men protokollen bør ikke have brug for nogen ændring for andre) og ville kun kræve mindre ændringer for at blive gennemført for TF ChIP-Seq. På trods af kvaliteten af antistoffet, den vigtigste ændring ville være for sonikering tid og potentielt de buffere, der anvendes i løbet af IP. Normalt, for TF ChIP assays, metoden kan fungere bedre med lidt længere fragmenter af kromatin (med en rækkevidde på omkring 350-800 bp) som TF: DNA-komplekser er sandsynligvis mindre i stand til at blive opretholdt gennem streng sonikering6. Bufferne skal muligvis også skiftes til en brugerdefineret blanding eller andre tilgængelige sæt til branche, da TF'er kan opføre sig anderledes end histoneændringer.
Selvom den automatiserede ChIP-væskebehandler blev testet for så få som 10.000 celler, var der et mærkbart fald i reproducerbarhed ved lavere kromatinkoncentrationer. På grund af dette blev protokollen ikke anbefalet til mindre end 10.000 celler, hvor 100.000 celler var de optimale forhold. Protokollen blev også afsluttet ved hjælp af industrien ChIP buffere, som var en ekstra udgift, men forudsat højere kvalitet data. Protokollen kan ændres med hensyn til sonikeringsbetingelserne (så længe den forskydningskromatin holdes inden for samme interval), kan buffere tilpasses til immunprecipitationen (IP; optimering kan være påkrævet), eller ChIP-væskebehandleren må ikke anvendes. En begrænsning af protokollen er brugen af ChIP liquid-handler, som kan være en dyr investering og kan kun køre 16 prøver på én gang. ChIP-væskebehandleren er begrænset til små reaktioner, og celletal på over en million anbefales ikke. Protokollen kan dog fuldføres uden den ved at fuldføre IP- og vasketrinnene manuelt. Hvis IP og vasker blev afsluttet i hånden, vil tiden til at fuldføre analysen stige, og reproducerbarheden kan falde, men denne vejledning vil stadig være nyttig ved at køre et ChIP-Seq-eksperiment af høj kvalitet. Bemærk, at andre væskebehandlere kunne tilpasses til at køre halvautomatiske ChIP-reaktioner.
Sammenfattende er de største fordele ved dette system den høje gennemløbskarakter, da IP- og vasketrinene er afsluttet autonomt. Som sådan kan sekventielle runder af ChIP-eksperimenter afsluttes, så op til 48 prøver kan behandles fuldt ud og klar til sekventering om 5 dage med begrænset hands-on tid sammenlignet med manuelle ChIP-Seq-eksperimenter. En anden fordel er den øgede reproducerbarhed, da ChIP-Seq kan være vanskeligt at opnå meget reproducerbare resultater. Andre metoder kræver enten levende celler, komplekse mikro-pipetter systemer, eller det arbejde, der skal udfyldes alle i hånden. Dette system skal optimeres til lav-input prøver (<10.000 celler), i sidste ende tillader encellede ChIP reaktioner. Systemet er også i stand til at blive tilpasset de nyere ChIP-metoder, såsom PLAC-Seq og HiChIP22,23.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Pandurangan Vijayanad
to:
Pandurangan Vijayanand

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.

Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Sara Herrera-da&#160;la Mata
to:
Sara Herrera-de la Mata

Den brede anvendelse af ChIP-Seq-analyser til bestemmelse af DNA-fragmenter, der er forbundet med specifikke histonemodifikationer, skyldes til dels dets evne til at identificere cis-regulatoriske DNA-elementer, herunder aktive smagsforstærkere, initiativtagere, lyddæmpere, heterochromatin og andre1,2,3,4. Identifikation af ikke-kodende reguleringsområder på tværs af genomet har vist værdifuld indsigt for bedre at forstå genregulering inden for sundhed og sygdomme4. Tidligere arbejde fra laboratoriet har brugt ChIP-Seq til at vise, at cis-regulatoriske elementer kan spille vigtige roller i forskellige celletyper5. Transskription faktor (TF) ChIP assays er blevet udnyttet til at vise sygdom forbundet risiko enkelt-nukleotid polymorfier6.
Brugen af ChIP-Seq med kliniske prøver fra mennesker er udfordrende, primært på grund af begrænsningen af cellenumre eller den ønskede vævsprøve. Som følge heraf har der været en samordnet indsats på området for at forbedre og mikroskalaere disse teknikker, og som følge heraf er der opstået flere analyser, såsom CUT &TAG5,7,8,9,10,11,12. Denne analyse anvender en transposase til mærkning og isolere genomiske regioner bundet af et bestemt antistof9. Denne teknik har været i stand til at reducere cellenumrene ned til 1.000 s og i nogle tilfælde til en enkelt celle, men brugen af denne teknik i translationel forskning og klinisk set-up har vist begrænsninger på grund af kravene til brug af levende celler til denne metode9,12. Kravet om levende celler gør kliniske prøver logistisk vanskelige at håndtere og kan indføre batcheffekter, hvis prøverne ikke behandles på samme tid. Andre har optimeret mikroskalerede teknikker til formaldehyd-faste celler, herunder udviklingen af ChIPmentation11, som er tilpasset her i en høj-throughput måde. Brugen af faste celler gør det muligt at opbevare prøver indtil indsamling og efterfølgende behandling af alle prøver sammen for at minimere batcheffekter.
Her er en semiautomated mikroskaleret ChIP-Seq assay beskrevet, som reducerer eksperimentelle hands-on tid til at profilere histone modifikationer10. Den halvautomatiserede metode giver mulighed for chIP-Seq-analyser med høj gennemløb, hvilket giver mulighed for, at op til 48 prøver kan behandles fuldt ud og er klar til sekventering på så lidt som 5 dage, for så få som 10.000 celler pr. prøve ved hjælp af en ChIP-væskebehandler. Behandleren fuldender immunprecipitation (IP) og efterfølgende vasker på en autonom måde, hvilket hjælper med at reducere variationen mellem prøverne. Den halvautomatiserede metode sænker både hands-on tid med over 15 timer for 48 prøver og den tekniske variation, hvilket gør det muligt at udføres store epigenetiske undersøgelser på en reproducerbar og hurtig måde for enten primære eller kultiverede celler. Protokollen forklarer processen fra start til slut for høj kvalitet ChIP-Seq. Hvis de specifikke maskiner ikke er tilgængelige, vil protokollen stadig være en nyttig ressource til at konfigurere og problemfrit skyde ChIP-Seq eksperimenter manuelt.
Analysen blev udført med tre forskellige primære humane immuncelletyper og en kultiveret cellelinje (HUT78 – ATCC: TIB-161). For klarhedens skyld er protokollen opdelt i syv sektioner: cellefiksering, kromatin klipning via sonikering, automatiseret kromatinimtur, biblioteksforberedelse ved DNA-fragmentmærkning, biblioteksforstærkning, biblioteksrensning efterfulgt af DNA-kvantificering. For bufferopskrifter henvises til supplerende tabel 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="950">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">200 &#181;l tube strips (8 tubes/strip) + cap strips</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020002</td>
			<td style="width:288px;">Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">AMPure XP for PCR Purification</td>
			<td style="width:127px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>SPRI beads</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td>0.65 mL low binding tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Bioruptor Pico Sonicator</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B01060010</td>
			<td>Sonicator used in the lab but others can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ChIP DNA Clean &#38; Concentrator (Capped Columns)</td>
			<td style="width:127px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D5205</td>
			<td>DNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA pH 8.0</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Glycine</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">50046-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">H3K27ac polyclonal antibody - Premium</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15410196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES (1 M) pH 7.5</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20027213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20034197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IP-Star Compact Automated System</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B03000002</td>
			<td>Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">KK2601</td>
			<td>PCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">R0971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4551-250ML</td>
			<td>CAUTION - low flash point</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (5 M), RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-4700</td>
			<td style="width:288px;">8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PureLink RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td>Used in the flourescence quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">4485699</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ROX Reference Dye</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12223012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">303410-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td>nucleic acid dye</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Tips (bulk)</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30040020</td>
			<td>Tips for the IP Star</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">True MicroChIP Kit</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C01010130</td>
			<td>Contains all the buffers for the IP; ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies

Chromatin immunprecipitation efterfulgt af sekventering (ChIP-Seq) er en kraftfuld og udbredt tilgang til profilkromatin DNA forbundet med specifikke histone modifikationer, såsom H3K27ac, for at hjælpe med at identificere cis-regulatoriske DNA-elementer. Den manuelle proces til at fuldføre en ChIP-Seq er arbejdskrævende, teknisk udfordrende og kræver ofte store cellenumre (> 100.000 celler). Den metode, der er beskrevet her, hjælper med at overvinde disse udfordringer. En komplet semiautomatisk, mikroskaleret H3K27ac ChIP-Seq procedure, herunder cellefiksering, kromatin klipning, immunprecipitation, og sekventering bibliotek forberedelse, for batch af 48 prøver for celle nummer indgange mindre end 100.000 celler er beskrevet i detaljer. Den semiautonome platform reducerer teknisk variation, forbedrer signal-til-støj-forholdet og reducerer arbejdskraften drastisk. Systemet kan derved reducere omkostningerne ved at give mulighed for reducerede reaktionsmængder, hvilket begrænser antallet af dyre reagenser som enzymer, magnetiske perler, antistoffer og hands-on tid, der kræves. Disse forbedringer af ChIP-Seq-metoden passer perfekt til store epigenetiske undersøgelser af kliniske prøver med begrænsede celletal på en meget reproducerbar måde.

Som proof of concept blev ChIP-Seq afsluttet for seks menneskelige donorer med tre sæt immuncelletyper: naive CD4 T-celler (CD4), klassiske monocytter (MO) og naturlige dræberceller (NK), beriget med FACS sortering som beskrevet før13. Den understregede procedure består af ni forskellige procedurer som repræsenteret i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig1.jpg"> Figur 1: Generelt rutediagram for proceduren. (A) En tegneserie af den samlede procedure (genereret i BioRender). (B) Rutediagram for alle de vigtigste trin for protokollen og den anslåede praktiske og samlede tid, der er knyttet til hver dag. Rækkefølgen kan ske i slutningen af dag 5 eller senere med flere runder. Tidslinjen kan også forskuds i løbet af ugen, hvor sekventiel dag 3-4 kan afsluttes flere gange på en uge for at generere 48 ChIP-prøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Efter celleisolation ved flowcytometri13, sorterede celler blev centrifugeret og celler fast og opbevaret som beskrevet ovenfor. Når alle prøverne var indsamlet, blev prøverne lyset og forberedt til kromatisk klipning i partier på 12 som beskrevet ovenfor. For hver prøve blev antallet af cyklusser for at nå optimal sonikering afsluttet10. Kvantitativ måling samt forskydning af kromatinfragmentstørrelsesmålinger viste stor reproducerbarhed af vores metode på de tre sæt immunceller (Figur 2A). De forskellige humane immunceller blev sonikeret i separate partier og gav meget konsekvent med > 70% af prøven mellem 100 - 500 bp for 14 cyklusser (16 s ON, 32 s OFF per cyklus). På dette tidspunkt blev prøver med store fragmenter efter sonikering (< 70% af prøven mellem 100 - 500 bp) betragtet som mislykkede. Disse prøver kunne enten sonikeres til 1-2 yderligere cyklusser eller blev kasseret og erstattet senere med celler fra en anden pellet. Vores metode viste ingen af prøverne krævede mere sonikering eller blev elimineret, hvilket tyder på absolut robusthed af proceduren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig2.jpg"> Figur 2: For sekventering af QC-eksempler. (A) 1,2% agarosegeler viser reproducerbarhed af sonikering. Sonikering prøver for 6 donorer i tre celletyper: naive CD4 T-celler (CD4), Klassiske monocytter (MO), og Naturlige dræberceller (NK). Prøverne blev sonikeret i 14 cyklusser (16 s ON, 32 s OFF per cyklus). For hver prøve blev ca. 200 ng af decrosslinked kromatin læsset på en 1% agarose gel. Prøverne blev anset for at være gode, hvis mere end 70 % af fragmenterne ligger inden for 100-500 bp. (B) Top - Analyse qPCR forstærkningskurver for at bestemme det optimale antal cyklusser til forstærkning (Ct, hvor der er 1/2 den maksimale intensitet). De ideelle prøver har en Ct på omkring 15 og forstærkning kan afsluttes op til 2 cyklus mere af den målte Ct. Pilen er et eksempel på et dårligt eksempel, hvor Ct er større end 18. Nederst - Et eksempel på et dårligt sæt prøver er vist, som har en Ct større end 18. Disse prøver viste også lavere fluorescensintensitet. (C) Venstre - Fragment analysator elektroforese spor viste fordelingen af endelige mærkede biblioteker efter forstærkning og størrelse-udvælgelse. Prøver med mere end 85 % af fragmentbiblioteket ligger inden for 200-1 000 bp blev betragtet som gode prøver. Måling af fluorescensens spidsbelastningsintensitet betragtes også som en vigtig QC-parameter, ja, hvis signalet er lavt, er det usandsynligt, at prøven sekvenserer godt. Højre - Eksempler på positive prøver i CD4, MO og NK vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Efter kvantificeringen blev prøverne kørt på en ChIP-væskebehandler med H3K27ac-antistoffer efterfulgt af mærkning med Tn5-transposaseenzym. For at bestemme det passende antal forstærkningscyklusser ved qPCR blev der anvendt 10 % af de mærkede prøver. Ved bestemmelse af antallet af cyklusser til forstærkning af prøverne finder vi den cyklus, hvor prøvens intensitet er halvdelen af det gennemsnitlige maksimum for cyklusbestemmelse (figur 2B). Prøver med Ct-værdier på mere end 18 klarede sig ikke godt efter sekvensering, og deres Ct-værdi var således tegn på en mislykket ChIP-prøve. Disse prøver gav generelt også en lavere mængde DNA efter forstærkning. Prøver (100.000 celler input) med en Ct-værdi svarende eller mindre end 15 var ideelle og prøver mellem 15 og 18 var acceptable, men mindre konsekvente post sekventering. For prøver med mindre end 100.000 inputceller blev Ct-værdierne normalt fundet mellem 15 og 18, men behøvede ikke mere end 18 cyklusser for at give nok produkt til sekventering.
Efter DNA-tagmenteret forstærkning blev biblioteker renset og størrelsesvalgt for at opnå en ideel størrelsesfordeling, der spænder fra 200 til 1.000 bp, til NextGen-sekventering. Størrelsesfordelingsvurderingen på hvert af bibliotekerne blev afsluttet, fordi der blev indhentet de bedste sekventeringsdata, når mere end 85 % af DNA-fragmenterne varierede mellem 200 og 1 000 bp (Figur 2C). Da den samme mængde DNA (målt ved fluorescenskvantificering) blev indlæst, blev det bemærket, at prøverne med lavere fluorescensintensitet generelt blev sekventeret dårligt (Figur 2C).
Efter rækkefølge blev der anvendt standardkvalitetskontrol baseret på retningslinjerne for ENCODE ChIP-Seq5,14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig3.jpg"> Figur 3: Reproducerbarheden af immuncelleprøverne. (A) H3K27ac spor (UCSC Genome Browser, maksimal intensitet, udjævning funktion af 4, alle med lige skaleret Y-akse) for 6 donorer (100.000 celler pr replika) i hver celletype (CD4, MO, og NK). Fire eksemplariske loci er vist, to med (IL2RA locus og PTPRC) og to uden berigelse for H3K27ac (CCR4 og MS4A1). (B) Pearson korrelation mellem donorer og tilsvarende korrelation plots genereret ved hjælp af en 300 bp udvidelse og 500 bp vindue i MEDIPS pakke for hver af celletypen replikerer16. (C) Flettede donorfiler for hver celletype, der viser H3K27ac-spor (UCSC Genome Browser maksimal intensitet, udjævningsfunktion på 4) i celletypespecifikke områder (IL17R for CD4, CCR2 for MO og KLRC1 for NK) og husholdegen B2M, der findes i alle celletyper. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Til visuel kvalitetskontrol blev H3K27ac-berigelsesspor til visning i UCSC-genombrowseren forberedt. For fire gen loci, individuelle spor for hver prøve viste høj kortlægning kvalitet og signal-til-støj-forhold afspejler den høje konsistens og robusthed af vores analyse (Figur 3A). De to loci til venstre havn vel udtrykte gener i disse celletyper, mens generne i de to loci til højre ikke udtrykkes og tjenes som baggrundskontrol13 (Figur 3A). Desuden blev MEDIPS-analysepakken brugt som variabel efter rækkefølge til at vurdere korrelationsindekset mellem tekniske replikker (Figur 3B)5,16,17, der angiver graden af korrelation for aflæsninger af berigningsniveau for 500 bp bins16. For de fleste af de parvise sammenligninger viste Pearson korrelationsindekser mere end 90% korrelation, hvilket tyder på høj grad af konsistens mellem de biologiske replikater (Figur 3B). Replikerer med acceptabel korrelation blev slået sammen for at øge signal-til-støj-forholdet. Mens celletypespecifik loci viste høj berigelse i de relevante celler, viste et husholdegen (B2M) meget konsekvent histonemodifikation (Figur 3C). Til analysen vil sammenlægning af spor fra replikaer øge berigelsen, styrke det specifikke signal, herunder for vigtige celletypespecifikke smagsforstærkere, og reducerer den inter-individuelle variation, der er forbundet med menneskelige prøver5.
Selv om 100.000 celler blev brugt til denne undersøgelse, var der høj reproducerbarhed for så få som 10.000 celler i en menneskelig kultiveret T-celle linje (HUT78). Korrelationsanalyse mellem ChIP-Seq-datasæt udført ud fra prøver med mindre end 100.000 celler viste høj reproducerbarhed og korrelation ned til 10.000 celler (Figur 4A).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig4.jpg"> Figur 4: Reproducerbarhed af lavinputprøver. (A) Eksempler på konsistensen af H3K27ac ChIP-Seq for celler 100.000 ned til 10.000 i HUT-78-celler (en T-celle lymfomcellelinje). Sporene (UCSC Genome Browser, maksimal intensitet, udjævning funktion af 4, alle med lige så skaleret Y-akse) viser IL4 græshoppe. (B) Pearson korrelationer af replikaer ved hjælp af en 300 bp udvidelse og 500 bp vindue i MEDIPS pakke16.  (C) Pearson korrelationer mellem de forskellige celletal grupper (100.000, 50.000, og 10.000 celler) ved hjælp af de samme MEDIPS parametre som i (B)16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Pearson korrelation analyse viste høj korrelation indeks (83% til 92%), tyder på vedligeholdelse af signal i lav celle antal prøver. Der var dog øget baggrund, da celletallene blev reduceret, samt et fald i korrelationskoefficienterne (Figur 4B). For at opretholde lave baggrundssignaler blev tekniske dubletter slået sammen, og korrelationen blev testet mellem grupper (Figur 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10x cellefikseringsbuffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Forbindelse</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Formaldehydopløsning</td>
			<td>11%</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA, pH 8.0</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES, pH 7,5</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Komplet Lysis Buffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Forbindelse</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium Butyrat</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protease hæmmer Cocktail</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kortsigtet Lysis-buffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Forbindelse</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8.0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tagmentation Mix</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Forbindelse</td>
			<td>Endelig koncentration</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>N,N-dimethylformamid</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Illumina tagmentation enzym</td>
			<td>1:24 vol:vol</td>
		</tr>
<tr>
<td>CtD Mix</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Forbindelse</td>
			<td>Pr. prøve (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Index Primer A (25 μM)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Index Primer B (25 μM)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x KAPA HiFi HotStart Klar blanding</td>
			<td>2.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:1000 SYBR Grøn farvestof</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>ROX passiv farvestof</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vand</td>
			<td>Fyld til 4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>AMP Mix</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Forbindelse</td>
			<td>Pr. prøve (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2x KAPA HiFi HotStart Klar blanding</td>
			<td>27.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vand</td>
			<td>Fyld til 31 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Supplerende tabel 1: Bufferopskrifter. 
Supplerende tabel 2: Spearman og Pearson prøve korrelationer for de 6 donorer og hver celletype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/Supplementary_Table_2.xlsx">Klik her for at downloade denne tabel.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Dette papir beskriver en halvautomatisk, mikroskaleret ChIP-Seq protokol af DNA-områder forbundet med en bestemt histone ændring (H3K27ac) ved hjælp af en ChIP væske-handler platform, efterfulgt af bibliotek forberedelse ved hjælp af tagmentation. Proceduren omfatter kontrolvurdering med henblik på kvalitet og kvantitet og kan anvendes til andre histoneændringer eller transskriptionsfaktorer.

En halvautomatisk ChIP-Seq-procedure for store epigenetiske studier

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generering af høj kvalitet Chromatin Immunoprecipitation DNA Skabelon til High-throughput sekventering (Chip-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Assay for Storstilet SNP Genotypebestemmelse Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi for følsomme, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Automatisering chip-seq Forsøg at generere Epigenetisk Profilerne 10.000 HeLa-celler

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...