Name: a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies
Uploaded: 2020-08-13T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

Vi takker Vijayanand lab medlemmer for teknisk hjelp og konstruktive diskusjoner og Dr. Sharron Squazzo og Mr. Geoffrey Berguet fra Diagenode for teknisk assistanse med sonicator og ChIP væske-handler maskin og protokoller. Dette arbeidet ble støttet av NIH grants AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) og S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

Institusjonell review board (IRB) ved La Jolla Institute for Allergy and Immunology (LJI; IRB-protokollnr. SGE-121-0714) godkjente studien. Friske frivillige ble rekruttert og ga leukafereseprøver etter skriftlig informert samtykke.
1. Cellefiksering
<ol><li>Bring celleopphengskonsentrasjonen til 1 til 2 x10 6 celler / ml med komplett cellekulturmedium i et 15 ml rør (<10 ml suspensjon) eller 50 ml rør (10-30 ml celler). Hvis < 1 x 106 celler, bruk 0,5 ml av mediet i et 1,5 ml rør.</li>
	<li>Virvel celleopphenget forsiktig, tilsett 10x cellefikseringsbuffer dropwise (1:10; vol:vol) og roter med lav hastighet i 10 minutter ved romtemperatur (RT).</li>
	<li>Stopp reaksjonen ved å forsiktig virvelere og tilsett 2,5 M glycin i forholdet 1:20 (vol:vol). Snu rørene et par ganger og inkuber på is i minst 5 min.</li>
	<li>Utfør de resterende trinnene ved 4 °C eller på is. Snurr rørene på 800 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.</li>
	<li>Resuspend pellet forsiktig med 5 ml iskald 1x PBS og inkubere i 2 min på is.</li>
	<li>Gjenta 1,4 og 1,5 med 1 ml iskald 1x PBS og overfør prøven til et forhåndskjølt 1,5 ml rør (merket for langvarig lagring). Hvis det er aktuelt, anbefales forberedelse av aliquots.</li>
	<li>Snurr rørene ved 1200 x g ved 4 °C og fjern så mye av supernatanten som mulig uten å forstyrre cellepelleten. Trykk på frys pelletsen i flytende nitrogen. Oppbevars ved -80 °C. FORSIKTIG: Ta passende beskyttelse ved håndtering av flytende nitrogen.</li>
</ol>2. Kromatinskjæring
MERK: Denne protokollen er optimalisert for kromatinskjæring av pellets med 0,3 til 3 x 106 celler i 0,65 ml lavbindingsrør.
<ol><li>Fjern prøverøret med frosne cellepellets fra -80 °C og oppbevar på tørris for å unngå opptining av pellets før du tilsetter lysisbufferen. Dette trinnet er kritisk.</li>
	<li>Tilsett 70 μL fersk, RT komplett lysisbuffer til pelletsen og hold den på RT i 1 min.</li>
	<li>Resuspend pellet i 1 min uten innføring av noen bobler og deretter inkubere celle suspensjon på RT i 1 min før du legger prøven på is.</li>
	<li>Overfør den resuspenderte pellet til et 0,65 ml lavt bindingsrør og hold på is. MERK: For å oppnå reproduserbar sonikering, forvarm sonikeren ved å kjøre den med bare blanke rør i 3-6 sykluser før du sonikerer prøvene.</li>
	<li>Plasser prøvene i rørholderen på lydskriveren og fyll eventuelle hull med balanserør fylt med 70 μL vann. La prøvene stå i vannbadet i ca. 1 min før du starter sonikeringen.</li>
	<li>Utfør sonikering for x sykluser (avhengig av celletype) med 16 s PÅ / 32 s AV per syklus. MERK: Dette trinnet krever valideringseksperimenter for å bestemme det optimale antallet sykluser for effektiv sonikering.</li>
	<li>Etter hver 3 sykluser, fjern prøvene fra sonikeren, forsiktig virvel og puls spinn rørene før du setter dem tilbake i holderen. Forsikre deg om at det ikke er små dråper på utsiden av røret, da det kan forårsake bobledannelse.</li>
	<li>Etter å ha fullført de nødvendige syklusene, spinnprøver ved > 14,000 x g i 15 min ved 4 °C. Overfør supernatanten til et nytt, forhåndskjølt, lavbindings 0,65 ml lavt bindingsrør og hold på is.</li>
	<li>Decrosslink en brøkdel av de sonikerte prøvene for å se etter sonikeringseffektiviteten.<ol>
<li>Overfør 1-7 μL av supernatanten (tilsvarende ca. 250 ng skjæret kromatin) til et 0,2 ml PCR-rør og gjør volumet opp til 10 μL med kortsiktig lysisbuffer ved RT.</li>
		<li>Tilsett 1 μL RNase A og inkuber i 30 min ved 37 °C ved 800 o/min, og tilsett deretter 1 μL proteinase K.</li>
		<li>Inkuber i 2 timer ved 55 °C med risting ved 1000 o/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fjern 2 μL av den decrosslinked prøven for DNA-kvantifisering ved hjelp av fluorescerende kvantifiseringsanalyse10 (et spektrofotometer anbefales ikke, da såpe og degradert protein kan gi skjevheter i resultatene).</li>
	<li>Kjør den gjenværende prøven på en 1,2% agarose gel i 1 t ved 70 V. Flekk med nukleinsyrefargestoff (1:20,000) og les gelen ved hjelp av en UV-transilluminator.</li>
	<li>Forbered kromatin lager aliquots for lagring (fortynn prøven til 25 ng / μL i 20 μL med fullstendig lysisbuffer). Oppbevar alt kuttet kromatin ved -80 °C.</li>
</ol>3. Automatisert ChIP-Seq for histone modifikasjon
MERK: Denne protokollen er utformet for å kjøre på en ChIP væskebehandler. Selv om systemet kan bruke tilpassede buffere, følger alle buffere med ChIP-pakken. ChIP-stripene med 8 rør som brukes i denne delen er spesifikke for ChIP væskebehandler.
<ol><li>Overfør 16 prøve aliquots med 500 ng skjæret kromatin i 20 μL fra -80 °C og legg dem på is for sakte å tine kromatin. Når den er tint helt, virvel kort og puls-spinn.</li>
	<li>Fremstilling av kromatin<ol>
<li>Pipette 100 μL tC1 buffer supplert med 1x proteasehemmer og 20 mM natriumsneigrat (komplett tC1-buffer) i to ChIP 8-rørs strimler.</li>
		<li>Overfør 20 μL av hver kromatinprøve til et passende rør av ChIP 8-rørstrimlene som inneholder 100 μL komplett tC1-buffer. Vask kromatinrørene ved å legge til 80 μL komplett tC1-buffer til kromatinrørene og overfør deretter tilbake til riktig rør på ChIP 8-rørstrimlene for et sluttvolum på 200 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fremstilling av antistoffet<ol>
<li>Beregn volumet av antistoff slik at 0,5 μg antistoff er i hvert rør. Volum av antistoff = (antall prøver x antistoff per reaksjon) / antistoffkonsentrasjon
</li>
		<li>Tilsett beregnet mengde antistoff i 500 μL tBW1 buffer. Raskt virvel og puls-spinn.</li>
		<li>Pipette 70 μL tBW1 inn i hver av de to ChIP 8-rørstrimlene og tilsett 30 μL av antistoffet + tBW1 til hvert av rørene. Dette vil bringe det totale volumet i hvert av rørene til 100 μL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberedelse av den magnetiske perlen<ol>
<li>Virvel proteinet En perleoppløsning grundig. For 0,5 μg antistoff, pipette 5 μL perler inn i et nytt sett med ChIP 8-rørs strimler og pulsspinn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fyll den siste raden i ChIP væskehåndtereren med merkede, tomme ChIP 8-rørs strimler.</li>
	<li>Følg programspesifikasjonene for ChIP-16-IPure-200D for plassering av alle stripene i ChIP-væskehåndtereren. Legg til bufferne i riktig posisjon, men bruk tW4 i stedet for tE1-buffer. MERK: Organiser dagen slik at ChIP væskebehandleren vil utføre ChIP over natten. Programmet vil kjøre i ca 16 timer for 16 prøver. Dette markerer slutten på dag 1.</li>
</ol>4. Transposase integrasjon av bibliotekadaptere for biblioteksforberedelse
<ol><li>Sett en thermomixer til 37 °C og 500 o/min. Avkjøl en magnet for 0,2 ml rørstrimler på is.</li>
	<li>For 16 prøver, lag 440 μL tagmenteringsbuffer på is. Pipette 53 μL inn i en enkelt ny 8-rørs stripe og hold på is.</li>
	<li>I en ny 0,2 ml 8-rørs stripe, tilsett 220 μL kald tC1 buffer og hold på is. De 8 striperørene kan holde dette volumet og fortsatt være avkortet.</li>
	<li>Fjern "IP-prøver" stripperøret fra ChIP væskehåndterermaskinen (rad 12) og hette rørene før pulsspinnende. Ta perlene ved hjelp av magneten for 8-rørs strimler i 2 minutter og fjern forsiktig supernatanten.</li>
	<li>Overfør 25 μL av tagmenteringsbufferen til perlene med en flerkanals, fjern fra magneten, og bland forsiktig til perlene er homogene (ca. 5 ganger opp og ned med pipetten satt til 20 μL).</li>
	<li>Hette rørene og plasser dem i den forvarmede termomikseren og inkuber i 3 minutter. Å øke tiden vil redusere effektiviteten til bibliotekforberedelsene.</li>
	<li>Overfør rørene til et kjølt metallstativ og tilsett 100 μL kjølt tC1-buffer til hver prøve. Sett en flerkanals pipette til 80 μL og bland prøven til perlene er homogene, og stopp tagmenteringsreaksjonen.</li>
	<li>Sett prøvene tilbake i ChIP væskehåndtereren og fortsett med vaskeprosedyren Washing_for_IP-reacts_16_Ipure. Sørg for at vasken utføres to ganger med tC1 buffer og to ganger med tW4. Elutionen skal fullføres som merket av programoppsettet, med buffer tE1.</li>
	<li>Decrosslinking av DNA<ol>
<li>Fjern ChIP 8-rørstrimlene i den siste raden av ChIP væskebehandler og tilsett 2 μL RNase A i hver prøve.</li>
		<li>Cap rørene, puls-spinn, bland forsiktig perlene med en flerkanals pipette til blandingen er homogen, og hette rørene på nytt.</li>
		<li>Inkuber prøvene i en thermomixer i 30 minutter ved 37 °C og 900 o/min.</li>
		<li>Fjern prøvene fra termomixeren, tilsett 2 μL Proteinase K. Følg samme prosedyre som 4.9.2 etter tilsetningen.</li>
		<li>Inkuber prøvene i en thermomixer i 4 timer ved 55 °C og 1250 o/min, etterfulgt av 65 °C ved 1000 o/min over natten. MERK: Dette er slutten på dag 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Tagmentert DNA fragmenter rensing
<ol><li>Merk seksten 1,5 ml rør med riktig prøvenummer og tilsett 400 μL DNA-bindingsbuffer fra DNA-oppryddingssettet til hver.</li>
	<li>Fjern 8-rørsstrimlene fra thermomixeren og puls-spinn strimlene for å sikre at ethvert fordampet produkt beholdes. Plasser strimler på en 8-stripe magnet for å fange perlene.</li>
	<li>Overfør 100 μL decrosslinked DNA til hvert av de 1,5 ml rørene. Tilsett 100 μL av DNA-bindingsbufferen til 8-rørsstrimlene for å vaske perlene og deretter overføre til riktig 1,5 ml rør.</li>
	<li>Virvel i ca 10 s og puls-spinn 1,5 ml rør.</li>
	<li>Last kolonnene med 600 μL som inneholder DNA-bindingsbufferen og ChIP-prøven.</li>
	<li>Spinn prøver for 20 s ved 10,000 x g og last kolonnen på nytt med gjennomstrømningen. Snurr igjen med de samme forholdene og kast gjennomstrømningen.</li>
	<li>Vask kolonnene to ganger med 200 μL vaskebuffer (samme sentrifugering som forrige trinn) og kast gjennomstrømningen.</li>
	<li>Tørk søylene ved sentrifugering i 2 min ved 12 000 x g.</li>
	<li>Overfør kolonnen til et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør og tilsett 9 μL varm TE-buffer (forvarmet til 55 °C) direkte til kolonnematrisen. La kolonnen inkubere i 1 min før sentrifugering i 1 min ved 10 000 x g.</li>
	<li>Overfør 9 μL av elute til et passende nytt sett med 8-rørs strimler.</li>
	<li>Fullfør elution igjen med 8 μL TE Buffer som før. Overfør elutten til de aktuelle 8-rørs stripene (sluttvolum 17 μL per prøve) og hold på is.</li>
</ol>6. Forsterkning og størrelsesvalg av de rensede prøvene
<ol><li>Følgende trinn bruker qPCR til å bestemme antall sykluser som kreves for optimal forsterkning (CtD – Ct-bestemmelse)</li>
	<li>Klargjør CtD-blandingen for alle prøver ved å multiplisere innholdet i CtD Mix Buffer med antall prøver.</li>
	<li>Dispenser 3,6 μL CtD-blanding i en qPCR-plate og tilsett 1,4 μL tagmenterte DNA-prøver (~10 % av det totale volumet). Utfør følgende qPCR: 98 °C i 3 minutter, 72 °C i 5 minutter, 98 °C i 30 s, 26 sykluser på 98 °C i 10 s, 63 °C i 30 s og 72 °C i 30 s.</li>
	<li>Forbered Amp Mix for alle prøver ved å multiplisere innholdet i AMP Mix Buffer med antall prøver. Dispenser 14 μL tagmentert DNA i separate brønner på en PCR-plate, og tilsett deretter 2,5 μL av to sekvenseringsindeksprimere (25 μM) til hver prøve (endelig reaksjonsvolum er 50 μL).</li>
	<li>Bland prøvene med flerkanals pipette og utfør forsterkningsprogrammet som brukes i CTD med riktig antall sykluser. MERK: Dette er et godt stoppested da de forsterkede prøvene kan lagres ved -20 °C i noen uker. Renselsen kan imidlertid fullføres på samme dag. For 48 prøver ble trinn 3 - 6.5 fullført med to andre separate partier og deretter forsterket i en batch som beskrevet nedenfor.</li>
	<li>Utfør etterforsterkning, størrelsesvalg og kvantifisering av tagmentert DNA som beskrevet nedenfor. Dette kan vanligvis fullføres med 48 prøver (kan fullføres med færre prøver etter ønske).<ol>
<li>Tilsett 90 μL paramagnetiske perler (1:1,8-forhold) i hver brønn, bland og la den inkubere ved RT i 2 minutter.</li>
		<li>Ta perlene ved hjelp av en platemagnet og kast supernatanten. Vask perlene 3 ganger med 200 μL frisk 80% etanol uten å forstyrre perlepellet.</li>
		<li>Fjern overflødig etanol med 20 μL spisser etter sluttvask og la perlene tørke i 10 minutter eller til sprekker vises i perlepellets.</li>
		<li>Med platen fortsatt på magneten, tilsett 40 μL av det forvarmede vannet til hver brønn. Forsegle platen, virvelen grundig, og puls-spinn platen kort.</li>
		<li>Fang perlene ved å plassere platen tilbake på magneten og overfør 40 μL elute til en ny "prøve" Plate. Prøvene er nå renset, og de neste trinnene beriker fragmenter fra 200-1000 bp.</li>
		<li>Valgfritt QC-trinn: Fjern 4 μL fra prøvene og overfør til en QC-plate. Tilsett 4 μL vann tilbake til prøvene. Dette bestemmer prosentandelen av store fragmenter.</li>
		<li>Tilsett 22 μL paramagnetiske perler (1:0,55-forhold) til prøvene, bland forsiktig og inkuber ved RT i 2 minutter.</li>
		<li>Plasser på magnet for å fange perlene i 5 min og overfør supernatantene til kolonne 7-12 av "prøve" -platen. Fjern platen fra magneten og tilsett 30 μL perler (sluttforhold på 1: 1,3). Bland forsiktig og la den sitte på RT i 2 minutter.</li>
		<li>Ta perlene i 5 min og kast deretter supernatanten.</li>
		<li>Vask alle perler 3 ganger med 200 μL frisk 80 % etanol som beskrevet tidligere (trinn 6.6.2 – 6.6.3).</li>
		<li>Når pelletsene er tørre, elute DNA med 8 μL forvarmet TE-buffer til hver brønn, mens du fortsatt er på magneten.</li>
		<li>Fjern platen grundig fra magneten, forseglingen og virvelen. La platen inkubere i 2 min ved RT, pulsspinn, og legg platen tilbake på magneten i 2 minutter. Overfør supernatanten til en ny plate (plate 2).</li>
		<li>For maksimal gjenoppretting gjentar du elution med en ekstra 8 μL for forhåndsvarmet TE-buffer. Plasser prøvene i de aktuelle brønnene slik at hver prøve har 16 μL endelig bibliotek. MERK: På slutten av dette trinnet skal det være to plater (en hvis ingen QC-plate ble fullført). QC-platen vil ha de forhåndsstørrelsesvalgte fragmentene, og den andre platen skal ha 48 brønner med endelig bibliotek (totalt 16 μL).</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Kvantifisere de endelige bibliotekene og QC-prøvene ved hjelp av en fluorescensanalyse
<ol><li>Fullstendig DNA-kvantifisering ved hjelp av en fluorescens kvantifiseringsanalyse eller en lignende metode.</li>
	<li>Hvis QC-kvantifiseringen ble fullført, må du bestemme prosentandelen av tap av utvalg som var < 1000 bp. Det bør ikke være mer enn omtrent 20% tap - hvis det var mer, kan det være et problem med de anvendte perleforholdene.</li>
	<li>Bestem størrelsen på fragmentene i hver prøve, helst ved hjelp av en kapillær elektroforesemaskin. For å beregne molarkonsentrasjonen, bruk følgende ligning: [Bibliotekkonsentrasjon (ng/μL) * 106]/[660 * Median fragmentstørrelse (bp)]). MERK: Bibliotekene er klare til å samles (likevektsbeløp) og sekvenseres etter standard neste generasjons sekvenseringsprosedyrer.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Mapping+of+in+Vivo+Protein-DNA+Interactions.">Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Mikkelsen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+maps+of+chromatin+state+in+pluripotent+and+lineage-committed+cells.">Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells.</a> Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Seumois, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+of+primary+human+T+cells+reveals+enhancers+associated+with+TH2+memory+cell+differentiation+and+asthma+susceptibility.">Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility.</a> Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17q21+asthma-risk+variants+switch+CTCF+binding+and+regulate+IL-2+production+by+T+cells.">17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells.</a> Nature Communication. 7, 13426 (2016).</li><li>Ai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+chromatin+states+using+single-cell+itChIP-seq.">Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communication. 6, 6033 (2015).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).</li><li>Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+and+Semiautomated+Microscaled+Approach+to+Profile+Cis-Regulatory+Elements+by+Histone+Modification+ChIP-Seq+for+Large-Scale+Epigenetic+Studies.">An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies.</a> Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> Elife. 6, 21856 (2017).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Genetic+Polymorphisms+on+Human+Immune+Cell+Gene+Expression.">Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression.</a> Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drivers+of+Epigenetic+and+Transcriptional+Variation+in+Human+Immune+Cells.">Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells.</a> Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).</li><li>Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEDIPS:+genome-wide+differential+coverage+analysis+of+sequencing+data+derived+from+DNA+enrichment+experiments.">MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments.</a> Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).</li><li>Engel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate-like+functions+of+natural+killer+T+cell+subsets+result+from+highly+divergent+gene+programs.">Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoBATCH+for+High-Throughput+Single-Cell+Epigenomic+Profiling.">CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li><li>Diagenode. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+Guide+for+Chromatin+Shearing+Optimization+with+Bioruptor+Standard+and+Plus.">The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus.</a> Diagenode. , (2012).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Metoden som er beskrevet her, utvides på ChIPmentation-prosedyren11, som implementerer en klargjøringsprotokoll for merkebibliotek før DNA-rensing, ved å automatisere og mikroskopre protokollen. Siden begynnelsen av ChIP-Seq har de nødvendige cellenumrene blitt redusert drastisk, fra omtrent 20 millioner celler for histoner ned til hundrevis og til og med enkeltceller1,7,10,12,18,19,20,21. Disse nyutviklede metodene har gjort det mulig å få en dypere forståelse av hvordan cis-regulatoriske mekanismer fungerer i celler ved å øke følsomheten og gjøre det mulig å teste sjeldne kliniske cellepopulasjoner5,6,12,17. For eksempel en av de nyere og populære prosedyrene, kalt CUT&TAG, som robust og sensitiv ChIP-Seq alternativ9. Det gir et utmerket signal-til-støy-forhold da Tn5-enzymet er kovalent bundet til protein A og gjenkjenner Fc-kjeden til ChIP-antistoffet med høy spesifisitet9. Bakgrunnsaktiviteten til Tn5-enzymet reduseres da enzymet ikke er funksjonelt før binding til målantistoffet9. Implementeringen av denne metoden i en klinisk sammenheng er imidlertid begrenset siden den krever ikke-faste, levende celler. Også fjerning av DNA-fragmenter fra hypotoniske kjernen kan ha negative effekter på kromatinet når det fjernes fra under analysen. Det nødvendige kravet til å jobbe med friske og levende celler er en kilde til problemer for sjeldne kliniske prøver og for store kohorter av prøver, siden store kohorter kan ta mange år å samle5. En annen type metode, drop-ChIP, bruker elegant en mikrofluidics-enhet til å generere dråpebasert kodeksjon før behandling av ChIP19. Den bruker imidlertid en svært spesialisert mikrofluidisk enhet, og selv om det er mulig å fullføre encellet ChIP-Seq, er den også begrenset til bruk av levende celler7,8,9,18,19. Nyere metoder som er avhengige av ChIP-Seq, for eksempel PLAC-Seq eller HiChIP, prøver å forstå 3D-interaksjoner (3D) mellom ChIP-Seq-toppene22,23. Disse 3D-metodene er spennende da de identifiserer cis-regulatoriskeeller TF-medierte interaksjoner på tvers av genomet og bedre forståelsen av regulering av genuttrykk i celletyper av interesse, i sunt vev og i sammenheng med sykdom.
Det er noen få kritiske trinn å vurdere for at protokollen skal lykkes, for eksempel kvaliteten på det sonikerte kromatinet og kvaliteten på antistoffet. Skjæreeffektivitet er kritisk, hvis kromatin ikke er sonikert godt, reduseres analysens effektivitet drastisk24. Sonikering er et utfordrende aspekt ved ChIP-Seq på grunn av cellenumrene som kreves. På sonikeren som ble brukt i protokollen, ble effektiviteten drastisk redusert under 300.000 celler. Dette er et utfordrende aspekt i ChIP-Seq om sonikering under dette nivået ofte vil kreve enzymatisk fragmentering, noe som er mindre upartisk. Som et resultat er sonikering en viktig begrenset faktor for ekte mikroskalert ChIP-Seq. Andre sonikeringsplattformer og kommersielt tilgjengelige sett ble testet for sonikerende kromatin, men sonikeren som ble brukt her hadde de mest robuste og reproduserbare resultatene. En annen fordel med sonikeren er ikke å måtte kjøpe spesialiserte rør for å kjøre sonikeringen, noe som reduserer kostnadene når du arbeider med et stort antall prøver. For optimal sonikering er det for det første viktig å forvarme sonikeren som beskrevet ovenfor. For det andre, for å lyse pellets, anbefales det å få pipettespissen til å berøre bunnen av røret mens du lyser for å bryte opp cellene med mer fysiske begrensninger. For det tredje hindrer enhver bobledannelse før sonikering prøvens evne til å bli sonikert jevnt. Hvis det dannes noen bobler under lysisene, er det viktig å fjerne dem med en pipette. Dette kan være utfordrende uten å fjerne mye prøve, men hvis spissen er lett presset mot boblen, kan den sakte trekkes opp uten tap av mye prøve. Til slutt, når du bestemmer antall sykluser, fullfør et tidskurs der hver tredje syklus, prøven fjernes, renses og kjører på en agarosegel. Unngå over/under sonikering av prøver, da dette reduserer ChIP-effektiviteten. Hvis prøven er under sonikert, kan de store fragmentene ha en negativ effekt på ChIP-Seq-kvaliteten24. På den annen side, hvis prøven er over sonikert, er det fare for at målepiloen går tapt i prosessen.
En annen viktig del av ChIP-Seq er kvaliteten på antistoffet. Før du kjører en storskala studie, er det nødvendig å optimalisere antistoffet som skal brukes. Målet er å oppnå et betydelig høyt signal-til-støy-forhold mellom kjente regioner i genomet, og en annen er reproduserbarheten. Hvis antistoffet trekker mye bakgrunnssignal, kan det anbefales å bruke en større inngang eller prøve en annen lot / leverandør. Dette vil legge til tid før du starter et stort eksperiment, men det er et viktig trinn. For å teste for signal-til-støy anbefales det å bruke qPCR med regioner som er kjent for å være et mål for antistoffet ditt og en annen region som er kjent for å være fraværende. Det har blitt lagt merke til at histone modifikasjoner er mer robuste og enklere å optimalisere enn TFer.
Protokollen beskrevet ovenfor gir en robust metode for high-throughput histone-modifikasjon ChIP-Seq på en semiautonomisk, mikroskalert måte. Metoden begrenser mengden hands-on tid og øker reproduserbarheten over manuell ChIP-Seq. Tidligere studier fullført i laboratoriet brukte manuell ChIP på tekniske repliker og oppnådde et Spearman korrelasjonsgjennomsnitt på 0,505, men med det halvautomatiske systemet, Spearman-korrelasjonen mellom forskjellige givere med et NK-cellegjennomsnitt på 0,66 (Supplerende tabell 2). Dette ble også fullført med omtrent 40% mindre praktisk tid. Metoden beskrevet her er optimalisert for histone-modifikasjoner (H3K27ac vist her, men protokollen bør ikke trenge noen modifikasjon for andre) og vil bare kreve mindre modifikasjoner for å bli implementert for TF ChIP-Seq. Til tross for kvaliteten på antistoffet, ville hovedendringen være for sonikeringstiden og potensielt bufferne som brukes under IP. Vanligvis, for TF ChIP-analyser, kan metoden fungere bedre med litt lengre fragmenter av kromatin (med en rekkevidde på rundt 350-800 bp) da TF: DNA-komplekser sannsynligvis er mindre i stand til å opprettholdes gjennom streng sonikering6. Bufferne må kanskje også endres til en egendefinert blanding eller andre tilgjengelige bransjesett, siden TFer kan oppføre seg annerledes enn histone-modifikasjoner.
Selv om den automatiserte ChIP væskebehandleren ble testet for så få som 10.000 celler, var det en merkbar reduksjon i reproduserbarhet ved lavere kromatinkonsentrasjoner. På grunn av dette ble protokollen ikke anbefalt til mindre enn 10.000 celler, med 100.000 celler som de optimale forholdene. Protokollen ble også fullført ved hjelp av bransje ChIP-buffere, som var en ekstra utgift, men som ga data av høyere kvalitet. Protokollen kan endres med hensyn til sonikeringsforholdene (så lenge det skjærede kromatinet holdes innenfor samme område), kan buffere tilpasses for immunoprecipitation (IP; optimalisering kan være nødvendig), eller ChIP væskebehandler kan ikke brukes. En begrensning i protokollen er bruken av ChIP væskebehandler, som kan være en dyr investering og bare kan kjøre 16 prøver samtidig. ChIP væskebehandler er begrenset til små reaksjoner, og celletall større enn en million anbefales ikke. Protokollen kan imidlertid fullføres uten den, ved å fullføre IP- og vasketrinnene manuelt. Hvis IP-en og vaskene ble fullført for hånd, vil tiden for å fullføre analysen øke og reproduserbarheten kan reduseres, men denne guiden vil fortsatt være nyttig for å kjøre et ChIP-Seq-eksperiment av høy kvalitet. Vær oppmerksom på at andre væskehåndterere kan tilpasses for å kjøre halvautomaterte ChIP-reaksjoner.
For å oppsummere er de viktigste fordelene med dette systemet den høye gjennomstrømnings naturen, siden IP- og vasketrinnene fullføres autonomt. Som sådan kan sekvensielle runder med ChIP-eksperimenter fullføres, slik at opptil 48 prøver kan behandles fullstendig og klare for sekvensering på 5 dager, med begrenset praktisk tid sammenlignet med manuelle ChIP-Seq-eksperimenter. En annen fordel er økt reproduserbarhet siden ChIP-Seq kan være vanskelig å oppnå svært reproduserbare resultater. Andre metoder krever enten levende celler, komplekse mikropipetteringssystemer eller arbeidet som skal fullføres for hånd. Dette systemet må optimaliseres for lav-input prøver (< 10,000 celler), til slutt tillate encellede ChIP reaksjoner. Systemet er også i stand til å tilpasses de nyere ChIP-metodene, for eksempel PLAC-Seq og HiChIP22,23.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Pandurangan Vijayanad
to:
Pandurangan Vijayanand

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.

Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Sara Herrera-da&#160;la Mata
to:
Sara Herrera-de la Mata

Den brede bruken av ChIP-Seq-analyser for å bestemme fragmenter av DNA knyttet til spesifikke histone modifikasjoner skyldes delvis sin evne til å identifisere cis-regulatoriske DNA-elementer, inkludert aktive forsterkere, promotører, lyddempere, heterochromatin og andre1,2,3,4. Identifisering av ikke-kodende reguleringsregioner på tvers av genomet har vist verdifull innsikt for bedre å forstå genregulering i helse og sykdommer4. Tidligere arbeid fra laboratoriet har brukt ChIP-Seq for å vise at cis-regulatoriske elementer kan spille viktige roller i forskjellige celletyper5. Transkripsjonsfaktor (TF) ChIP-analyser har blitt brukt til å vise sykdom forbundet med enkeltkjernepolymorfier6.
Bruken av ChIP-Seq med menneskelige kliniske prøver er utfordrende, hovedsakelig på grunn av begrensningen av celletall eller ønsket vevsprøve. Som et resultat har det vært en felles innsats i feltet for å forbedre og mikroskala disse teknikkene, og som et resultat har det dukket opp flere analyser, for eksempel CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12. Denne analysen benytter en transposase for å merke og isolere genomiske regioner bundet av et bestemt antistoff9. Denne teknikken har vært i stand til å redusere celletallene ned til 1000 og i noen tilfeller til en enkeltcellet, men bruken av denne teknikken i translasjonell forskning og klinisk oppsett har vist begrensninger på grunn av kravene til bruk av levende celler for denne metoden9,12. Kravet til levende celler gjør kliniske prøver logistisk vanskelige å håndtere og kan introdusere batcheffekter hvis prøvene ikke behandles samtidig. Andre har optimalisert mikroskalerte teknikker for formaldehydfaste celler, inkludert utviklingen av ChIPmentation11, som er tilpasset her på en høy gjennomstrømningsmåte. Bruken av faste celler gjør det mulig å lagre prøver til innsamling og etterfølgende behandling av alle prøver sammen for å minimere satsvise effekter.
Her beskrives en halvautomatisert mikroskalert ChIP-Seq-analyse som reduserer eksperimentell praktisk tid for å profilere histone modifikasjoner10. Den halvautomatiske metoden gjør det mulig å behandle ChIP-Seq-analyser med høy gjennomstrømning, slik at opptil 48 prøver kan behandles ferdig og klargjøres for sekvensering på så lite som 5 dager, for så få som 10 000 celler per prøve ved hjelp av en ChIP væskebehandler. Håndtereren fullfører immunoprecipitation (IP) og påfølgende vasker på en autonom måte, noe som bidrar til å redusere variasjon mellom prøver. Den halvautomatiske metoden senker både den praktiske tiden med over 15 timer for 48 prøver og den tekniske variasjonen, slik at store epigenetiske studier kan utføres på en reproduserbar og rask måte for enten primære eller dyrkede celler. Protokollen forklarer prosessen fra start til slutt for ChIP-Seq av høy kvalitet. Hvis de spesifikke maskinene ikke er tilgjengelige, vil protokollen fortsatt være en nyttig ressurs for å sette opp og problem-skyte ChIP-Seq eksperimenter manuelt.
Analysen ble utført med tre forskjellige primære menneskelige immuncelletyper og en kultivert cellelinje (HUT78 – ATCC: TIB-161). For klarhet har protokollen blitt delt inn i syv seksjoner: cellefiksering, kromatinskjæring via sonikering, automatisert kromatinimmunoprecipitation, bibliotekforberedelse ved DNA-fragmentmerking, bibliotekforsterkning, bibliotekrensing, etterfulgt av DNA-kvantifisering. For bufferoppskrifter, se Supplerende tabell 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="950">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">200 &#181;l tube strips (8 tubes/strip) + cap strips</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020002</td>
			<td style="width:288px;">Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">AMPure XP for PCR Purification</td>
			<td style="width:127px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>SPRI beads</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td>0.65 mL low binding tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Bioruptor Pico Sonicator</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B01060010</td>
			<td>Sonicator used in the lab but others can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ChIP DNA Clean &#38; Concentrator (Capped Columns)</td>
			<td style="width:127px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D5205</td>
			<td>DNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA pH 8.0</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Glycine</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">50046-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">H3K27ac polyclonal antibody - Premium</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15410196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES (1 M) pH 7.5</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20027213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20034197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IP-Star Compact Automated System</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B03000002</td>
			<td>Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">KK2601</td>
			<td>PCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">R0971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4551-250ML</td>
			<td>CAUTION - low flash point</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (5 M), RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-4700</td>
			<td style="width:288px;">8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PureLink RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td>Used in the flourescence quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">4485699</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ROX Reference Dye</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12223012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">303410-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td>nucleic acid dye</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Tips (bulk)</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30040020</td>
			<td>Tips for the IP Star</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">True MicroChIP Kit</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C01010130</td>
			<td>Contains all the buffers for the IP; ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies

Kromatinimmunoprecipitation etterfulgt av sekvensering (ChIP-Seq) er en kraftig og mye brukt tilnærming til profilkromatin-DNA forbundet med spesifikke histone modifikasjoner, for eksempel H3K27ac, for å bidra til å identifisere cis-regulatoriske DNA-elementer. Den manuelle prosessen for å fullføre en ChIP-Seq er arbeidsintensiv, teknisk utfordrende og krever ofte store celletall (> 100 000 celler). Metoden beskrevet her bidrar til å overvinne disse utfordringene. En komplett halvautomatisert, mikroskalert H3K27ac ChIP-Seq-prosedyre, inkludert cellefiksering, kromatinskjæring, immunseffitering og sekvensering av bibliotekforberedelse, for batch på 48 prøver for cellenummerinnganger mindre enn 100 000 celler er beskrevet i detalj. Den halvautonomiske plattformen reduserer teknisk variasjon, forbedrer signal-til-støy-forhold og reduserer arbeidskraften drastisk. Systemet kan dermed redusere kostnadene ved å tillate reduserte reaksjonsvolumer, noe som begrenser antall dyre reagenser som enzymer, magnetiske perler, antistoffer og praktisk tid som kreves. Disse forbedringene av ChIP-Seq-metoden passer perfekt for epigenetiske studier i stor skala av kliniske prøver med begrensede celletall på en svært reproduserbar måte.

Som konseptbevis ble ChIP-Seq fullført for seks menneskelige givere med tre sett med immuncelletyper: naive CD4 T-celler (CD4), klassiske monocytter (MO) og naturlige morderceller (NK), beriket av FACS-sortering som beskrevet før13. Den understrekede prosedyren består av ni forskjellige prosedyrer som representert i figur 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig1.jpg"> Figur 1: Generelt flytskjema for prosedyren. (A) En tegneserie av den overordnede prosedyren (generert i BioRender). (B) Flytskjema for alle hovedtrinnene for protokollen og beregnet praktisk og total tid som er knyttet til hver dag. Sekvenseringen kan skje på slutten av dag 5 eller senere med flere runder. Tidslinjen kan også forskyves gjennom hele uken, der sekvensiell dag 3-4 kan fullføres flere ganger i uken for å generere 48 ChIP-prøver. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Etter celleisolasjon ved strømning cytometri13, ble sorterte celler sentrifugert og celler festet og lagret som beskrevet ovenfor. Når alle prøvene ble samlet inn, ble prøvene lysnet og forberedt på kromatisk skjæring i grupper på 12 som beskrevet ovenfor. For hver prøve ble antall sykluser for å oppnå optimal sonikering fullført10. Kvantitativ måling, samt skrånende kromatinfragmentstørrelsesmålinger, viste stor reproduserbarhet av metoden vår på de tre settene med immunceller (figur 2A). De forskjellige menneskelige immuncellene ble sonikert i separate partier og ga svært konsistent med > 70% av prøven mellom 100 - 500 bp i 14 sykluser (16 s PÅ, 32 s AV per syklus). På dette tidspunktet ble prøver med store fragmenter etter sonikering (< 70% av prøven mellom 100 - 500 bp) ansett som mislykket. Disse prøvene kunne enten sonikeres for 1-2 ekstra sykluser eller ble kassert og erstattet senere med celler fra en annen pellets. Vår metode viste at ingen av prøvene krevde mer sonikering eller ble eliminert, noe som tyder på absolutt robusthet i prosedyren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig2.jpg"> Figur 2: Qc-eksempler før sekvensering. (A) 1,2 % agarosegeler viser reproduserbarhet av sonikering. Sonikeringsprøver for 6 donorer i tre celletyper: naive CD4 T-celler (CD4), klassiske monocytter (MO) og naturlige morderceller (NK). Prøvene ble sonikert i 14 sykluser (16 s PÅ, 32 s AV per syklus). For hver prøve ble ca 200 ng decrosslinked kromatin lastet på en 1% agarose gel. Prøver ble ansett som gode hvis mer enn 70 % av fragmentene er innenfor 100-500 bp. (B) Top - Analyse qPCR forsterkningskurver for å bestemme det optimale antallet sykluser for forsterkning (Ct der det er 1/2 maksimal intensitet). De ideelle prøvene har en Ct på ca 15 og forsterkning kan fullføres opptil 2 syklus mer av den målte Ct. Pilen er et eksempel på et dårlig eksempel der Ct er større enn 18. Bunn - Et eksempel på et dårlig sett med prøver vises som har en Ct større enn 18. Disse prøvene viste også lavere fluorescensintensitet. (C) Venstre - Fragmentanalysatorelektroforesespor viste fordelingen av endelige tagmenterte biblioteker etter forsterkning og størrelsesvalg. Prøver med mer enn 85 % av fragmentbiblioteket ligger innenfor 200-1000 bp ble ansett som gode prøver. Måling av toppintensitet av fluorescens anses også som en viktig QC-parameter, faktisk hvis signalet er lavt, er prøven usannsynlig å sekvensere godt. Høyre – Eksempler på positive prøver i CD4, MO og NK vises. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Etter kvantifisering ble prøvene kjørt på en ChIP væskebehandler med H3K27ac antistoffer, etterfulgt av tagmentering med Tn5 transposase enzym. For å bestemme riktig antall forsterkningssykluser av qPCR, ble 10% av tagmenterte prøver brukt. For bestemmelse av antall sykluser for forsterkning av prøvene, finner vi syklusen der intensiteten av prøven er halvparten av gjennomsnittlig maksimum for syklusbestemmelse (Figur 2B). Prøver med Ct-verdier på mer enn 18 fungerte ikke bra etter sekvensering, og Ct-verdien var dermed en indikasjon på et mislykket ChIP-utvalg. Disse prøvene ga generelt også en lavere mengde DNA etter forsterkning. Eksempler (100 000 celler) med en Ct-verdi lik eller mindre enn 15 var ideelle, og prøver mellom 15 og 18 var akseptable, men mindre konsekvente etter sekvensering. For prøver med mindre enn 100 000 inndataceller ble Ct-verdiene vanligvis funnet mellom 15 og 18, men trengte ikke mer enn 18 sykluser for å gi nok produkt til sekvensering.
Etter DNA-tagmentert forsterkning ble biblioteker renset og størrelsesvalgt for å oppnå en ideell størrelsesdistribusjon, fra 200 til 1000 bp, for NextGen-sekvenseringen. Størrelsesfordelingsvurderingen på hvert av bibliotekene ble fullført fordi de beste sekvenseringsdataene ble innhentet når mer enn 85 % av DNA-fragmentene varierte mellom 200 og 1000 bp (figur 2C). Spesielt, da samme mengde DNA (målt ved fluorescens kvantifisering) ble lastet, ble det lagt merke til prøvene med lavere fluorescensintensitet generelt sekvensert dårlig (Figur 2C).
Etter sekvensering ble standard kvalitetskontroll basert på ENCODE ChIP-Seq-retningslinjene brukt5,14,15.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig3.jpg"> Figur 3: Reproduserbarhet av immuncelleprøvene. (A) H3K27ac-spor (UCSC Genome Browser, maksimal intensitet, utjevningsfunksjon på 4, alle med like skalert Y-akse) for 6 givere (100 000 celler per replikering) i hver celletype (CD4, MO og NK). Fire eksemplariske loci er vist, to med (IL2RA locus og PTPRC) og to uten berikelse for H3K27ac (CCR4 og MS4A1). (B) Pearson-korrelasjon mellom giverne og tilsvarende korrelasjonsplott generert ved hjelp av en filtype på 300 bp og et vindu på 500 bp i MEDIPS-pakken for hver av celletypene replikerer16. (C) Sammenslåtte donorfiler for hver celletype som viser H3K27ac-spor (UCSC Genome Browser maksimal intensitet, utjevningsfunksjon på 4) i celletypespesifikke regioner (IL17R for CD4, CCR2 for MO og KLRC1 for NK) og det husholdende genet B2M, som finnes i alle celletyper. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For visuell kvalitetskontroll ble H3K27ac berikelsesspor for visning i UCSC-genomleseren utarbeidet. For fire genloci viste individuelle spor for hver prøve høy kartkvalitet og signal-til-støy-forhold som reflekterer den høye konsistensen og robustheten til analysen vår (figur 3A). De to loci til venstre havn godt uttrykte gener i disse celletypene, mens genene i de to loci til høyre ikke uttrykkes og tjenes som bakgrunnskontroller13 (Figur 3A). Videre ble MEDIPS-analysepakken brukt som variabel etter sekvensering for å vurdere korrelasjonsindeksen mellom tekniske replikeringer (Figur 3B)5,16,17, og etablere korrelasjonsgraden for leseberikelsesnivå for 500 bp bins16. For de fleste parvise sammenligningene viste Pearsons korrelasjonsindekser mer enn 90 % korrelasjon som tyder på høy grad av konsistens mellom de biologiske replikkene (Figur 3B). Replikeringer med akseptabel korrelasjon ble slått sammen for å øke signal-til-støy-forholdet. Mens celletypespesifikk loci viste høy berikelse i de aktuelle cellene, viste et husholdende gen (B2M) svært konsistent histone modifikasjon (Figur 3C). For analysen vil sammenslåing av spor fra repliker øke berikelsen, forsterke det spesifikke signalet, inkludert for viktige celletypespesifikke forsterkere, og reduserer den interpersonlige variasjonen som er forbundet med menneskelige prøver5.
Selv om 100 000 celler ble brukt til denne studien, var det høy reproduserbarhet for så få som 10 000 celler i en menneskekulturert T-cellelinje (HUT78). Korrelasjonsanalyse mellom ChIP-Seq-datasett utført fra prøver med mindre enn 100 000 celler viste høy reproduserbarhet og korrelasjon ned til 10 000 celler (figur 4A).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61617/61617fig4.jpg"> Figur 4: Reproduserbarhet av lave inndataprøver. (A) Eksempler på konsistensen av H3K27ac ChIP-Seq for celler 100 000 ned til 10 000 i HUT-78 celler (en T-celle lymfomcellelinje). Sporene (UCSC Genome Browser, maksimal intensitet, utjevningsfunksjon på 4, alle med like skalert Y-akse) viser IL4-locus. (B) Pearson-korrelasjoner for replikeringene ved hjelp av en filtype på 300 bp og et vindu på 500 bp i MEDIPS-pakken16.  (C) Pearson korrelasjoner mellom de forskjellige cellenummergruppene (100 000, 50 000 og 10 000 celler) ved hjelp av de samme MEDIPS-parameterne som i (B)16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/61617fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Pearsons korrelasjonsanalyse viste høy korrelasjonsindeks (83 % til 92 %), noe som tyder på vedlikehold av signal i prøver med lavt celletall. Det var imidlertid økt bakgrunn etter hvert som celletallene ble redusert, samt en nedgang i korrelasjonskoeffisientene (figur 4B). For å opprettholde signaler med lav bakgrunn ble tekniske duplikater slått sammen, og korrelasjonen ble testet mellom grupper (figur 4C).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>10X cellefikseringsbuffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sammensatt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Formaldehydløsning</td>
			<td>11%</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8,0</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGTA, pH 8,0</td>
			<td>0,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES, pH 7,5</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fullstendig Lysis-buffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sammensatt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8,0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natrium butyrat</td>
			<td>20 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kortsiktig Lysis Buffer</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sammensatt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA, pH 8,0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>SDS</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blanding av kodementering</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sammensatt</td>
			<td>Endelig konsentrasjon</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tris-HCI, pH 8,0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>N,N-dimetylformamid</td>
			<td>10%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Illumina tagmentering enzym</td>
			<td>1:24 vol:vol</td>
		</tr>
<tr>
<td>CtD-blanding</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sammensatt</td>
			<td>Per prøve (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Indeks Primer A (25 μM)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>NextEra Indeks Primer B (25 μM)</td>
			<td>0.275</td>
		</tr>
<tr>
<td>2X KAPA HiFi HotStart Klar Mix</td>
			<td>2.75</td>
		</tr>
<tr>
<td>1:1000 SYBR Grønn fargestoff</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>ROX passiv fargestoff</td>
			<td>0.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vann</td>
			<td>Fyll til 4 μL</td>
		</tr>
<tr>
<td>AMP-blanding</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Sammensatt</td>
			<td>Per prøve (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2X KAPA HiFi HotStart Klar Mix</td>
			<td>27.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Vann</td>
			<td>Fyll til 31 μL</td>
		</tr>
</tbody></table>Supplerende tabell 1: Bufferoppskrifter. 
Supplerende tabell 2: Spearman og Pearson prøver korrelasjoner for de 6 giverne og hver celletype. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61617/Supplementary_Table_2.xlsx">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

Dette dokumentet beskriver en halvautomatisert, mikroskalert ChIP-Seq-protokoll av DNA-regioner knyttet til en bestemt histone modifikasjon (H3K27ac) ved hjelp av en ChIP væskehåndtererplattform, etterfulgt av bibliotekforberedelse ved hjelp av tagmentering. Prosedyren inkluderer kontrollvurdering for kvalitet og kvantitetsformål og kan vedtas til andre histone modifikasjoner eller transkripsjonsfaktorer.

En halvautomatisk ChIP-Seq-prosedyre for epigenetiske studier i stor skala

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Generasjon av høy kvalitet Chromatin immunoprecipitation DNA Mal for High-throughput sekvensering (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium analyse for Storskala SNP genotyping Applications

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

En strategi for Sensitive, Large Scale Kvantitative Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Automatisere Chip-seq Forsøk å generere epigenetiske profiler på 10.000 HeLa celler

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...