Name: a model membrane platform for reconstituting mitochondrial membrane dynamics
Uploaded: 2020-09-02T15:00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics at JoVE.com

De auteurs erkennen de steun van Charles H. Hood Foundation Child Health Research Award en genereuze steun van het Department of Molecular Biology in het Massachusetts General Hospital.

1. Bereiding van lipidemengsels
<ol><li>Bereid een lipideeroplossing voor door 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3phosphocholine (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfofenthanolamine (PAUS), L-α-fosfatidylinositol (Lever PI), cardiolipine, en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfosfolfamine-N-[methoxy(polyethyleenglycol)-2000] (18:1 PEG2000 PE) in chloroform bij concentratie van 25 mg/mL. Los fluorescerende kleurstof-geconjugeerde lipiden (TexasRed DHPE en Cy5 DOPE) chloroform op bij een concentratie van 1 mg/mL. Bewaar de lipideoplossing in oranje flacons met chloroform resistente voering, verder afgesloten met polytetrafluorethyleentape. De oplossing kan maximaal 6 maanden op -20 °C worden gehouden.</li>
	<li>Maak oplossingen A en B.<ol>
<li>Meng lipide om oplossing A (laatste concentratie 1 mg/mL) voor te bereiden die DOPC (52,8 mol), POPE (20 mol%), Lever PI (7 mol%) bevat en cardiolipine (20 mol%), en 0,2 mol% fluorofolaat.</li>
		<li>Maak oplossing B (eindconcentratie 1 mg/mL) met DOPC (47,8 mol%), POPE (20 mol%), lever PI (7 mol%), cardiolipine (20 mol%) en DOPE-PEG2000 (5 mol%), en 0,2 mol% fluorofophore.</li>
		<li>Genereer het lipidemengsel door het berekende volume van de opslagoplossing toe te voegen aan oranje flacons met behulp van een glazen spuit. Match het uiteindelijke volume door extra chloroform toe te voegen aan de flesjes. OPMERKING: Voor FCS (fluorescentie correlatie spectroscopie), verlaag de verhouding van kleurstof geconjugeerde lipide tot 0,002 mol% en vervang de rest door DOPC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Fabricage van lipide bilayers
<ol><li>Bak de microscoop af met glazen platen op 520 °C gedurende 30 minuten. Na het bakken koelt u de afdekking naar kamertemperatuur.</li>
	<li>Weeg ongeveer 10 g natriumhydroxide af en voeg tijdens het roeren toe aan 500 mL methanol. Roer gedurende 2 uur, blijven natriumhydroxide toe te voegen in de oplossing totdat neerslag beginnen te laten zien. Zorg ervoor dat u tijdens het hele proces de juiste BESCHERMINGSMIDDELEN draagt.</li>
	<li>Reinig de glazen platen in 10% natrium dodecylsulfaatoplossing; methanol verzadigd met natriumhydroxide; en 50 mM zoutzuur, sequentieel (bad sonicatie onder elke voorwaarde gedurende 30 min). Reinig de glazen glijbaan in ultrazuiver water gedurende 10 minuten tussen elke voorwaarde. OPMERKING: Hoewel het sterk wordt aanbevolen om nieuwe oplossingen te gebruiken voor de voorbereiding van glazen schuif, kan elke oplossing tot 5x of binnen 1 maand worden hergebruikt, wat het eerst komt. Zorg ervoor dat u de oplossing voor elk gebruik roer-mengt.</li>
	<li>Bewaar het gereinigde afdekglas verzegeld in HCl-oplossing tot 2 weken om een goede bilayer kwaliteit te garanderen. Als u in ultrazuiver water wordt opgeslagen, gebruikt u de glijbanen binnen een week.</li>
	<li>Reinig de polytetrafluorethyleentrog van het Langmuir-Blodgett dompelen systeem met behulp van chloroform en ultrazuiver water totdat er geen bevochtiging wordt waargenomen op de trog. Spray chloroform op het trogoppervlak, veeg grondig met cellulose doekjes 3x. Spoel af met ultrazuiver water en verwijder het water via zuigkracht. Herhaal 3x.</li>
	<li>Bedek het oppervlak van de trog met schoon ultrazuiver water.</li>
	<li>Neem 2 stukken oppervlaktebehandeld afdekglas uit reinigingsoplossing of ultrazuiver water en spoel de glazen glijbaan af met ultrazuiver water voor ongeveer 30 s.</li>
	<li>Plaats het dekglas op een back-to-back manier. Gebruik de substraatklem om de glazen glijbanen vast te houden. Dompel de glazen schuif onder het wateroppervlak door handmatig op "dipper down" te klikken op de Langmuir besturingssoftware.</li>
	<li>Nul de film balans, zorgvuldig verspreiden Solution B druppel voor druppel op de lucht-water interface (Figuur 2A). Zorg ervoor dat lipiden zich alleen verspreiden op de luchtwaterinterface, zonder chloroforme en lipidedruppels die naar de bodem van het polytetrafluorethyleenoppervlak zinken.  Als u dit niet zeker maakt, ontstaat een lipide "kanaal" en voorkomt u monolaagvorming.</li>
	<li>Stop met het toevoegen van lipiden tot filmbalans uitlezing rond ~ 15-20 mN / m, wacht op ~ 10-15 min. Start de barrièrecontroller om het oppervlak te wijzigen door op "startexperimenten" te klikken, tot de uitlezing van de filmbalans tot 37 mN/m. Houd de druk voor ~ 20-30 min (Figuur 2B).</li>
	<li>Hef het afdekglas met een snelheid van 22 mm/min terwijl de oppervlaktespanning op 37 mN/m blijft. Een lipidemonolaag met polymeertethering wordt overgebracht van de luchtwaterinterface naar het oppervlak van dekglas door het Blodgett-dipproces(figuur 2C). Dit vormt de onderste bijsluiter van de lipide bilayer.</li>
	<li>Reinig de luchtwaterinterface door zuigkracht, spoel de trog af met ultrazuiver water.</li>
	<li>Maak een eenputeerglasplaat (bijvoorbeeld Shaefer-schuif) schoon met chloroform, ethanol en ultrazuiver water voor gebruik. Zet de schone glazen glijbaan op de trog met ultrazuiver water onder de waterlaag. Zorg ervoor dat de put naar boven gericht is in de richting van de luchtwaterinterface en giet vers ultrazuiver water totdat de glazen glijbaan volledig bedekt is. Herhaal stap 2.8.</li>
	<li>Houd het dekselglas met lipidemonolaag van stap 2.4 met behulp van een siliconen zuignap (zorg ervoor dat monolayer kant is uit de buurt van de zuignap), duw voorzichtig de lipide monolayer naar de lucht-water interface, houd de cover glas voor ~ 2-3 s op de interface, duw dan de cover glas tegen de glijbaan(Figuur 2D). Neem de glijbaan met een cover slide. OPMERKING: De lipidebilayer wordt gehouden aan het oppervlak van het afdekglas met uitzicht op het ingeklemde gebied tussen de twee glijbanen(figuur 2E).</li>
	<li>Neem het dekglas met de bilayer aan een epifluorescentiemicroscoop. Beeld de lipide bilayer. Als een homogene verdeling van lipide kleurstof wordt waargenomen, photobleach een klein gebied van de bilayer voor 30 s, schakel de lichtbron voor ~ 30 s-1 min., dan beeld weer om herstel te observeren. Lipide bilayer zal fluorescentie herstel vertonen. OPMERKING: Membranen met defecten of slecht fluorescentieherstel mogen niet worden gebruikt voor verdere experimenten.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig2v2.jpg"> Figuur 2: Stappen in het maken van een polymeer-vastgebonden lipide bilayer. Stappen van het maken van lipide bilayers met behulp van Langmuir-Blodgett dompelen (A-C) en Langmuir-Schaefer overdracht(D)technieken. (E) De laatste "sandwich" met de lipide bilayer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
3. Eiwitconstitutie in de polymeer-gebonden lipide bilayer
<ol><li>Bereid een kristallisatieschotel met ultrazuiver water. Bereid een schone microscoop beeld ring en plaats onder de schotel.</li>
	<li>Dompel de "sandwich" van de Schaefer glijbaan en cover glas dat lipide bilayer onder het water bevatten, voorzichtig scheiden van de Schaefer glijbaan en deksel glas, houd de cover glas glijbaan van de bodem, uit de buurt van de bilayer kant, breng de cover glas in de afbeelding ring, sluit de afbeelding ring. LET OP: Zorg ervoor dat het afdekglas met lipide bilayer altijd in het water is en de ring goed is afgesloten.</li>
	<li>Vervang het ultrazuivere water in de beeldring door bis-Tris NaCl buffer, zorg ervoor dat de lipide bilayer niet wordt blootgesteld aan luchtbellen. Voeg 1,1 x 10-9 M n-Octyl-β-D-Glucopyranoside toe aan de lipide bilayer. Voeg onmiddellijk het mengsel van 1,2 x 10-9 M DDM en 1,3 x 10-12 mol gezuiverde l-Opa136 toe aan de beeldring. Incubeer monster op een benchtop shaker bij lage snelheid voor 2 uur (Figuur 3). LET OP: Detergenten kunnen variëren afhankelijk van het te reconstrueren eiwit.</li>
	<li>Verdeel 30 mg SM-2 Hars kralen in 3 mL van Bis-Tris buffer en schudden voordat u het aanbrengt. Gebruik een plastic pipet om 5 ~ 10 μL SM-2 Hars kralen toe te voegen aan de afbeelding ring, incubeer gedurende 10 min, verwijder hars kralen door spoelen. Het uiteindelijke volume van de buffer in de afbeeldingsring is 1,5 mL.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig3v2.jpg"> Figuur 3: Procedure voor het reconstrueren van l-Opa1 tot een polymeer-gebonden lipide bilayer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
4. Bereiding van proteoliposomen
<ol><li>Bereid 1 mg lipidemengsel A in chloroforme oplossing. Verdamp chloroform onder stikstofstroom gedurende 20 min en houd 's nachts vacuüm en vorm een lipidefilm.</li>
	<li>Bereid 50 mM calceïne met buffer door het oplossen van 15,56 g calceine tot 50 mL van 1,5 mol NaOH oplossing, roer bij kamertemperatuur tot calceine volledig is opgelost, toegevoegd 12,5 mM Bis-Tris en ultrazuiver water aan het uiteindelijke volume van 500 mL. Pas de pH aan op 7,5.</li>
	<li>Hang lipidefilm in calceine met buffer op, hydrateer de lipide volledig door de suspensie op 65 °C gedurende 20 min. 200 nm liposomen te verwarmen door middel van extrusie met behulp van een polycarbonaatmembraan.</li>
	<li>Voeg 2 μg l-Opa1 toe in 0,5 μM DDM tot 0,2 mg liposoom en incubeer bij 4 °C gedurende 1,5 uur. Verwijder de oppervlakteactieve agent door dialyse met behulp van een 3,5 kDa dialysecassette tegen 250 ml van 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl en 50 mM calceïnebuffer bij 4 °C 's nachts, het veranderen van de buffer tweemaal.</li>
	<li>Verwijder extra calceine met behulp van een PD-10 desalting kolom.</li>
</ol>5. Beeldvorming en data-analyse
<ol><li>Verwerf TIRF-afbeeldingen met behulp van een doelstelling van 100x olieonderdompeling (N.A 1.4). Gebruik 543 nm laser en een 488 nm laser voor de analyse van TexasRed-PE gelabelde liposomen en proteoliposomes ingekapseld met calcein. Gebruik een 633 nm laser voor de analyse van Cy5-PE ingebed in de vlakke lipide bilayer.</li>
	<li>Lijn de TIRF-hoek uit met behulp van een lipidebilayer om maximale uitstoot te verkrijgen. De kwaliteit van lipide bilayer na reconstitutie wordt waargenomen met behulp van een 100x olie doelstelling bij 25 °C. De diffusiecoëfficiënt van fosfolipiden en gereconstitueerde bilayer wordt bepaald met behulp van FCS met een protocol dat eldersbeschreven 37.</li>
	<li>Voeg 10 μL van 2 mg/mL proteoliposomen toe aan de beeldring en stel 10 minuten voor de afbeelding in. GTP, GMPPCP of BBP worden toegevoegd aan de reactiering met 1 mM MgCl2 en 1 mM nucleotide.</li>
	<li>Om de invloed van s-Opa1 in membraanfusie te bepalen, titreer s-Opa1 in een proteoliposome/ondersteund bilayer monster met l-Opa1, en neem fusiegebeurtenissen op.</li>
	<li>Gelijktijdige beeldvorming van TexasRed-DHPE en calcein wordt bereikt door middel van een bundel-splitsing systeem. Zowel 488 nm als 543 nm lasers worden gelijktijdig op het monster aangebracht als flourescent excitatiebronnen. Het emissielicht wordt vervolgens verdeeld met behulp van een 560 nm bundelspl splitter. Het split emissie licht wordt dan gefilterd door een 510 nm filter met een bandbreedte van 42 nm en een 609 nm filter met een bandbreedte van 40 nm. De gefilterde straal wordt geprojecteerd op twee aangrenzende gebieden op de camerachip.</li>
	<li>Fluorescerende emissie wordt tegelijkertijd geregistreerd door middel van een 609-emissiefilter met een bandbreedte van 40 nm en een 698-emissiefilter met een bandbreedte van 70 nm. Het microscoopsysteem is uitgerust met een CMOS-camera die bij -10 °C wordt onderhouden.</li>
	<li>Deeltjesidentificatie van de liposomen kan worden uitgevoerd met behulp van een op Gaussian gebaseerd deeltjesherkenningsalgoritme. De deeltjesverdeling en intensiteit worden per kanaal geanalyseerd. Een lipide bilayer signaal wordt gebruikt als een masker om deeltjes te isoleren.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sackmann, E., Lipowsky, R., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+membranes+architecture+and+function.">Biological membranes architecture and function.</a> Structure and Dynamics of Membranes. 1, 1-63 (1995).</li><li>Rajendran, L., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+membrane+dynamics.">Lipid rafts and membrane dynamics.</a> Journal of Cell Science. 118, 1099-1102 (2005).</li><li>Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositides+in+Control+of+Membrane+Dynamics.">Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).</li><li>Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglioside-Lipid+and+Ganglioside-Protein+Interactions+Revealed+by+Coarse-Grained+and+Atomistic+Molecular+Dynamics+Simulations.">Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations.</a> Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).</li><li>Schafer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+actin+dynamics+and+membrane+dynamics+during+endocytosis.">Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).</li><li>Chan, Y. H., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Biswas, K. H., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Live+Cell-Supported+Membrane+Interfaces+for+Signaling+Studies.">Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies.</a> Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).</li><li>Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Assays+Using+Liposomes+and+Cell-Derived+Vesicles:+From+Modeling+Complex+Membrane+Processes+to+Synthetic+Biology+and+Biomedical+Applications.">Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).</li><li>Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+SNARE-mediated+vesicle+fusion+observed+in+vitro+by+polarized+TIRFM.">Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM.</a> Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).</li><li>Kiessling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fusion+of+synaptic+vesicles+with+reconstituted+target+SNARE+membranes.">Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes.</a> Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).</li><li>Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+tension+at+lipid+phase+boundaries+as+driving+force+for+HIV+fusion+peptide-mediated+fusion.">Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion.</a> Nature Communication. 7, 11401 (2016).</li><li>Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+fusion+observed+by+content+transfer+across+a+tethered+lipid+bilayer.">Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).</li><li>Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+conformational+rearrangements+in+flavivirus+membrane+fusion.">Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion.</a> Elife. 3, 04389 (2014).</li><li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions.">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li><li>Sezgin, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+platforms+to+study+protein-membrane+interactions.">Model membrane platforms to study protein-membrane interactions.</a> Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).</li><li>Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cholesterol+Level+Alter+Integrin+Sequestration+in+Raft-Mimicking+Lipid+Mixtures.">Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).</li><li>Dutta, D., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned,+multicomponent+supported+lipid+bilayers+for+cellular+systems.">Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems.</a> Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).</li><li>Groves, J., Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Lipid+Bilayers+as+Mimics+for+Cell+Surfaces+and+as+Tools+in+Biotechnology.">Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology.</a> BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. , (2006).</li><li>Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+Morphology,+Diffusivity,+and+Indentation+of+Hydrogel-Supported+Lipid+Bilayers.">Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).</li><li>Wang, N., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+reticular+ER+network+-+mechanistic+implications+and+open+questions.">Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+and+fission:+interlinked+processes+critical+for+mitochondrial+health.">Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health.</a> Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wai, T., Langer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Metabolic+Regulation.">Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation.</a> Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).</li><li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+cell+life+and+death.">Mitochondrial fusion and fission in cell life and death.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusins+Mfn1+and+Mfn2+coordinately+regulate+mitochondrial+fusion+and+are+essential+for+embryonic+development.">Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development.</a> Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).</li><li>Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+morphology+through+proteolytic+cleavage+of+OPA1.">Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1.</a> EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).</li><li>Anand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+i-AAA+protease+YME1L+and+OMA1+cleave+OPA1+to+balance+mitochondrial+fusion+and+fission.">The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission.</a> Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).</li><li>Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+of+Opa1+stimulates+mitochondrial+inner+membrane+fusion+and+couples+fusion+to+oxidative+phosphorylation.">Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation.</a> Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).</li><li>Baker, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+OMA1+activation+and+autocatalytic+turnover+regulate+OPA1-dependent+mitochondrial+dynamics.">Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics.</a> EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).</li><li>DeVay, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coassembly+of+Mgm1+isoforms+requires+cardiolipin+and+mediates+mitochondrial+inner+membrane+fusion.">Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion.</a> Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).</li><li>Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Degradation+of+YME1L+and+OMA1+Adapts+Mitochondrial+Proteolytic+Activity+during+Stress.">Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress.</a> Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).</li><li>Ban, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+selective+mitochondrial+fusion+by+heterotypic+action+between+OPA1+and+cardiolipin.">Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).</li><li>Tanaka, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-supported+membranes+as+models+of+the+cell+surface.">Polymer-supported membranes as models of the cell surface.</a> Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).</li><li>Shilts, K., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+cell-surface+mimetics+as+engineered+cell+substrates.">Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates.</a> Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).</li><li>Ge, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+Opa1+cooperate+to+complete+fusion+of+the+mitochondrial+inner-membrane.">Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane.</a> Elife. 9, 50973 (2020).</li><li>Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+alters+dimerization+and+sequestering+of+urokinase+receptors+in+raft-mimicking+lipid+mixtures.">Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems,+lipid+rafts,+and+cell+membranes.">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).</li><li>Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+SNARE-mediated+membrane+fusion+at+the+single+liposome+level.">Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level.</a> Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).</li><li>Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+ligands+change+integrin+sequestering+but+not+oligomerization+in+raft-mimicking+lipid+mixtures.">Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures.</a> Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).</li></ol>

In vitro model-membraansystemen kunnen complexe membraanprocessen beschrijven onder welomschreven omstandigheden. Deze systemen kunnen minimale componenten onderscheiden die nodig zijn voor complexe moleculaire processen om moleculaire mechanismen6,15,20,38te onthullen . Voor membraaneiwitten zijn liposomen en vlakke ondersteunde bilayers veelvoorkomende reconstitutiesystemen. In tegenstelling tot solide ondersteunde lipidebilayers, maakt het polymeerkussen tussen het substraat en het ondersteunde membraan in polymeer-gebonden tweelagen vrije mobiliteit van grote membraaneiwitten mogelijk, en transmembranen-eiwitten om vrij te verspreiden en te assembleren34. Deze kenmerken hielpen ons bij het onderzoeken van de kinetiek van mitochondriën innermembraan fusie36.
We hebben een polymeer-gebonden lipide bilayer bereid met langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS) technieken. Dit stelt ons in staat om een bilayer met asymmetrische lipide componenten voor te bereiden. Cellulaire membranen hebben asymmetrische bijsluitersamenstelling, en de LB / LS-aanpak maakt de studie van dergelijke bilayers. Met Schaefer-overdracht kan een volledig glazen substraat worden afgedekt door een lipidebilayer. Het is van cruciaal belang om een schoon oppervlak voor te bereiden voor de voorbereiding van de tweelaags. Daarnaast is de praktijk nodig om een Schaefer-overdracht correct uit te voeren. Mislukte Schaefer overdracht kan leiden tot ongewenste gebreken in een lipide bilayer. In dit protocol is de druk die wordt toegevoegd aan de filmbalans van toepassing op een bilayer met 20% cardiolipin. Voor bilayers met andere componenten, verwijzen naar het oppervlak druk-gebied isotherm van de belangrijkste componenten. Een alternatieve methode is de Langmuir-Blodgett/vesicle fusion (LB/VF) methode, waarbij de onderste lipide monolayer wordt overgebracht van de luchtwaterinterface van een Langmuir-trog op een schoon substraat, dan fusemen liposomen naar de bovenkant van de ondersteunde lipidemonolaag en de uiteindelijke bilayer39vormen. Reconstitutie van membraaneiwitten met behulp van de LB/VF-methode is eenvoudiger dan LB/LS, omdat reconstitutie kan worden uitgevoerd door de fusie van proteoliposomen. Echter, vesicle fusie vereist de toevoeging van overtollige liposomen, die de studie van membraan gebeurtenissen afhankelijk van concentratie-afhankelijke eiwit-eiwit interacties kan bemoeilijken.
De succesvolle reconstructie van transmembrane eiwitten in zowel polymeer-vastgebonden lipide bilayers en liposomen in een voorkeur functionele oriëntatie is belangrijk, maar moeilijk af te dwingen. Hiervoor zijn experimentele controles nodig. Voor polymeer-gebonden lipide bilayers, is het ook belangrijk om de integriteit van lipide bilayer tijdens de reconstitutie te behouden. Oppervlakteactieve concentraties moeten relatief laag worden gehouden om te voorkomen dat de lipide bilayer wordt opgelost, maar hoog genoeg om denaturatie van het eiwit van belang37,40te voorkomen . De hier beschreven methode is ideaal voor het reconstrueren van membraaneiwitten voor studies met één molecuul, maar is niet noodzakelijkerwijs schaalbaar voor grootschaligere studies. Surfactant keuze is een andere belangrijke overweging. Vaak is de oppervlakteactieve stoffen die worden gebruikt voor zuivering en opslag een goed uitgangspunt. De maximale concentratie van oppervlakteactieve stoffen is meestal ~200 keer minder van de CMC36, in een bereik waar de oppervlakteactieve stoffen eiwitstabiliteit behoudt en eiwitaggregatie voorkomt, met behoud van de integriteit van membraan36. Cocktails met 2 of 3 oppervlakteactieve stoffen kunnen in aanmerking worden genomen. Voor reconstitutie in liposomen is een lage concentratie oppervlakteactieve stoffen niet nodig. Oppervlakteactieve concentraties onder CMC hebben echter de voorkeur om een uniforme grootte en morfologieverdeling voor de liposomen te behouden. Om lekkage van inhoudskleurstof te voorkomen, is het noodzakelijk om te dialyseren tegen een kleurstofhoudende buffer.
In tegenstelling tot liposoom-gebaseerde fusietesten, biedt het platform dat we hebben opgezet een aanpak om de kinetiek van elke stap van membraanfusie te onderzoeken. Deze methode biedt de mogelijkheid om transmembrane fusie-eiwitten te bestuderen onder bijna-inheemse omstandigheden. Modelmembraanplatforms kunnen worden toegepast om membraaneiwitassemblage en oligomerisatie, membraan "beeldhouwen" en eiwitlipide interacties van eiwitten in subcellulaire omgevingen te bestuderen, zoals het mitochondriale binnenmembraan. Deze methode maakt het ook mogelijk om belangrijke fysiologische omstandigheden in het membraan-eiwit samenspel te verkennen, zoals bilayer samenstelling asymmetrie. De rol van een belangrijke mitochondriale lipide, cardiolipine, in de bilayer-eigenschappen van zowel liposomen als polymeerondersteunde bilayers moet nog worden gedefinieerd. Eigenschappen zoals de ionische sterkte, membraandikte, membraanstijfheid, membraankromming en membraan-viscositeit eigenschappen kunnen allemaal invloed hebben op het vermogen van eiwitten om te assembleren in specifieke functionele toestanden. Toekomstige studies creatief toepassen modelmembraan systemen hebben potentieel om nieuwe aspecten van membraan eiwit organisatie en functie te ontdekken.

Membraancompartimentering is een kenmerk van eukaryotische cellen1 (figuur 1A). Biologische membranen worden steeds meer erkend als meer dan een tweedimensionaal oplosmiddel en worden beschouwd als een omgeving die een cruciale rol speelt bij het reguleren van de eiwitfunctie en het macromoleculaire complex assemblage2,3. Inheemse lipiden zijn liganden die membraaneiwitactiviteit3,4reguleren. Membraan ruimtelijke organisatie en het vermogen van membranen te worden gebeeldhouwd in diverse vormen zijn belangrijke fysieke eigenschappen voor het selecteren van nieuwe functies3,5.
Modelmembraanplatforms zijn biomimetische systemen die ons kunnen helpen de structuur, dynamiek en,functie6,7,8te begrijpen. Modelmembranen bestaan meestal uit een lipidemengsel van goed gedefinieerde samenstelling, met gedefinieerde biofysische eigenschappen (stijfheid, dikte en elasticiteit). In combinatie met fluorescentiebeeldvorming maken modelmembraanplatforms kwantitatieve analyse van de membraanstructuur en functie9,10,11mogelijk . Lipide bilayer reconstitutie strategieën zijn gebruikt om SNARE-gemedieerde membraan fusie9,10, DNA-gemedieerde membraan fusie12, en virale fusie11,13te bestuderen . Een voordeel van dergelijke methoden is het potentieel om kinetische informatie te verkrijgen voor tussenstappen voorafgaand aan een waarneembare reactiegebeurtenis14.
Het plasmamembraan is uitgebreid bestudeerd met behulp van modelmembranen. Bilayers met lipide fase scheiding zijn ontwikkeld om lipide vlot structuren belangrijk in cellulaire signalering11,15,16studie . Micropatterned lipide planaire bilayers17,18 zijn gebruikt om de organisatie van celreceptoren te onderzoeken. Polymeer of gel-ondersteunde membranen zijn gebruikt als biomimetische systemen om de membraan-cytoskelet organisatie, membraan eiwit partitionering tijdens celsignalering, en migratie bij cel-cel contacten19te bestuderen.
Kunstmatige membraansystemen worden ook toegepast om subcellulaire organellen te bestuderen20. Organelles hebben karakteristieke morfologieën die verschillende subomgevingen creëren. Het endoplasmatische reticulum (ER) netwerk is daar een voorbeeld van. Bij de reconstructie van reticulons in liposomen worden buisvormige membraanstructuren met eigenschappen die vergelijkbaar zijn met de cellulaire ER gevormd21. De toevoeging van atlastine, een ER fusion eiwit, kan lipide tubuli uit liposomen opwekken om een netwerk20te vormen. Dit is een voorbeeld voor hoe proteoliposomes functioneel inzicht kunnen geven in organellemorfologie en dynamiek.
Mitochondriale membraanfusie en splijting zijn essentieel voor de gezondheid van de mitochondriale bevolking22,23,24,25. Een set van dynamin familie GTPases katalyseert mitochondriën membraan fusie. Mfn 1/2 katalyseert buitenste membraanfusie. Opa1 bemiddelt binnenmembraanfusie26 (figuur 1B). Opa1 heeft twee vormen: een lange vorm (l-Opa1), transmembrane verankerd aan het mitochondriale binnenmembraan, en een 'oplosbare' korte vorm (s-Opa1), aanwezig in de intermembrane ruimte. De verhouding tussen de twee Opa1-formulieren wordt geregeld door de activiteit van twee proteasen, Oma1 en Yme1L27,28,29,30. Belangrijke vragen in de Opa1-verordening zijn onder meer: hoe de twee vormen van Opa1 , (korte en lange) bemiddelende membraanfusie en hun regelgevende samenspel28,29,31,32,33.
Hier beschrijven we een reconstitution strategie die met succes werd toegepast om mitochondriale binnenmembraanfusie te onderzoeken die de rol van l- en s-Opa1 in binnenmembraanfusie verduidelijkte. We ontwikkelden een platform dat het mitochondriale binnenmembraan nabootste met behulp van een polymeer-gebonden lipidebilayer en 200 nm unilamellar vluimen. De voordelen van een polymeer ketting onder de lipide bilayer omvatten de volgende. Ten eerste behoudt het het gereconstitueerde transmembrane-eiwit, dat anders zou kunnen worden verstoord door de nabijheid van de glazen schuif34. Ten tweede dient het een dikke waterlaag tussen de lipide bilayer en glassubstraat, die studies van porie opening9vergemakkelijkt , en ten derde de visco-elastische aard van de PEG polymeer maakt membraan kromming veranderingen35. We gebruikten driekleurige fluorescentiebeeldvorming om stappen in membraanfusie te karakteriseren(figuur 1C-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig1v2.jpg"> Figuur 1: Monitoring mitochondriale membraanfusie. (A) Organellen zijn cellulaire membraancompartimenten. (B) Sequentiële stappen van mitochondriale membraanfusie. Fusie van het buitenste membraan van mitochondriën wordt gekatalyseerd door Mfn1 en/of Mfn2, terwijl binnenmembraanfusie wordt bemiddeld door Opa1. (C-F) Schematisch van het in vitro reconstitution platform om mitochondriale membraanfusie te bestuderen. Het platform bestaat uit twee delen: een proteolisome en een polymeer-vastgebonden lipide bilayer, beide met gereconstitueerde l-Opa1. Fluorescerende etiketten, waaronder twee verschillende fluorescerende membraankleurstoffen en een inhoudsmarkering, helpen stappen te onderscheiden tijdens membraanfusie. De twee membraanmarkeringen (Cy5-PE (rood) en TexasRed PE (oranje) maken een FRET-paar, dat kan rapporteren over close membrane docking. Diffusie van TexasRed-PE dat etiketten proteoliposome is een indicator van lipide demixing (hemifusion). Content release wordt gecontroleerd door het dequenching van het calcein signaal (weergegeven in het groen). Panelen A en B gemaakt met biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5)</td>
			<td>Avanti polar lipid</td>
			<td>Cat #: 810335C1mg</td>
			<td>membrane fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 880130P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 710335P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850375P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850757P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A20181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial with PTFE liner</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-332</td>
			<td>sample vials to keep lipid solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>298-500/ C295-4</td>
			<td>Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slide (1 well)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71878-05</td>
			<td>applied as Schaefer Slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS analysis tool</td>
			<td>Smith Lab, University of Akron</td>
			<td></td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji /ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>SCR_002285</td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP Disodium salt</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>Cat #: 10106399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langmuir &#38; Langmuir-Blodgett Trough</td>
			<td>Biolin Scientifc</td>
			<td>KN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850091P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat #: D310 25 GM</td>
			<td>surfactant for reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#945;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat #: O311HA 25 GM</td>
			<td>surfactant for reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC Membranes 0.2&#956;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Opa1 antibody</td>
			<td>NOVUS BIOLOGICALS</td>
			<td>Cat #: NBP2-59770</td>
			<td>antibody for Opa1 C-terminal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>Intelligent imaging</td>
			<td>RRID: SCR_014300</td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon threaded seal tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0636085</td>
			<td>taflon tape for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat #: T1395MP</td>
			<td>membrane fluorescent markers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model membrane platform for reconstituting mitochondrial membrane dynamics

Mitochondriale dynamiek is essentieel voor de diverse functies en cellulaire reacties van de organelle. Het overvolle, ruimtelijk complexe, mitochondriale membraan is een uitdagende omgeving om regelgevende factoren te onderscheiden. Experimentele controle van eiwit- en lipidecomponenten kan helpen bij het beantwoorden van specifieke reguleringsvragen. Toch is kwantitatieve manipulatie van deze factoren een uitdaging in cellulaire testen. Om het moleculaire mechanisme van mitochondriën binnenmembraanfusie te onderzoeken, introduceerden we een in vitro reconstitution platform dat de lipide omgeving van het mitochondriale binnenmembraan nabootst. Hier beschrijven we gedetailleerde stappen voor het voorbereiden van lipide bilayers en het reconstrueren van mitochondriale membraaneiwitten. Het platform stond analyse van tussenproducten in mitochondriale binnenmembraanfusie en de kinetiek voor individuele overgangen toe, op een kwantitatieve manier. Dit protocol beschrijft de fabricage van bilayers met asymmetrische lipide samenstelling en beschrijft algemene overwegingen voor het reconstrueren van transmembrane eiwitten in een gedempte bilayer. De methode kan worden toegepast om andere membraansystemen te bestuderen.

Het gereconstitueerde transmembrane eiwit verspreidt zich vrij en wordt homogeen verdeeld in het membraan.
Voorbeeldafbeeldingen van een lipidebilayer en de lipidevloeibaarheid die wordt gevalideerd door epifluorescentiemicroscopie wordt weergegeven in figuur 4. Lipideverdeling in bilayer voor en na fotobleaching wordt weergegeven in figuur 4A,B. Homogeniteit van de lipide bilayer werd gevisualiseerd met behulp van een epifluorescentie microscoop voor en na de reconstructie (Figuur 4D,E). l-Opa1 gereconstitueerd in lipide bilayer werd gevalideerd door fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS). We gebruiken verf geconjugeerde lipiden om de lipide diffusiviteit van de bilayer te evalueren. Gereconstitueerd Opa1 werd gelabeld met behulp van een fluorescerende-tagged anti-Opa1 C-terminal antilichaam. Bilayer lipide diffusie werd gemeten als 1,46 ± 0,12 μm2/s, terwijl de diffusiecoëfficiënt van bilayer-gereconstrueerde l-Opa1 0,88 ± 0,10 μm2/sbedroeg. Intensiteit uitlezing van de FCS-curven aangegeven 75% van de l-Opa1 is gereconstitueerd in de lipide bilayer (Figuur 4G, H). Deze resultaten suggereren dat l-Opa1 vrij verspreidt in de polymeer-vastgebonden lipide bilayer met het potentieel om zelf te monteren in functionele complexen.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig04.jpg"> Figuur 4: Distributie van lipide en gereconstitueerd eiwit in het modelmembraan. (A-C) Voorbeeld beelden van een lipide bilayer en de lipide vloeibaarheid gevalideerd door epifluorescentie microscopie. (A) Homogene lipideverdeling in bilayer voorafgaand aan het fotobleekten. (B) Momentopname onmiddellijk na het fotobleaching. (C) Bilayer afgebeeld na fluorescentie herstel geeft een goede lipide vloeibaarheid van het membraan na reconstitutie. (D,E) Representatieve beelden van lipideverdeling vóór (D), en na (E) l-Opa1 reconstitutie geven aan dat het reconstitutieproces geen gebreken in de bilayer heeft gemaakt. Representatieve TIRF afbeelding van l-Opa1 gelabeld met Alexa 488 geconjugeerd antilichaam (F) met een homogene verdeling van Opa1 bij reconstitutie. G. Representatieve ruwe foton tellingen van l-Opa1 signaal door fluorescerende correlatie spectroscopie. In de controle, geen l-Opa1 werd gereconstrueerd in de bilayer, terwijl antilichaam werd toegevoegd en gespoeld. De verspreiding van l-Opa1 is aanzienlijk langzamer dan lipiden in het membraan, in overeenstemming met een succesvolle reconstructie van transmembrane l-Opa1(H). Schaalbalk: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Fluorescentie stap bleken aangegeven een gemiddelde van 2-3 exemplaren van l-Opa1 werden gereconstrueerd in een bepaald liposoom (Figuur 5A,B). De grootteverdeling van opa1 gereconstrueerde proteoliposomen werd na reconstructie getest met DLS (figuur 5C). De reconstructie van Opa1 in proteoliposomes werd ook geverifieerd met behulp van FCS. De diffusiecoëfficiënt van vrij antilichaam bedroeg 164 ± 22 μm2/s; diffusiecoëfficiënt voor liposomen met een lipidekleurstof was 2,22 ± 0,33μm 2/s, en de diffusiecoëfficiënt voor l-Opa1-proteoliposom gebonden aan een TexasRed gelabeld anti-Zijn antilichaam was 2,12 ± 0,36 μm2/s.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig05.jpg"> Figuur 5: Fabricage en karakterisering van proteoliposomes. (A) Stappen in het fabriceren van proteoliposomes met ingekapseld, gedoofd calcein. (B) Representatieve gegevens van fluorescerende stapbleken tonen een gemiddelde van 2-3 kopieën van l-Opa1 ingebed in het liposoom. c) Representatieve grootteverdelingen van proteoliposomen (rood) zonder nucleotide 1 uur na GTP-incubatie (groen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Detectie van membraantethering, lipidevermenging/hemifusie en porieopening door fluorescerende microscopie.
Membraan tethering wordt gecontroleerd door het observeren van het signaal van TexasRed op het oppervlak van lipide bilayer met behulp van TIRF microscopie (Figuur 6A). Membraan lipide demixing (hemifusion) gedrag werd gecontroleerd via TexasRed als de kleurstof verspreidt zich van de liposomen in de lipide bilayer. Calcein dequenching helpt volledige fusieporievorming te onderscheiden van alleen lipide demixing. Dit maakt vergelijking mogelijk tussen omstandigheden waarin deeltjes vastlopen bij hemifusie (fig 6B) en deeltjes die overgaan tot volledige fusie(figuur 6C).
Membraantethering wordt aangegeven door een stabiel lipidesignaal van liposomen. De afstand kan worden geëvalueerd op basis van het FRET-signaal tussen de etiketten van de twee membranen36. Hemifusion signaal beschikt niet over dequenching in de calcein signaal (Figuur 6B, onderste rij), maar een snelle verval van de TexasRed signaal geeft diffusie van de kleurstof in de lipide bilayer (Figuur 6B bovenste rij). Volledige fusie (met porie opening) is voorzien van zowel lipide verval en content release(Figuur 6C). TexasRed intensiteit en calceine intensiteit kan worden bijgehouden in een tijd-afhankelijke manier om kwantitatieve details voor de kinetiek van membraan fusie36.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig06.jpg"> Figuur 6: Representatieve resultaten met deeltjestethering (A, schaalbalk 10 μm), hemifusion (B, schaalbalk 0,5 μm) en fusie (C, schaalbalk 0,5 μm). (A) Proteoliposomes vastgebonden aan Opa1-gereconstitueerde lipide bilayer vóór GTP toevoeging. (B) Een voorbeeld van hemifusie. De bovenste rij in B toont lipide demixing (TexasRed signaal, rood), onderste rij in B toont geen content release (calcein signaal, groen) onder deze omstandigheden. (C) Een representatief spoor van proteoliposome fusing met de lipide bilayer. Content release kan worden waargenomen van beelden in de onderste rij van het tonen van dequenching van calcein (onderste rij, groen). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics at JoVE.com

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondriale fusie is een belangrijke homeostatische reactie die ten grondslag ligt aan mitochondriale dynamiek. Hier beschreven is een in vitro reconstitution systeem om mitochondriale binnenmembraan fusie die membraan tethering, docking, hemifusion, en porie opening kan oplossen. De veelzijdigheid van deze aanpak bij het verkennen van celmembraansystemen wordt besproken.

Een modelmembraanplatform voor het reconstrueren van mitochondriale membraandynamica

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

In dit deeltje introduceren we een in vitro reconstitution platform dat de lipide omgeving van mitochondriën binnenmembraan nabootst. Dit platform kan worden gebruikt om moleculaire mechanismen van mitochondriën binnenmembraanfusie te onderzoeken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kwantitatief onderzoek van integrale membraaneiwitten en membraan-geassocieerde eiwitten in een bijna inheemse omgeving mogelijk maakt.Om te beginnen, meng oplossingen A en B volgens manuscriptrichtingen, dan het lipidemengsel produceren door het berekende volume van opslagoplossing in amberfuitjes met een glasspuit toe te voegen. Match het uiteindelijke volume door extra chloroform toe te voegen aan de flesjes. Bak microscoop coverglass dia's op 520 graden Celsius gedurende 30 minuten.Na het bakken, laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Voeg ongeveer 10 gram natriumhydroxide toe aan 500 milliliter methanol tijdens het roeren. Roer gedurende twee uur, blijven natriumhydroxide toe te voegen aan de oplossing tot neerslag beginnen te laten zien.Reinig de glazen glijbanen in 10% natrium dodecylsulfaatoplossing, methanol verzadigd met natriumhydroxide en 50 millimolar zoutzuur, achtereenvolgens bad sonicating de dia's onder elke voorwaarde gedurende 30 minuten. Reinig de glazen glijbanen in ultrazuiver water gedurende 10 minuten tussen elke voorwaarde. Bewaar de gereinigde coverglass verzegeld in zoutzuuroplossing voor maximaal twee weken om een goede tweelaagse kwaliteit te garanderen.Reinig de polytetrafluorethyleentrog van het Langmuir-Blodgett dompelen systeem met behulp van chloroform en ultrazuiver water totdat er geen bevochtiging wordt waargenomen. Spray chloroform op het trogoppervlak en veeg het drie keer grondig af met cellulosedoekjes, spoel het vervolgens drie keer af met ultrazuiver water en verwijder het water via zuiging. Bedek het oppervlak van de trog met schoon ultrazuiver water.Neem twee stukken van het oppervlak behandelde coverglass van de reinigingsoplossing en spoel ze met ultrazuiver water voor ongeveer 30 seconden. Plaats de afdekglas op een back-to-back manier met behulp van het substraat klem om de glazen dia's te houden. Dompel de glazen schuif onder het wateroppervlak door handmatig op het Langmuir-besturingssysteem te klikken.Nul de film balans en zorgvuldig verspreid oplossing B druppel voor druppel op de lucht water interface. Zorg ervoor dat lipiden zich alleen verspreiden op de luchtwaterinterface zonder chloroforme en lipidedruppels die naar de bodem van het polytetrafluorethyleenoppervlak zinken, waardoor een lipidekanaal ontstaat en de monolaagvorming wordt voorkomen. Stop met het toevoegen van lipiden wanneer de filmbalans uitlezing ongeveer 15 tot 20 millinewton per meter is.Wacht 10 tot 15 minuten en start vervolgens de barrièrecontroller om het oppervlak te wijzigen door op startexperiment te klikken. Wacht tot de uitlezing van de filmbalans toeneemt tot 37 millinewton per meter en houd de druk ongeveer 20 tot 30 minuten. Verhoog de coverglass met een snelheid van 22 millimeter per minuut met behoud van de oppervlaktespanning op 37 millinewton per meter.Een lipide monolayer met polymeer tethering zal worden overgedragen van de luchtwater interface naar het oppervlak van coverglass door middel van de Blodgett dipproces, de vorming van de onderste bijsluiter van de lipide bi-laag. Reinig de luchtwaterinterface door de trog af te zuigen en spoel de trog af met ultrazuiver water. Na het reinigen van een een-welled glazen glijbaan met chloroform, ethanol, en ultrazuiver water, zet het op de trog onder de waterlaag.Zorg ervoor dat de put naar boven naar de luchtwaterinterface gericht is en giet vers ultrazuiver water totdat de glazen glijbaan volledig is afgedekt en dompel de glazen glijbaan onder het wateroppervlak zoals eerder beschreven. Houd de coverglass met de lipide monolayer met behulp van een siliconen zuignap en duw de lipide monolayer voorzichtig naar de luchtwaterinterface. Houd het afdekglas twee tot drie seconden op de interface en duw het vervolgens tegen de glijbaan.Neem de glijbaan met de coverglass. Neem de coverglass en de bi-laag naar een epifluorescentie microscoop en beeld de lipide bi-laag volgens tekst manuscript richtingen. Bereid een kristallisatieschotel met ultrazuiver water en plaats een schone microscoop beeld ring onder de schotel.Dompel deze glijbaan en coverglass onder die de lipide bi-laag onder het water bevatten. Scheid voorzichtig de schuif en het afdekglas, houd de coverglass dia van de bodem en breng de coverglass in de afbeelding ring. Vervang het ultrazuivere water in de beeldring door bis-tris natriumchloridebuffer, zodat de lipide bilaag niet wordt blootgesteld aan luchtbellen.Voeg 1,1 nanomolar n-octyl-beta-glucopyranoside toe aan de lipide bi-layer en voeg onmiddellijk het mengsel van 1,2 nanomolar DDM en 1,3 picomoles gezuiverde L-OPA1 toe aan de beeldring. Broed het monster twee uur lang op een bench-top shaker bij lage snelheid. Verdeel 30 milligram SM-2 hars kralen in drie milliliter bis-tris buffer en schudden.Gebruik een plastic pipet om 5 tot 10 microliter van de SM-2 hars kralen toe te voegen aan de beeldring en incubeer het gedurende 10 minuten, dan spoel de hars kralen. Het uiteindelijke volume van de buffer in de beeldring moet 1,5 milliliter zijn. Bereid een milligram lipidemengsel A in chloroform oplossing, dan verdampen chloroform onder stikstof stroom gedurende 20 minuten.Houd het mengsel 's nachts onder vacuüm om een lipide film te vormen. Bereid 50 millimolar calciumhoudende buffer door het oplossen van 15,56 gram calceine in 50 milliliter van 1,5 molaire natriumhydroxide oplossing. Roer het mengsel op kamertemperatuur tot calceine volledig is opgelost.Voeg 12,5 millimolar bis-tris en ultrapure water toe voor een eindvolume van 500 milliliter en pas de pH aan op 7,5. Doseer lipidefilm in calceine met buffer en hydrateer de lipide volledig door de suspensie 20 minuten op 65 graden Celsius te verwarmen. Vorm 200 nanometer liposomen via extrusie met een polycarbonaat membraan.Voeg twee microgram L-OPA1 toe in 0,5 micromolar DDM, 2,2 milligram liposoom en ontcubeer de oplossing gedurende 1,5 uur bij vier graden Celsius. Verwijder de oppervlakteactieve agent door dialyse met een 3,5 kilodalton dialyse cassette tegen 250 milliliter van 25 millimolar bis-tris, 150 millimolar natriumchloride, en 50 millimolar calcium buffer op vier graden Celsius 's nachts, het veranderen van de buffer tweemaal. Verwijder extra calcein met behulp van een PD10 desalting kolom, ga dan verder met beeldvorming en data-analyse zoals beschreven in de tekst manuscript.Epifluorescentie microscopie beelden van een lipide bi-layer en de lipide vloeibaarheid worden hier getoond. De lipideverdeling wordt voor en na fotobleken getoond en de homogeniteit wordt voor en na de reconstructie getoond. L-OPA1 gereconstitueerd en lipide bi-layer werd gevalideerd door fluorescentie correlatie spectroscopie of FCS.De FCS-curven gaven aan dat 75% van de L-OPA1 werd gereconstitueerd in de lipide bi-laag wat suggereert dat L-OPA1 vrij verspreidt in het polymeer vastgebonden lipide bi-laag met het potentieel om zelf te monteren in functionele complexen. Fluorescentie stap bleken aangegeven dat een gemiddelde van twee tot drie exemplaren van L-OPA1 werden gereconstrueerd in een bepaald liposoom. De grootteverdeling van L-OPA1 gereconstrueerde proteoliposom werd na de reconstructie getest met DLS en geverifieerd met FCS.Membraan tethering werd gecontroleerd door het observeren van het signaal van Texas Red op het oppervlak van de lipide bi-layer met behulp van TIRF microscopie. Membraan lipide de-mengen of hemifusion werd gecontroleerd door Texas Red als de liposoom marker verspreid in de lipide bi-layer. Calcein de-quenching hielp onderscheid maken volledige fusie porie vorming van alleen lipide de-mengen, waardoor vergelijking tussen de omstandigheden waar deeltjes vast te vallen op hemifusie en deeltjes die overgaan tot volledige fusie.Membraan tethering werd aangegeven door een stabiel lipidesignaal van liposomen en effusiesignaal bevatte geen de-quenching in het calcein signaal, maar een snel verval van de Texas Red signaal aangegeven verspreiding van de kleurstof in de lipide bi-laag. Volledige fusie kenmerkte zowel lipide verval en content release. Bij een poging van dit deeltje, vergeet niet om grondig schoon zowel de coverglass en Langmuir trog om ervoor te zorgen bi-lagen van hoge kwaliteit worden vervaardigd.Een goede luchtkwaliteit is ook van cruciaal belang om defecten in de bilaag te voorkomen. Deze techniek maakt de weg vrij voor ons om nieuwe vragen in mitochondriën membraandynamica en organisatie te verkennen. Spannend toekomstig experiment omvat het verkennen van de invloed van bi-layer assymetrie, membraan potentieel, en ziekte-gerelateerde mutanten in mitochondriën innerlijke membraan dynamiek.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Mitochondria and Energy Production

SCIENTISTS IN ACTION

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Geregisseerd Protein Packaging binnen Outer membraanvesicles uit<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Ontwerp, Productie en zuivering

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Bacteriële Inner-membraan Display voor het screenen van een bibliotheek van antilichaamfragmenten

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering van membraan transporters door Heterologeuze expressie in E. coli en productie van membraan blaasjes

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, een in één stap incorporatie van membraan eiwitten in Biotinylated Peptidiscs voor gestroomlijnde eiwit binding assays

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...