Name: a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies
Uploaded: 2020-08-13T15:00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

Мы благодарим членов лаборатории Виджаянанд за техническую помощь и конструктивные обсуждения, а также д-ра Шаррона Скваццо и г-на Джеффри Берге из Diagenode за техническую помощь с машиной и протоколами обработки жидкости sonicator и ChIP. Эта работа была поддержана грантами NIH AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) и S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).

<ol>
	<li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome.">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li><li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Mapping+of+in+Vivo+Protein-DNA+Interactions.">Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.</a> Science. 316, 1497-1502 (2007).</li><li>Mikkelsen, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+maps+of+chromatin+state+in+pluripotent+and+lineage-committed+cells.">Genome-wide maps of chromatin state in pluripotent and lineage-committed cells.</a> Nature. 448 (7153), 553-560 (2007).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Seumois, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+of+primary+human+T+cells+reveals+enhancers+associated+with+TH2+memory+cell+differentiation+and+asthma+susceptibility.">Epigenomic analysis of primary human T cells reveals enhancers associated with TH2 memory cell differentiation and asthma susceptibility.</a> Nature Immunology. 15 (8), 777-788 (2014).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17q21+asthma-risk+variants+switch+CTCF+binding+and+regulate+IL-2+production+by+T+cells.">17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells.</a> Nature Communication. 7, 13426 (2016).</li><li>Ai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+chromatin+states+using+single-cell+itChIP-seq.">Profiling chromatin states using single-cell itChIP-seq.</a> Nature Cell Biology. 21 (9), 1164-1172 (2019).</li><li>Brind'Amour, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations.">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nature Communication. 6, 6033 (2015).</li><li>Kaya-Okur, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CUT&amp;Tag+for+efficient+epigenomic+profiling+of+small+samples+and+single+cells.">CUT&amp;Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells.</a> Nature Communication. 10 (1), 1930 (1930).</li><li>Youhanna Jankeel, D., Cayford, J., Schmiedel, B. J., Vijayanand, P., Seumois, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Integrated+and+Semiautomated+Microscaled+Approach+to+Profile+Cis-Regulatory+Elements+by+Histone+Modification+ChIP-Seq+for+Large-Scale+Epigenetic+Studies.">An Integrated and Semiautomated Microscaled Approach to Profile Cis-Regulatory Elements by Histone Modification ChIP-Seq for Large-Scale Epigenetic Studies.</a> Methods Molecular Biology. 1799, 303-326 (2018).</li><li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPmentation:+fast,+robust,+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors.">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nature Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li><li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+targeted+nuclease+strategy+for+high-resolution+mapping+of+DNA+binding+sites.">An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites.</a> Elife. 6, 21856 (2017).</li><li>Schmiedel, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Genetic+Polymorphisms+on+Human+Immune+Cell+Gene+Expression.">Impact of Genetic Polymorphisms on Human Immune Cell Gene Expression.</a> Cell. 175 (6), 1701-1715 (2018).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+Drivers+of+Epigenetic+and+Transcriptional+Variation+in+Human+Immune+Cells.">Genetic Drivers of Epigenetic and Transcriptional Variation in Human Immune Cells.</a> Cell. 167 (5), 1398-1414 (2016).</li><li>Lienhard, M., Grimm, C., Morkel, M., Herwig, R., Chavez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEDIPS:+genome-wide+differential+coverage+analysis+of+sequencing+data+derived+from+DNA+enrichment+experiments.">MEDIPS: genome-wide differential coverage analysis of sequencing data derived from DNA enrichment experiments.</a> Bioinformatics. 30 (2), 284-286 (2014).</li><li>Engel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate-like+functions+of+natural+killer+T+cell+subsets+result+from+highly+divergent+gene+programs.">Innate-like functions of natural killer T cell subsets result from highly divergent gene programs.</a> Nature Immunology. 17 (6), 728-739 (2016).</li><li>Grosselin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+ChIP-seq+identifies+heterogeneity+of+chromatin+states+in+breast+cancer.">High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer.</a> Nature Genetics. 51 (6), 1060-1066 (2019).</li><li>Rotem, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+ChIP-seq+reveals+cell+subpopulations+defined+by+chromatin+state.">Single-cell ChIP-seq reveals cell subpopulations defined by chromatin state.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1165-1172 (2015).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CoBATCH+for+High-Throughput+Single-Cell+Epigenomic+Profiling.">CoBATCH for High-Throughput Single-Cell Epigenomic Profiling.</a> Molecular Cell. 76 (1), 206-216 (2019).</li><li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq.">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Research. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li><li>Mumbach, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiChIP:+efficient+and+sensitive+analysis+of+protein-directed+genome+architecture.">HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture.</a> Nature Methods. 13 (11), 919-922 (2016).</li><li>Diagenode. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ultimate+Guide+for+Chromatin+Shearing+Optimization+with+Bioruptor+Standard+and+Plus.">The Ultimate Guide for Chromatin Shearing Optimization with Bioruptor Standard and Plus.</a> Diagenode. , (2012).</li></ol>

Авторам нечего раскрывать.

Описанный здесь способ расширяет процедуру11ChIPmentation, которая реализует протокол подготовки библиотеки тегментации до очистки ДНК путем автоматизации и микромасштабирования протокола. С момента появления ChIP-Seq необходимое количество клеток было резко сокращено, с примерно 20 миллионов клеток для гистонов до сотен и даже одиночных клеток1,7,10,12,18,19,20,21. Эти недавно разработанные методы позволили глубже понять, как цис-регуляторныемеханизмы работают в клетках, повышая чувствительность и позволяя тестировать редкие клинические популяции клеток5,6,12,17. Например, одна из более поздних и популярных процедур, называемая CUT&TAG, как надежная и чувствительная альтернатива ChIP-Seq9. Он производит отличное соотношение сигнал/шум, поскольку фермент Tn5 ковалентно связан с белком A и распознает цепь Fc антитела ChIP с высокой специфичностью9. Фоновая активность Tn5-фермента снижается, так как фермент не функционирует до связывания с целевым антителом9. Однако реализация этого метода в клиническом контексте ограничена, поскольку для него требуются нефиксированные, живые клетки. Кроме того, удаление фрагментов ДНК из гипотонического ядра может иметь негативные последствия для хроматина, поскольку он удаляется во время анализа. Необходимое требование для работы со свежими и живыми клетками является источником проблем для редких клинических образцов и для больших когорт образцов, поскольку большим когортам может потребоваться несколько лет, чтобы собрать5. Другой тип метода, drop-ChIP, элегантно использует устройство микрофлюидики для генерации метки на основе капель перед обработкой ChIP19. Тем не менее, он использует узкоспециализированное микрофлюидное устройство и, хотя можно завершить одноклеточный ChIP-Seq, он также ограничен использованием живых клеток7,8,9,18,19. Новые методы, основанные на ChIP-Seq, такие как PLAC-Seq или HiChIP, пытаются понять 3-мерные (3D) взаимодействия между пиками ChIP-Seq22,23. Эти 3D-методы интересны, поскольку они идентифицируют цис-регуляторныеили TF-опосредованные взаимодействия по всему геному и лучше понимают регуляцию экспрессии генов в интересующих типах клеток, в здоровых тканях и в контексте заболевания.
Есть несколько критических шагов, которые следует учитывать для успеха протокола, таких как качество ультразвукового хроматина и качество антитела. Эффективность резки имеет решающее значение, если хроматин плохо обрабатывается ультразвуком, эффективность анализа резко снижаетсяна 24. Обработка ультразвуком является сложным аспектом ChIP-Seq из-за требуемого количества клеток. На ультразвуковом аппарате, используемом в протоколе, эффективность была резко снижена до 300 000 ячеек. Это сложный аспект в ChIP-Seq, поскольку для обработки ультразвуком на этом уровне часто требуется ферментативная фрагментация, которая менее беспристрастна. В результате обработка ультразвуком является основным ограниченным фактором для истинного микромасштабирования ChIP-Seq. Другие платформы обработки ультразвуком и коммерчески доступные наборы были протестированы на обработку ультразвуком хроматина, но используемый здесь ультразвуковой аппарат имел самые надежные и воспроизводимые результаты. Еще одним преимуществом ультразвукового аппарата является отсутствие необходимости приобретать специализированные трубки для выполнения обработки ультразвуком, что снижает затраты при работе с большим количеством образцов. Для оптимальной обработки ультразвуком, во-первых, важно предварительно нагреть ультразвуковой аппарат, как описано выше. Во-вторых, чтобы лизировать гранулу, рекомендуется, чтобы наконечник пипетки касался нижней части трубки во время лизирования, чтобы разбить клетки с большим количеством физических ограничений. В-третьих, любое образование пузырьков перед обработкой ультразвуком препятствует способности образца равномерно обрабатываться ультразвуком. Если во время лизиса образовались какие-либо пузырьки, важно удалить их пипеткой. Это может быть сложной задачей без удаления большого количества образца, но если наконечник слегка прижат к пузырю, его можно медленно вытягивать без потери большого количества образца. Наконец, при определении количества циклов пройдите временной курс, где каждые три цикла образец удаляется, очищается и запускается на агарозном геле. Избегайте чрезмерной / недостаточной обработки образцов ультразвуком, так как это снижает эффективность ChIP. Если образец находится под ультразвуком, крупные фрагменты могут оказать негативное влияние на качество ChIP-Seq24. С другой стороны, если образец чрезмерно обработан ультразвуком, существует риск того, что эпитоп мишени потеряется в процессе.
Другой важной частью ChIP-Seq является качество антитела. Перед проведением любого масштабного исследования необходимо оптимизировать антитело, которое будет использоваться. Цель состоит в том, чтобы получить значительно высокое отношение сигнал/шум известных областей генома, а еще одним является воспроизводимость. Если антитело вытягивает много фонового сигнала, может быть рекомендовано использовать больший вход или попробовать другой лот / поставщика. Это добавит времени перед началом масштабного эксперимента, но это важный шаг. Для тестирования сигнал-шум рекомендуется использовать qPCR с областями, которые, как известно, являются мишенью вашего антитела, и другой областью, которая, как известно, отсутствует. Было замечено, что модификации гистонов более надежны и их легче оптимизировать, чем TF.
Протокол, описанный выше, обеспечивает надежный метод для высокопроизводительной гистон-модификации ChIP-Seq полуавтономным, микромасштабированным способом. Метод ограничивает количество практического времени и повышает воспроизводимость по сравнению с ручным ChIP-Seq. Предыдущие исследования, завершенные в лаборатории, использовали ручной ChIP на технических репликах и получили среднее значение корреляции Спирмена0,50 5,однако с полуавтоматизированной системой корреляция Спирмена между различными донорами со средним значением NK-клеток 0,66(Дополнительная таблица 2). Это также было завершено примерно на 40% меньше практического времени. Метод, описанный здесь, был оптимизирован для модификаций гистонов (H3K27ac показан здесь, но протокол не должен нуждаться в каких-либо модификациях для других) и потребует только незначительных изменений для реализации для TF ChIP-Seq. Несмотря на качество антитела, основная модификация будет касаться времени обработки ультразвуком и, возможно, буферов, используемых во время ИС. Обычно для анализов TF ChIP метод может лучше работать с немного более длинными фрагментами хроматина (с диапазоном около 350-800 bp), поскольку комплексы TF: DNA, вероятно, менее способны поддерживаться с помощью строгой обработки ультразвуком6. Буферы также могут потребоваться изменить на пользовательский микс или другие доступные в отрасли наборы, поскольку TF могут вести себя иначе, чем модификации гистонов.
Хотя автоматизированный обработчик жидкости ChIP был протестирован всего на 10 000 клеток, наблюдалось заметное снижение воспроизводимости при более низких концентрациях хроматина. Из-за этого протокол не был рекомендован менее чем 10 000 клеток, причем 100 000 клеток были оптимальными условиями. Протокол также был завершен с использованием отраслевых буферов ChIP, что было дополнительным расходом, но обеспечивало более высокое качество данных. Протокол может быть изменен в отношении условий обработки ультразвуком (при условии, что срезанный хроматин хранится в том же диапазоне), буферы могут быть настроены для иммунопреципитации (IP; может потребоваться оптимизация), или жидкостный обработчик ChIP может не использоваться. Ограничением протокола является использование жидкостного обработчика ChIP, который может быть дорогостоящей инвестицией и может запускать только 16 образцов одновременно. Обработчик жидкости ChIP ограничен мелкомасштабными реакциями, и количество клеток, превышающее один миллион, не рекомендуется. Тем не менее, протокол может быть завершен без него, выполнив шаги IP и промывки вручную. Если IP и стирки были выполнены вручную, время на завершение анализа увеличится, а воспроизводимость может уменьшиться, но это руководство все равно будет полезно при проведении высококачественного эксперимента ChIP-Seq. Следует отметить, что другие обработчики жидкости могут быть адаптированы для запуска полуавтоматизированных реакций ChIP.
Подводя итог, можно сказать, что основными преимуществами этой системы является высокая пропускная способность, поскольку этапы IP и мойки выполняются автономно. Таким образом, последовательные раунды экспериментов ChIP могут быть завершены, что позволяет полностью обработать и подготовить к секвенированию до 48 образцов за 5 дней с ограниченным практическим временем по сравнению с ручными экспериментами ChIP-Seq. Другим преимуществом является повышенная воспроизводимость, поскольку ChIP-Seq может быть трудно получить высоковоспроизводимые результаты. Другие методы либо требуют живых клеток, сложных систем микропипетирования, либо работы, которые должны быть выполнены вручную. Эта система должна быть оптимизирована для образцов с низким входом (<10 000 клеток), что в конечном итоге позволит проводить одноэлементные chIP-реакции. Система также может быть адаптирована для новых методов ChIP, таких как PLAC-Seq и HiChIP22,23.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Pandurangan Vijayanad
to:
Pandurangan Vijayanand

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.

Erratum: A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61617/a-semiautomated-chip-seq-procedure-for-large-scale-epigenetic-studies">A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies</a>. An&#160;author&#39;s name&#160;was&#160;updated.
The name was corrected from:
Sara Herrera-da&#160;la Mata
to:
Sara Herrera-de la Mata

Широкое применение анализов ChIP-Seq для определения фрагментов ДНК, связанных со специфическими модификациями гистонов, отчасти обусловлено его способностью идентифицировать цис-регуляторные элементы ДНК, включая активные энхансеры, промоторы, глушители, гетерохроматин и другие1,2,3,4. Идентификация некодирующих регуляторных областей по всему геному показала ценную информацию для лучшего понимания регуляции генов в здоровье и заболеваниях4. Предыдущая работа лаборатории использовала ChIP-Seq, чтобы показать, чтоцис-регуляторныеэлементы могут играть важную роль в различных типах клеток5. Анализы транскрипционного фактора (TF) ChIP были использованы для демонстрации связанных с заболеванием рисков однонуклеотидных полиморфизмов6.
Использование ChIP-Seq с клиническими образцами человека является сложной задачей, в основном из-за ограничения количества клеток или желаемого образца ткани. В результате в этой области были предприняты согласованные усилия по улучшению и микромасштабированию этих методов, и в результате появилось несколько анализов, таких как CUT & TAG5,7,8,9,10,11,12. Этот анализ использует транспозазу для маркировки и выделения геномных областей, связанных специфическим антителом9. Этот метод смог уменьшить количество клеток до 1000 и в некоторых случаях до одной клетки, однако использование этого метода в трансляционных исследованиях и клинической установке показало ограничения из-за требований использования живых клеток для этого метода9,12. Требование живых клеток делает клинические образцы логистически трудными для обработки и может привести к пакетным эффектам, если образцы не обрабатываются одновременно. Другие оптимизировали микромасштабируемые методы для клеток, фиксированных формальдегидом, включая разработку ChIPmentation11,которая адаптирована здесь с высокой пропускной способностью. Использование фиксированных ячеек позволяет хранить образцы до сбора и последующей обработки всех образцов вместе, чтобы свести к минимуму эффекты пакетов.
Здесь описан полуавтоматизированный микромасштабированный анализ ChIP-Seq, который сокращает экспериментальное практическое время для профилирования модификаций гистонов10. Полуавтоматизированный метод позволяет проводить высокопроизводительные анализы ChIP-Seq, что позволяет полностью обработать и подготовить к секвенированию до 48 образцов всего за 5 дней, всего за 10 000 клеток на образец с использованием жидкостного обработчика ChIP. Обработчик завершает иммунопреципитацию (IP) и последующую промывку автономным образом, что помогает уменьшить изменчивость между образцами. Полуавтоматизированный метод сокращает как практическое время более чем на 15 ч для 48 образцов, так и техническую изменчивость, что позволяет проводить крупномасштабные эпигенетические исследования воспроизводимым и быстрым образом для первичных или культивируемых клеток. Протокол объясняет процесс от начала до конца для высококачественного ChIP-Seq. Если конкретные машины недоступны, протокол по-прежнему будет полезным ресурсом для настройки и устранения неполадок в экспериментах ChIP-Seq вручную.
Анализ проводился с тремя различными типами первичных иммунных клеток человека и одной культивируемой клеточной линией (HUT78 – ATCC: TIB-161). Для ясности протокол был разделен на семь разделов: фиксация клеток, сдвиг хроматина с помощью ультразвука, автоматизированная иммунопреципитация хроматина, подготовка библиотеки путем тегментации фрагментов ДНК, амплификация библиотеки, очистка библиотеки с последующей количественной оценкой ДНК. Для буферных рецептов, пожалуйста, обратитесь к Дополнительной таблице 1.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="950">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">200 &#181;l tube strips (8 tubes/strip) + cap strips</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020002</td>
			<td style="width:288px;">Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">AMPure XP for PCR Purification</td>
			<td style="width:127px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:119px;">A63880</td>
			<td>SPRI beads</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:416px;">Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube</td>
			<td style="width:127px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td>0.65 mL low binding tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Bioruptor Pico Sonicator</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B01060010</td>
			<td>Sonicator used in the lab but others can be used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ChIP DNA Clean &#38; Concentrator (Capped Columns)</td>
			<td style="width:127px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:119px;">D5205</td>
			<td>DNA clean-up kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">10001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9260G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA pH 8.0</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E3889-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Eppendorf ThermoMixer C</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">2231000667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formaldehyde solution</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>252549-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Glycine</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">50046-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">H3K27ac polyclonal antibody - Premium</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C15410196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">HEPES (1 M) pH 7.5</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20027213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit</td>
			<td style="width:127px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;">20034197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">IP-Star Compact Automated System</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">B03000002</td>
			<td>Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td>
			<td style="width:127px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">KK2601</td>
			<td>PCR mix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30020003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">R0971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D4551-250ML</td>
			<td>CAUTION - low flash point</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl (5 M), RNase-free</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">70011044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps</td>
			<td style="width:127px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1402-4700</td>
			<td style="width:288px;">8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P8340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">25530049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">PureLink RNase A (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12091021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">P7581</td>
			<td>Used in the flourescence quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">4485699</td>
			<td>qPCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">ROX Reference Dye</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12223012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Sodium butyrate</td>
			<td style="width:127px;">Millipore Sigma</td>
			<td style="width:119px;">303410-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S11494</td>
			<td>nucleic acid dye</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:416px;">SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain - 10,000X concentrate in DMSO</td>
			<td style="width:127px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">S7563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">TE Buffer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">Tips (bulk)</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30040020</td>
			<td>Tips for the IP Star</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">True MicroChIP Kit</td>
			<td style="width:127px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C01010130</td>
			<td>Contains all the buffers for the IP; ChIP kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15568025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:416px;">UltraPure SDS Solution, 10%</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">24730020</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a semiautomated chip-seq procedure for large-scale epigenetic studies

Иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием (ChIP-Seq) является мощным и широко используемым подходом к профилированию ДНК хроматина, связанного со специфическими модификациями гистонов, такими как H3K27ac, чтобы помочь идентифицировать цис-регуляторные элементы ДНК. Ручной процесс завершения ChIP-Seq является трудоемким, технически сложным и часто требует большого количества клеток (>100 000 клеток). Метод, описанный здесь, помогает преодолеть эти проблемы. Подробно описана полная полуавтоматизированная, микромасштабированная процедура H3K27ac ChIP-Seq, включающая фиксацию клеток, сдвиг хроматина, иммунопреципитацию и подготовку библиотеки секвенирования, для партии из 48 образцов для ввода количества клеток менее 100 000 клеток. Полуавтономная платформа снижает техническую изменчивость, улучшает соотношение сигнал/шум и значительно сокращает трудозатраты. Таким образом, система может снизить затраты, позволяя уменьшить объемы реакции, ограничивая количество дорогостоящих реагентов, таких как ферменты, магнитные шарики, антитела и требуемое практическое время. Эти усовершенствования метода ChIP-Seq идеально подходят для крупномасштабных эпигенетических исследований клинических образцов с ограниченным количеством клеток в высоко воспроизводимым способом.

Watch this Scientific Journal Video about A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies at JoVE.com

A Semiautomated ChIP-Seq Procedure for Large-scale Epigenetic Studies

В этой статье описывается полуавтоматизированный, микромасштабированный протокол ChIP-Seq областей ДНК, связанных с конкретной модификацией гистонов (H3K27ac) с использованием платформы обработки жидкости ChIP, с последующей подготовкой библиотеки с использованием тегментации. Процедура включает в себя контрольную оценку для целей качества и количества и может быть принята для других модификаций гистонов или факторов транскрипции.

Полуавтоматизированная процедура ChIP-Seq для крупномасштабных эпигенетических исследований

Chromatin immunoprecipitation followed by sequencing (ChIP-Seq) is a powerful and widely used approach to profile chromatin DNA associated with specific ...

Research

JoVE Journal

Biology

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Крупномасштабная Экраны метагеномных библиотеки

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Batch Immunostaining for Large-Scale Protein Detection in the Whole Monkey Brain

Пакетный Иммуноокрашивание крупномасштабных белка Обнаружение в весь мозг обезьяны

Immunohistochemistry (IHC) is one of the most widely used laboratory techniques for the detection of target proteins in situ. Questions concerning the ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

Выделение и расширение добычи взрослых человеческих эндотелиальных клеток, образующих колонии Прародитель

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Мутагенеза и функционального анализа ионных каналов Heterologously Выраженный в клетках млекопитающих

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Large Scale Zebrafish-Based In vivo Small Molecule Screen

Крупномасштабные данио рерио основе В естественных условиях Малый экран Молекула

Given their small embryo size, rapid development, transparency, fecundity, and numerous molecular, morphological and physiological similarities to ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

Генерация высших шаблона ДНК хроматина Качество Иммунопреципитация для высокопроизводительного секвенирования (чип-след)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Infinium Анализ на крупномасштабных SNP генотипирования приложений

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

A Strategy for Sensitive, Large Scale Quantitative Metabolomics

Стратегия для чувствительной, крупномасштабного Количественные Metabolomics

Metabolite profiling has been a valuable asset in the study of metabolism in health and disease. However, current platforms have different limiting ...

Automating ChIP-seq Experiments to Generate Epigenetic Profiles on 10,000 HeLa Cells

Автоматизация чип-след эксперименты для генерации эпигенетические профили на 10000 клеток HeLa

Chromatin immunoprecipitation followed by next generation sequencing (ChIP-seq) is a technique of choice for studying protein-DNA interactions. ChIP-seq ...