Name: a model membrane platform for reconstituting mitochondrial membrane dynamics
Uploaded: 2020-09-02T15:00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics at JoVE.com

המחברים מכירים בתמיכה של פרס מחקר בריאות הילד של קרן צ'ארלס הוד ותמיכה נדיבה מהמחלקה לביולוגיה מולקולרית בבית החולים הכללי של מסצ'וסטס.

1. הכנת תערובות שומנים
<ol><li>הכן תמיסת מניות שומנים על ידי המסת 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3פוספוכולין (DOPC), 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-פוספוטנולמין (אפיפיור), L-α-phosphatidylinositol (כבד PI), cardiolipin, cardiolipin, קרדיוליפין, ו 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-פוספואתנולמין-N-[מתוקסי (פוליאתילן גליקול)-2000] (18:1 PEG2000 PE) לתוך כלורופורם בריכוז של 25 מ"ג/מ"ל. להמיס שומנים פלורסנט צבע-התפלה (TexasRed DHPE ו Cy5 סמים) כלורופורם בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל. אחסן את תמיסת הליפידים בקבוקונים ענבר עם ליינר עמיד כלורופורם, אטום עוד יותר עם קלטת polytetrafluoroethylene. ניתן לשמור את הפתרון ב-20°C למשך עד 6 חודשים.</li>
	<li>הפוך פתרונות A ו-B.<ol>
<li>לערבב שומנים להכנת פתרון A (ריכוז סופי 1 מ"ג / מ"ל) המכיל DOPC (52.8 מול%), האפיפיור (20 מול%), כבד PI (7 מול%) וקרדיוליפין (20 מול%), ו 0.2 מול פלואורופור.</li>
		<li>הפוך פתרון B (ריכוז סופי 1 מ"ג/מ"ל) המכיל DOPC (47.8 מול%), POPE (20 מול%), כבד PI (7 מול%), cardiolipin (20 מול%) ו-0.2 מול פלואור.</li>
		<li>צור את תערובת הליפים על ידי הוספת נפח מחושב של תמיסת אחסון לתוך בקבוקוני ענבר באמצעות מזרק זכוכית. להתאים את אמצעי האחסון הסופי על ידי הוספת כלורופורם נוסף לתוך הבקבוקונים. הערה: עבור FCS (ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצנה), להקטין את היחס של שומנים בהלת צבע ל 0.002 mol% ולהחליף את השאר על ידי DOPC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ייצור של שתי שכבות שומנים
<ol><li>אופים שקופיות זכוכית במיקרוסקופ ב-520 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר האפייה, מצננים את שקופיות הכיסוי לטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשקול כ 10 גרם של נתרן הידרוקסיד ולהוסיף 500 מ"ל של מתנול תוך כדי ערבוב. מערבבים במשך 2 שעות, ממשיכים להוסיף נתרן הידרוקסיד בתמיסה עד שהמשקעים מתחילים להראות. הקפד ללבוש PPE המתאים במהלך כל התהליך.</li>
	<li>לנקות את שקופיות הזכוכית בתמיסת נתרן dodecyl סולפט; מתנול רווי נתרן הידרוקסיד; ו 50 m חומצה הידרוכלורית, באופן רצף (sonication אמבטיה בכל מצב במשך 30 דקות). נקה את מגלשת הזכוכית במים אולטרה-תכליתיים למשך 10 דקות בין כל תנאי. הערה: למרות מומלץ מאוד להשתמש בפתרונות טריים להכנת שקופיות זכוכית, ניתן לעשות שימוש חוזר בכל פתרון עד 5x או בתוך חודש אחד, מה שבא קודם. הקפד לערבב את הפתרון לפני כל שימוש.</li>
	<li>אחסן את זכוכית הכיסוי הנקייה החתומה בתמיסת HCl עד שבועיים כדי להבטיח איכות דו-שכבתית טובה. אם הם מאוחסנים במים אולטרה-אפורים, השתמשו במגלשות בתוך שבוע.</li>
	<li>נקה את שוקת הפוליטרפלואורואתילן של מערכת הטבילה לנגמיר-בלודג'ט באמצעות כלורופורם ומים אולטרה-פורים עד שלא נצפה הרטבה על שוקת. ספריי כלורופורם על פני השטח של שוקת, לנגב ביסודיות עם מגבונים תאית 3x. יש לשטוף במים סופר-תכליתיים ולהסיר את המים באמצעות שאיבה. חזור על זה 3x.</li>
	<li>מכסים את פני השטח של שוקת עם מים נקיים ואולטרה-תפורים.</li>
	<li>קחו 2 חתיכות של זכוכית כיסוי שטופלה על פני השטח מתמיסת ניקוי או מים אולטרה-יבשים, ושטופו את מגלשת הזכוכית במים אולטרה-יבשים למשך כ-30 שניות.</li>
	<li>מניחים את הכיסוי באופן גב אל גב. השתמש במלחציים של הצוללת כדי להחזיק את מגלשות הזכוכית. לטבול את מגלשת הזכוכית מתחת לפני המים על ידי לחיצה ידנית "dipper למטה" על תוכנת הבקרה Langmuir.</li>
	<li>אפס איזון הסרט, בזהירות להפיץ פתרון B טיפה אחר טיפה בממשק מי האוויר(איור 2A). ודא שומנים מתפשטים רק בממשק מי האוויר, ללא כלורופורם וטיפות שומנים טובעים לתחתית פני השטח polytetrafluoroethylene.  כישלון להבטיח את זה תיצור שומנים "ערוץ" ולמנוע היווצרות מונומרית.</li>
	<li>להפסיק להוסיף שומנים עד קריאת איזון הסרט סביב ~ 15-20 mN / mn / m, לחכות ~ 10-15 דקות. התחל את בקר המחסום כדי לשנות את שטח הפנים על-ידי לחיצה על "התחל ניסויים", עד לקריאת איזון הסרט ל- 37 mN/m. לשמור על הלחץ במשך ~ 20-30 דקות (איור 2B).</li>
	<li>הרם את כיסוי הזכוכית במהירות של 22 מ"מ/דקה תוך שמירה על מתח פני השטח במהירות של 37 mN/m. מונו-שכבת שומנים עם כריכת פולימר תועבר מממשק מי האוויר אל פני השטח של זכוכית כיסוי דרך תהליך הטבילה Blodgett(איור 2C). זה יוצר את העלון התחתון של דו-שכבת הליפידים.</li>
	<li>נקה את ממשק מי האוויר על ידי יניקה, לשטוף את שוקת עם מים אולטרה פורים.</li>
	<li>נקה מגלשת זכוכית בעלת באר אחת (לדוגמה, מגלשת שייפר) באמצעות כלורופורם, אתנול ומים אולטרה-פורים לפני השימוש. מניחים את מגלשת הזכוכית הנקייה על שוקת המים האפורים במיוחד מתחת לשכבת המים. ודא שהבאר פונה כלפי פנים כלפי הממשק של מי האוויר ויוצקים מים טריים ואפורים עד מגלשת הזכוכית מכוסה במלואה. חזור על שלב 2.8.</li>
	<li>החזק את הכיסוי עם מונולייטר שומנים ממדרגה 2.4 באמצעות יניקה סיליקון (לוודא בצד מונולייטר הוא רחוק מכוס יניקה), בעדינות לדחוף את מונולייטר הליפיד לממשק מים אוויר, להחזיק את זכוכית הכיסוי עבור ~ 2-3 s בממשק, ואז לדחוף את הכיסוי נגדהמגלשה (איור 2D). קח את השקופית החוצה עם מגלשת מכסה. הערה: דו-שכבת הליפידים תתקיים על פני השטח של זכוכית הכיסוי הפונה לאזור הסנדוויץ' בין שתיהשקופיות (איור 2E).</li>
	<li>קח את הכיסוי עם הדו-שכבתי למיקרוסקופ אפיפלואורסצנס. תדמינאי את דו-שכבת הליפידים. אם התפלגות הומוגנית של צבע השימנים נצפתה, photobleach אזור קטן של הדו-שכבת עבור 30 s, לכבות את מקור האור עבור ~ 30 s-1 דקות, אז תמונה שוב כדי לצפות בהתאוששות. דו-שכבת שומנים תראה התאוששות פלואורסטית. הערה: אין להשתמש בממברנות עם פגמים או בשחזור פלואורסטס רע לניסויים נוספים.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig2v2.jpg"> איור 2: שלבים בהכנת דו-שכבת שומנים עם רצועה פולימרית. שלבים של ביצוע שתי שכבות שומנים באמצעות Langmuir-Blodgett טבילה (A-C) ו לנגמיר-שייפר להעביר(D)טכניקות. ה"כריך" האחרון המכיל את הדו-שכבת ה שומנים.E <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig2v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
3. שחזור חלבונים לתוך דוטל הליפידים קשור פולימר
<ol><li>הכן צלחת התגבשות המכילה מים אולטרה-תכליתיים. הכינו טבעת תמונה מיקרוסקופית נקייה והניח מתחת לצלחת.</li>
	<li>לטבול את "הכריך" של מגלשת שייפר לכסות זכוכית המכילה דו שכבת שומנים מתחת למים, בעדינות להפריד את מגלשת שייפר וזכוכית לכסות, להחזיק את החלקה זכוכית לכסות מהתחתית, הרחק מהצד הדו-שכבתי, להעביר את זכוכית הכיסוי לתוך טבעת התמונה, לסגור את טבעת התמונה. הערה: ודא כי הכיסוי עם דו-שכבת שומנים הוא תמיד במים, ואת הטבעת אטומה היטב.</li>
	<li>החלף את המים האפורים במיוחד בטבעת התמונה במאגר Bis-Tris NaCl, ודא שהליקוט הליפיד אינו חשוף לבועות אוויר. הוסף 1.1 x10-9 M n-Octyl-β-D-Glucopyranoside ללוטל הליפידים. מיד להוסיף את התערובת של 1.2 x 10-9 M של DDM ו 1.3 x 10-12 מול מטוהר l-Opa136 לתוך טבעת התמונה. דגירה מדגם על שייקר ספסל במהירות נמוכה עבור 2 שעות (איור 3). הערה: חומרי ניקוי עשויים להשתנות בהתאם לחלבון שיש לשחזר.</li>
	<li>להפיץ 30 מ"ג SM-2 חרוזי שרין לתוך 3 מ"ל של חיץ Bis-Tris ולנער לפני החלת. השתמש פיפטה פלסטיק כדי להוסיף 5 ~ 10 μL של SM-2 חרוזי שריף לטבעת תמונה, דגירה במשך 10 דקות, להסיר חרוזי שף על ידי שטיפה. אמצעי האחסון הסופי של המאגר בטבעת התמונה הוא 1.5 מ"ל.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig3v2.jpg"> איור 3: נוהל לצורך התכנסות מחדש של L-Opa1 לתוך דו-שכבת שומנים עם רצועה פולימרית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
4. הכנת פרוטאוליפוזה
<ol><li>להכין 1 מ"ג של תערובת שומנים A בתמיסת כלורופורם. להתאדות כלורופורם תחת זרימת חנקן במשך 20 דקות ולשמור תחת ואקום לילה ויוצרים סרט שומנים.</li>
	<li>להכין 50 מ 'calcein המכיל חוצץ על ידי המסת 15.56 גרם calcein כדי 50 מ"ל של 1.5 מול NaOH פתרון, לערבב בטמפרטורת החדר עד calcein הוא מומס לחלוטין, הוסיף 12.5 mM Bis-Tris ומים אולטרה פורה לנפח הסופי של 500 mL. כוונן את ה-pH ל- 7.5.</li>
	<li>להשעות את הסרט שומנים בקלצ'ין המכיל חוצץ, לחות מלאה את הליפיסט על ידי חימום המתלים ב 65 מעלות צלזיוס עבור 20 דקות. 200 נק'ל ליפוזומים נוצרים באמצעות הבלטה באמצעות קרום פוליקרבונט.</li>
	<li>להוסיף 2 μg של l-Opa1 ב 0.5 μM DDM כדי 0.2 ליפוגום מ"ג דגירה ב 4 ° C עבור 1.5 שעות. הסר את פעילות הגלישה באמצעות דיאליזה באמצעות קלטת דיאליזה 3.5 kDa נגד 250 מ"ל של 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl ו 50 mM calcein מאגר ב 4 ° C לילה, שינוי המאגר פעמיים.</li>
	<li>הסר קלצ'ין נוסף באמצעות עמודת התפלה PD-10.</li>
</ol>5. הדמיה וניתוח נתונים
<ol><li>רכוש תמונות TIRF באמצעות יעד טבילה בשמן פי 100 (N.A 1.4). השתמש לייזר 543 nm ולייזר 488 nm לניתוח של TexasRed-PE מסומן ליפזומים ופרוטאוליפוזה עטוף עם calcein. השתמש בלייזר 633 נארם לניתוח של Cy5-PE מוטבע דו שכבת שומנים מיורנית.</li>
	<li>יישר את זווית TIRF באמצעות דו-שכבת שומנים כדי לקבל פליטה מקסימלית. האיכות של דו-שכבת שומנים לאחר reconstitution נצפתה באמצעות יעד שמן 100x ב 25 מעלות צלזיוס. מקדם דיפוזיה של דו-שכבתי פוספוליפידים ושוחזר נקבעים באמצעות FCS עם פרוטוקול המתאר במקוםאחר 37.</li>
	<li>להוסיף 10 μL של 2 פרוטאוליפוזה מ"ג /מ"ל לטבעת התמונה ולהגדיר עבור 10 דקות לפני התמונה. GTP, GMPPCP או תמ"ג מתווספים לטבעת התגובה עם 1 mM MgCl2 ו 1 mM של נוקלאוטיד.</li>
	<li>כדי לקבוע את ההשפעה של s-Opa1 בהיתוך קרום, titrate s-Opa1 לתוך מדגם דו שכבתי פרוטוליפוז / נתמך המכיל l-Opa1, ואירועי היתוך להקליט.</li>
	<li>הדמיה בו-זמנית של TexasRed-DHPE ו- calcein מושגת באמצעות מערכת פיצול קרן. שני 488 מילינר ו 543 מילימ'ין לייזר מוחלים בו זמנית על המדגם כמקורות פלורסנט. לאחר מכן, אור הפליטה מחולק באמצעות מפצל קרן של 560 00 00 00 00 00:00:00,000 .אני לא יכול-. לאחר מכן, אור הפליטה המפוצל מסונן על-ידי מסנן של 510 ננ"מ עם רוחב פס של 42 ננ"מ ומסנן של 609 ננ"מ עם רוחב פס של 40 ננ"מ. הקרן המסוננת מקרנת לשני אזורים סמוכים על שבב המצלמה.</li>
	<li>פליטת פלורסנט נרשמת בו-זמנית באמצעות מסנן של 609 פליטות עם רוחב פס של 40 ננ"ר, ומסנן 698 פליטה עם רוחב פס של 70 ננ"מ. מערכת המיקרוסקופ מצוידת במצלמת CMOS המתוחזקת ב-10°C.</li>
	<li>זיהוי חלקיקים של הליפוזומים יכול להתבצע באמצעות אלגוריתם זיהוי חלקיקים מבוסס גאוסיאני. התפלגות החלקיקים והעוצמה מנותחים ערוץ אחר ערוץ. אות דו שכבת שומנים משמש כמסכה לבודד חלקיקים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sackmann, E., Lipowsky, R., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+membranes+architecture+and+function.">Biological membranes architecture and function.</a> Structure and Dynamics of Membranes. 1, 1-63 (1995).</li><li>Rajendran, L., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+membrane+dynamics.">Lipid rafts and membrane dynamics.</a> Journal of Cell Science. 118, 1099-1102 (2005).</li><li>Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositides+in+Control+of+Membrane+Dynamics.">Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).</li><li>Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglioside-Lipid+and+Ganglioside-Protein+Interactions+Revealed+by+Coarse-Grained+and+Atomistic+Molecular+Dynamics+Simulations.">Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations.</a> Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).</li><li>Schafer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+actin+dynamics+and+membrane+dynamics+during+endocytosis.">Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).</li><li>Chan, Y. H., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Biswas, K. H., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Live+Cell-Supported+Membrane+Interfaces+for+Signaling+Studies.">Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies.</a> Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).</li><li>Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Assays+Using+Liposomes+and+Cell-Derived+Vesicles:+From+Modeling+Complex+Membrane+Processes+to+Synthetic+Biology+and+Biomedical+Applications.">Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).</li><li>Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+SNARE-mediated+vesicle+fusion+observed+in+vitro+by+polarized+TIRFM.">Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM.</a> Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).</li><li>Kiessling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fusion+of+synaptic+vesicles+with+reconstituted+target+SNARE+membranes.">Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes.</a> Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).</li><li>Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+tension+at+lipid+phase+boundaries+as+driving+force+for+HIV+fusion+peptide-mediated+fusion.">Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion.</a> Nature Communication. 7, 11401 (2016).</li><li>Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+fusion+observed+by+content+transfer+across+a+tethered+lipid+bilayer.">Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).</li><li>Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+conformational+rearrangements+in+flavivirus+membrane+fusion.">Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion.</a> Elife. 3, 04389 (2014).</li><li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions.">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li><li>Sezgin, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+platforms+to+study+protein-membrane+interactions.">Model membrane platforms to study protein-membrane interactions.</a> Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).</li><li>Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cholesterol+Level+Alter+Integrin+Sequestration+in+Raft-Mimicking+Lipid+Mixtures.">Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).</li><li>Dutta, D., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned,+multicomponent+supported+lipid+bilayers+for+cellular+systems.">Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems.</a> Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).</li><li>Groves, J., Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Lipid+Bilayers+as+Mimics+for+Cell+Surfaces+and+as+Tools+in+Biotechnology.">Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology.</a> BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. , (2006).</li><li>Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+Morphology,+Diffusivity,+and+Indentation+of+Hydrogel-Supported+Lipid+Bilayers.">Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).</li><li>Wang, N., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+reticular+ER+network+-+mechanistic+implications+and+open+questions.">Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+and+fission:+interlinked+processes+critical+for+mitochondrial+health.">Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health.</a> Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wai, T., Langer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Metabolic+Regulation.">Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation.</a> Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).</li><li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+cell+life+and+death.">Mitochondrial fusion and fission in cell life and death.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusins+Mfn1+and+Mfn2+coordinately+regulate+mitochondrial+fusion+and+are+essential+for+embryonic+development.">Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development.</a> Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).</li><li>Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+morphology+through+proteolytic+cleavage+of+OPA1.">Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1.</a> EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).</li><li>Anand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+i-AAA+protease+YME1L+and+OMA1+cleave+OPA1+to+balance+mitochondrial+fusion+and+fission.">The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission.</a> Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).</li><li>Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+of+Opa1+stimulates+mitochondrial+inner+membrane+fusion+and+couples+fusion+to+oxidative+phosphorylation.">Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation.</a> Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).</li><li>Baker, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+OMA1+activation+and+autocatalytic+turnover+regulate+OPA1-dependent+mitochondrial+dynamics.">Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics.</a> EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).</li><li>DeVay, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coassembly+of+Mgm1+isoforms+requires+cardiolipin+and+mediates+mitochondrial+inner+membrane+fusion.">Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion.</a> Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).</li><li>Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Degradation+of+YME1L+and+OMA1+Adapts+Mitochondrial+Proteolytic+Activity+during+Stress.">Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress.</a> Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).</li><li>Ban, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+selective+mitochondrial+fusion+by+heterotypic+action+between+OPA1+and+cardiolipin.">Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).</li><li>Tanaka, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-supported+membranes+as+models+of+the+cell+surface.">Polymer-supported membranes as models of the cell surface.</a> Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).</li><li>Shilts, K., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+cell-surface+mimetics+as+engineered+cell+substrates.">Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates.</a> Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).</li><li>Ge, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+Opa1+cooperate+to+complete+fusion+of+the+mitochondrial+inner-membrane.">Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane.</a> Elife. 9, 50973 (2020).</li><li>Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+alters+dimerization+and+sequestering+of+urokinase+receptors+in+raft-mimicking+lipid+mixtures.">Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems,+lipid+rafts,+and+cell+membranes.">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).</li><li>Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+SNARE-mediated+membrane+fusion+at+the+single+liposome+level.">Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level.</a> Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).</li><li>Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+ligands+change+integrin+sequestering+but+not+oligomerization+in+raft-mimicking+lipid+mixtures.">Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures.</a> Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).</li></ol>

במערכות ממברנה מודל המבחנה יכול לתאר תהליכי קרום מורכבים בתנאים מוגדרים היטב. מערכות אלה יכולות להבחין בין רכיבים מינימליים הנחוצים לתהליכים מולקולריים מורכביםכדי לחשוף מנגנוניםמולקולריים 6 , 15,,20,,38., עבור חלבוני קרום, ליפוסומים וbilayers נתמך פלנר הם מערכות reconstitution נפוצות. בניגוד לשומנים דו-שכבות הנתמכים על-ידי מוצק, כרית הפולימר בין המצוע לבין קרום נתמך בשכבות פולימריות קשורות מאפשרת ניידות חופשית של חלבוני קרום גדולים, וחלבונים טרנסמברנה כדי לפזר ולהרכיבבחופשיות 34. תכונות אלה עזרו לנו לחקור את הקינטיות של המיטוכונדריה היתוך פנימי-קרום36.
הכנו דו-שכבת שומנים פולימרית קשורה באמצעות טכניקות לנגמיר-בלודג'ט/לנגמיר-שייפר (LB/LS). זה מאפשר לנו להכין דו-שכבתי עם רכיבי שומנים אסימטריים. קרום תאי יש הרכב עלון אסימטרי, ואת הגישה LB / LS מאפשר את המחקר של bilayers כאלה. עם העברת שייפר, ניתן לכסות את המקום שלם על ידי דו-שכבת שומנים. זה קריטי להכין משטח נקי להכנת דו-שכבתי. בנוסף, נדרש אימון כדי לבצע העברת שייפר כראוי. העברת שייפר לא מוצלחת יכולה ליצור פגמים לא רצויים ברכיבה על שומנים. בפרוטוקול זה, הלחץ שנוסף לאיזון הסרט ישים עבור דו-שכבתי המכיל 20% קרדיוליפין. עבור bilayers עם רכיבים אחרים, עיין באזור הלחץ של פני השטח isotherm של רכיבי המפתח. שיטה חלופית היא שיטת ההיתוך Langmuir-Blodgett/vesicle (LB/VF), שבה המונו-שכבת השימנים התחתונה מועברת מממשק מי האוויר של שוקת לנגמיר אל המצע הנקי, ואז ליפוזומים מתמזגים לראש המונואלייטר השימנים הנתמך ויוצריםאת הדו-שכבתי הסופי 39. איסוף מחדש של חלבוני ממברנה באמצעות שיטת LB/VF הוא פשוט יותר מאשר LB / LS, כמו reconstitution ניתן לבצע באמצעות ההיתוך של פרוטאוליפוזומים. עם זאת, היתוך של שלבקת דורש תוספת של ליפוזומים עודפים, אשר עשוי לסבך את המחקר של אירועי קרום תלויים אינטראקציות תלויות חלבון-חלבון תלויריכוז.
ההשבתה המוצלחת של חלבוני טרנסמברנה לתוך שתי שכבות שומנים קשורפולימר ולליפוזומים באוריינטציה פונקציונלית מועדפת היא חשובה, אך קשה לאכוף. יש צורך בבקרות ניסיוניות כדי להסביר זאת. עבור פולימר קשור שומנים דו-שכבתיים, חשוב גם לשמור על שלמות של דו-שכבת שומנים במהלך reconstitution. ריכוזי פעילי שטח חייבים להיות נמוכים יחסית כדי למנוע המסת דו-שכבת השומנים, אבל גבוה מספיק כדי למנוע פירוק של חלבוןשל עניין 37,40. השיטה המתוארת כאן היא אידיאלית עבור שחזור חלבוני קרום עבור מחקרים מולקולה אחת, אבל הוא לא בהכרח מדרגי עבור מחקרים בקנה מידה גדול יותר. בחירת פעילי שטח היא שיקול חשוב נוסף. לעתים קרובות, פעילי שטח המשמשים לטיהור ואחסון היא נקודת התחלה טובה. הריכוז המרבי של פעילי שטח הוא בדרך כלל ~ 200 פעמים פחות של CMC36, בטווח שבו פעילי שטח שומר על יציבות חלבון ומונע צבירת חלבונים, תוך שמירה על שלמותקרום 36. קוקטיילים המכילים 2 או 3 פעילי שטח עשויים להיחשב. עבור reconstitution לתוך ליפוזומים, ריכוז נמוך של פעילי שטח אינו הכרחי. עם זאת, ריכוזי פעילי שטח מתחת CMC עדיפים לשמור על גודל אחיד והפצה מורפולוגיה עבור ליפוזומים. כדי למנוע דליפה של צבע תוכן, יש צורך בחיוג מול מאגר המכיל צבע.
בניגוד לתכני היתוך מבוססי ליפוזום, הפלטפורמה שהקמנו מספקת גישה לחקור את הקינטיים של כל שלב של היתוך קרום. שיטה זו מספקת את היכולת ללמוד חלבוני היתוך transmembrane בתנאים כמעט מקומיים. פלטפורמות ממברנה מודל ניתן להחיל ללמוד הרכבת חלבון קרום ואוליגומריזציה, קרום "פיסול", ואינטראקציות חלבון-שומנים של חלבונים בסביבות תת תאיות, כמו המיטוכונדריה הפנימית קרום. שיטה זו מאפשרת גם לחקור מצבים פיזיולוגיים חשובים באינטרפליי קרום-חלבון, כגון אסימטריה הרכב דו שכבתי. התפקיד של שומנים מיטוכונדריאליים מפתח, cardiolipin, במאפיינים דו שכבתי של שתי ליפונים וbilayers הנתמכים פולימר נשאר להיות מוגדר. מאפיינים כגון הכוח היוני, עובי קרום, נוקשות קרום, עקמומיות קרום, ומאפייני צמיגות אלסטית קרום כל עשוי להשפיע על היכולת של חלבונים כדי הרכבה למצבים פונקציונליים ספציפיים. מחקרים עתידיים החלת מערכות קרום מודל באופן יצירתי יש פוטנציאל לחשוף היבטים חדשים של ארגון חלבון קרום ותפקוד.

מידול קרום הוא סימן ההיכר של תאים אאוקריוטיים1 (איור 1A). ממברנות ביולוגיות מוכרות יותר ויותר כממס דו מימדי, ונחשבות כסביבה המתפקדת כסביבה המתפקדת תפקידים קריטיים בוויסות תפקוד החלבון והרכבה מורכבתמקרומולקולרית 2,,3. שומנים ילידים הם ליגנדים לווסת את פעילות חלבון קרום3,,4. ארגון מרחבי קרום ואת היכולת של ממברנות להיות מפוסל לצורות מגוונות הם מאפיינים פיזיים חשובים לבחירת פונקציות חדשות3,5.
פלטפורמות ממברנה מודל הן מערכות ביומימטיות שיכולות לעזור לנו להבין מבנה קרום סלולרי, דינמיקה,ופונקציה 6,7,8. קרום מודל בדרך כלל מרכיב תערובת שומנים של הרכב מוגדר היטב, עם תכונות ביופיזיות מוגדרות (נוקשות, עובי, ואלסטיות). יחד עם הדמיית פלואורסץ, פלטפורמות קרום מודל לאפשר ניתוח כמותי של מבנה קרוםופונקציה 9,10,,11. אסטרטגיות תיקון דו שכבתי שומנים שימשו כדי ללמוד SNARE בתיווך קרום היתוך9,,10,היתוך קרום בתיווך DNA12,היתוך ויראלי11,13. יתרון של שיטות כאלה הוא הפוטנציאל להשיג מידע קינטי עבור שלבים ביניים לפני אירוע תגובה נצפה14.
קרום הפלזמה נחקר בהרחבה באמצעות קרום מודל. Bilayers עם הפרדת שלב שומנים פותחו כדי ללמוד מבני רפסודה שומניםחשובים איתות סלולרי 11,15,16. מיקרופטרן שומנים בשכבות17,18 שימשו כדי לחקור את הארגון של קולטני תא. ממברנות פולימר או ג'ל נתמך שימשו כמערכות ביומימטיות כדי ללמוד את ארגון קרום-cytoskeleton, חלוקת חלבון קרום במהלך איתות תא, והגירה במגעים תא19.
מערכות קרום מלאכותי מוחלים גם ללמוד organelles תתתאיים 20. אורגנלים כוללים מורפולוגיות אופייניות שיוצרות סביבות משנה נפרדות. רשת הרשתית האנדופלסמית (ER) היא דוגמה אחת. עם restitutions של reticulons לתוך ליפוסומים, מבנים צינורית קרום עם מאפיינים דומים ER התאנוצרים 21. התוספת של אטלסטין, חלבון היתוך ER, יכול לגרום צינורות שומנים מליפוזומים כדי ליצור רשת20. זוהי דוגמה אחת לאופן שבו פרוטאוליפוזומים יכולים לספק תובנה פונקציונלית על מורפולוגיה ודינמיקה של אורגנל.
היתוך קרום מיטוכונדריאלי וביעוש חיוניים לבריאות האוכלוסייה המיטוכונדריאלית22,23,,24,,25. סט של משפחת דינמין GTPases מקטליזה מיטוכונדריה קרום היתוך. Mfn 1/2 קתליזה היתוך קרום חוץ. Opa1 מתווכת היתוך פנימי-קרום26 (איור 1B). Opa1 יש שתי צורות: צורה ארוכה (l-Opa1), transmembrane מעוגן ממברנה הפנימית המיטוכונדריאלי, וצורה קצרה 'מסיסה' (s-Opa1), נוכח בחלל intermembrane. היחס בין שני טפסי Opa1 מוסדר על ידי הפעילות של שני פרוטאזים, Oma1 ו Yme1L27,28,29,30. שאלות חשובות ברגולציה Opa1 כוללות: כיצד שתי הצורות של Opa1, (קצר וארוך) לתווך היתוך קרום ו שלהםיחסי הגומלין הרגולטוריים שלהם 28,29,31,32,33.
כאן אנו מתארים אסטרטגיית איסוף מחדש שהוחלה בהצלחה כדי לחקור היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שהבהיר את התפקידים של l- ו s-Opa1 בהיתוך ממברנה פנימית. פיתחנו פלטפורמה המחקה את המיטוכונדריה הפנימית-קרום באמצעות דוטל שומנים קשור פולימר ו 200 צפון צפון שלל unilamellar. היתרונות של רצועה פולימרית מתחת לקוטל הליפידים כוללים את הדברים הבאים. ראשית, הוא משמר את חלבון הטרנסמברנה המשוחזר, שאחרת היה עלול להיות משובש על ידי הקרבה לשקופית הזכוכית34. שנית, הוא משמש שכבת מים עבה בין ביטל השומנים ומצוע זכוכית, אשר מקל על מחקריםשל פתיחת נקבוביות 9, ושלישית את האופי צמיג של פולימר PEG מאפשר שינויים עקמומיות קרום35. השתמשנו בהדמיית פלואורסץ של שלושה צבעים כדי לאפיין שלבים בהיתוך קרום(איור 1C-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig1v2.jpg"> איור 1: ניטור היתוך קרום מיטוכונדריאלי. אורגנליםהם תאי קרום תאיים. (ב)שלבים רצים של היתוך קרום מיטוכונדריאלי. היתוך של הממברנה ההחוצה של המיטוכונדריה הוא זן על ידי Mfn1 ו / או Mfn2, בעוד היתוך ממברנה פנימית הוא בתיווך Opa1. אני לאיודע מה לעשות. סכמטי של פלטפורמת ההשבתה במבחנה כדי ללמוד היתוך קרום מיטוכונדריאלי. הפלטפורמה כוללת שני חלקים: פרוטאוליפוזה ובלם שומנים קשור פולימר, שניהם עם l-Opa1 משוחזר. תוויות פלורסנט, כולל שני צבעי קרום פלורסנט שונים וסמן תוכן, מסייעים להבחין בין שלבים במהלך היתוך קרום. שני סמני קרום (Cy5-PE (אדום) ו TexasRed PE (כתום) לעשות זוג FRET, אשר יכול לדווח על עגינת קרום קרוב. דיפוזיה של TexasRed-PE כי תוויות proteoliposome הוא אינדיקטור של demixing שומנים (המיפוזיה). שחרור תוכן מנוטר באמצעות ההתללות של אות הקלצ'ין (מוצג בירוק). לוחות A ו- B נוצרו באמצעות Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5)</td>
			<td>Avanti polar lipid</td>
			<td>Cat #: 810335C1mg</td>
			<td>membrane fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 880130P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 710335P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850375P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850757P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A20181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial with PTFE liner</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-332</td>
			<td>sample vials to keep lipid solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>298-500/ C295-4</td>
			<td>Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slide (1 well)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71878-05</td>
			<td>applied as Schaefer Slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS analysis tool</td>
			<td>Smith Lab, University of Akron</td>
			<td></td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji /ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>SCR_002285</td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP Disodium salt</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>Cat #: 10106399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langmuir &#38; Langmuir-Blodgett Trough</td>
			<td>Biolin Scientifc</td>
			<td>KN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850091P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat #: D310 25 GM</td>
			<td>surfactant for reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#945;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat #: O311HA 25 GM</td>
			<td>surfactant for reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC Membranes 0.2&#956;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Opa1 antibody</td>
			<td>NOVUS BIOLOGICALS</td>
			<td>Cat #: NBP2-59770</td>
			<td>antibody for Opa1 C-terminal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>Intelligent imaging</td>
			<td>RRID: SCR_014300</td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon threaded seal tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0636085</td>
			<td>taflon tape for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat #: T1395MP</td>
			<td>membrane fluorescent markers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model membrane platform for reconstituting mitochondrial membrane dynamics

דינמיקה מיטוכונדריאלית חיונית לפונקציות המגוונות של אורגנל ולתגובות הסלולריות. קרום המיטוכונדריה הצפוף, המורכב מרחבית, הוא סביבה מאתגרת להבחין בין גורמים רגולטוריים. שליטה ניסיונית של רכיבי חלבון ושומנים יכולה לעזור לענות על שאלות ספציפיות של רגולציה. עם זאת, מניפולציה כמותית של גורמים אלה היא מאתגרת בsays תאי. כדי לחקור את המנגנון המולקולרי של היתוך המיטוכונדריה הפנימי-קרום, הצגנו פלטפורמה במבחנה מחדש המחקה את סביבת השימנים של המיטוכונדריה הפנימית קרום. כאן אנו מתארים שלבים מפורטים להכנת דו-שכבות שומנים ורכיבה מחדש של חלבוני קרום מיטוכונדריאלי. הפלטפורמה אפשרה ניתוח של ביניים בהיתוך ממברנה פנימית מיטוכונדריאלית, ואת הקינטיות עבור מעברים בודדים, באופן כמותי. פרוטוקול זה מתאר את ייצור הדו-שכבתי עם הרכב שומנים אסימטריים ומתאר שיקולים כלליים ליצירה מחדש של חלבוני טרנסמברנה לתוך דו-שכבתי מרופד. השיטה עשויה להיות מיושמת כדי ללמוד מערכות קרום אחרות.

חלבון הטרנסמברנה התווסס מפיץ בחופשיות ומופץ באופן הומוגני בממברנה.
תמונות לדוגמה של דו-שכבת שומנים ונזילות הליפים שלה מאומת על ידי מיקרוסקופיות epifluorescence מוצגות איור 4. התפלגות שומנים דו-שכבתי לפני ואחרי פוטו-בליך מוצגת באות 4א', ב'. הומוגניות של דו-שכבת הליפידים הודמיה באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence לפני ואחרי reconstitution(איור 4D,E). l-Opa1 מחדש בדוטל שומנים אומת על ידי ספקטרוסקופיה מתאם פלואורסצית (FCS). אנו משתמשים שומנים בהלת ערך כדי להעריך את מפזר השימנים של הדו-שכבת. Opa1 משוחזר תויג באמצעות נוגדן פלואורסצנט מתויג אנטי-Opa1 C-מסוף. דיפוזיה שומנים Bilayer נמדד כמו 1.46 ± 0.12 μm2/ s, בעוד מקדם דיפוזיה של l-Opa1 דו שכבתי מחדש היה 0.88 ± 0.10 μm2/ s. קריאה בעוצמה מן עקומות FCS הצביע 75% של l-Opa1 הוא מחדש לתוך דוטל השפתיים(איור 4G,H). תוצאות אלה מצביעות על כך l-Opa1 מפזר בחופשיות את הדוטל הפולימר קשור שומנים עם פוטנציאל להרכיב את עצמו לתוך תסביך פונקציונלי.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig04.jpg"> איור 4: התפלגות שומנים וחלבון משוחזרים בממברנה מודל. (A-C) מה אתה עושה? תמונות לדוגמה של דו-שכבת שומנים ונזילות הליפים שלה מאומת על ידי מיקרוסקופיות epifluorescence. (א)הפצת שומנים הומוגניים ב-bilayer לפני פוטו-בליך. (ב)תמונה מיד לאחר ההתלתענות. (ג)Bilayer תמונה לאחר התאוששות פלואורסץ מצביע על נזילות שומנים טובה של קרום לאחר reconstitution. אנילא יודע אם אני יכול לעשות את זה. תמונות מייצגות של הפצת שומנים לפני(ד')ולאחר(ה)l-Opa1 מצביעות על כך שתהליך ההשבתה מחדש לא יצר פגמים בקוטב הדו-שכבתי. תמונת TIRF מייצגת של l-Opa1 עם תווית עם אלקסה 488 נוגדןהתואם (F)המציג התפלגות הומוגנית של Opa1 עם איסוף מחדש. G. נציג פוטן גולמי ספירות של אות L-Opa1 על ידי ספקטרוסקופיה מתאם פלורסנט. בפקד, לא התווסתה ה-L-Opa1 בדו-שכבת ההדד, בעוד הנוגדן נוסף ושטיפה. דיפוזיה של l-Opa1 הוא איטי באופן משמעותי מאשר שומנים קרום, עולה בקנה אחד עם איסוף מוצלח של טרנסמברנה l-Opa1 (H). סרגל קנה מידה: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו.</a>
הלבנת שלב פלואורסציט הצביעה על ממוצע של 2-3 עותקים של l-Opa1 שוחזרו בליפוזום נתון(איור 5א', ב). התפלגות הגודל של Proteoliposomes opa1 שוחזר נבדק לאחר השבתה באמצעות DLS (איור 5C). ההשבתה מחדש של Opa1 בפרוטאוליפוסומים אומתה גם באמצעות FCS. מקדם דיפוזיה של נוגדן חינם היה 164 ± 22 μm2/s; מקדם דיפוזיה לליפוזומים המסומנים בצבע שומנים היה 2.22 ± 0.33 μm2/s, ומקדם דיפוזיה עבור פרוטאוליפוזומים l-Opa1 קשור TexasRed שכותרתו נוגדן שלו היה 2.12 ± 0.36 μm2/s.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig05.jpg"> איור 5: ייצור ואפיון פרוטאוליפוזומים. (א)צעדים בזיוף פרוטאוליפוזה עם קלצ'ין עטוף, מרווה. (ב)נתונים מייצגים של הלבנת צעד פלורסנט להראות בממוצע של 2-3 עותקים של l-Opa1 מוטבע ליפוסום. (ג)הפצות גודל מייצג של פרוטאוליפוזומים (אדום) ללא כל נוקלאוטיד 1 שעה לאחר דגירה GTP (ירוק). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
זיהוי של רצועה קרום, demixing שומנים / המיפוז, ופתח נקבוביות על ידי מיקרוסקופ פלורסנט.
רצועה קרום מנוטר על ידי התבוננות האות של TexasRed על פני השטח של דו שכבת שומנים באמצעות מיקרוסקופ TIRF(איור 6A). התנהגות דמיקסינג שומנים קרום (המיפוזיה) היה במעקב דרך TexasRed כמו הצבע מפזר מן הליפוזומים לתוך דו שכבת השימנים. ההתנקות של Calcein מסייעת להבחין בין היווצרות נקבוביות היתוך מלאה לבין דמיקסינג שומנים בלבד. הדבר מאפשר השוואה בין תנאים שבהם חלקיקים דוהים בהמיתוך (איור 6B), לבין חלקיקים המשכים להתיתוך מלא(איור 6C).
רצועה קרום מסומן על ידי אות שומנים יציב ים מליפוזומים. ניתן להעריך את המרחק בהתבסס על אות FRET בין התוויות של שתי ממברנות36. אות המיתוך אינו כולל dequenching באות calcein(איור 6B, שורה נמוכה), אבל ריקבון מהיר של האות TexasRed מצביע על דיפוזיה של הצבע לתוך דו שכבת השימנים(איור 6B שורה עליונה). היתוך מלא (עם פתיחת נקבוביות) כולל גם ריקבון שומנים ושחרור תוכן (איור 6C). TexasRed עוצמה ועוצמת calcein ניתן לעקוב באופן תלוי זמן כדי לספק פירוט כמותי עבור הקינטיים של היתוך קרום36.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig06.jpg"> איור 6: תוצאות מייצגות המציגות רצועה של חלקיקים (A, סרגל קנה מידה 10 μm), המיתוך (B, סרגל קנה מידה 0.5 μm) והיתוך (C, סרגל קנה מידה 0.5 μm). (א)פרוטאוליפוזה קשור Opa1-משוחזר שומנים דו שכבתי לפני תוספת GTP. דוגמהלהמיפוזיה. השורה העליונה ב- B מציגה demixing שומנים (אות TexasRed, אדום), שורה נמוכה יותר ב- B מראה שום שחרור תוכן (אות calcein, ירוק) בתנאים אלה. (ג)סימן מייצג של התזה פרוטוליפוזום עם דו-שכבת הליפידים. ניתן לצפות בפרסום תוכן מתמונות בשורה התחתונה של הצגת ההתרעה של calcein (שורה נמוכה יותר, ירוק). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics at JoVE.com

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

היתוך מיטוכונדריאלי הוא תגובה הוםוסטטית חשובה הבסיסית לדינמיקה המיטוכונדריאלית. מתואר כאן היא מערכת איסוף חוץ תוך כדי לימוד היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שיכול לפתור רצועה קרום, עגינה, המיתוך, ופתיחת נקבוביות. הרב-תכליתיות של גישה זו בחקר מערכות קרום התא נדון.

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

בחלקיק זה, אנו מציגים פלטפורמת התחדשות במבחנה המחקה את סביבת השומנים של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה. פלטפורמה זו יכולה לשמש כדי לחקור מנגנונים מולקולריים של היתוך קרום פנימי מיטוכונדריה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת חקירה כמותית של חלבוני קרום אינטגרליים וחלבונים הקשורים לממברנה בסביבה כמעט ילידית.כדי להתחיל, לערבב פתרונות A ו- B על פי הוראות כתב יד, ולאחר מכן ליצור את תערובת השומנים על ידי הוספת נפח מחושב של פתרון אחסון לתוך בקבוקונים ענבר עם מזרק זכוכית. התאם את עוצמת הקול הסופית על-ידי הוספת כלורופורם נוסף לבקבוקונים. אופים מגלשות כיסוי מיקרוסקופ ב 520 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.לאחר האפייה, מקררים אותם לטמפרטורת החדר. מוסיפים כ 10 גרם של נתרן הידרוקסידי ל 500 מיליליטר של מתנול תוך ערבוב. מערבבים במשך שעתיים, ממשיכים להוסיף נתרן הידרוקסידי לפתרון עד שהמשקעים מתחילים להראות.נקו את מגלשות הזכוכית בתווית דודיציל סולפט של 10%, מתנול רווי נתרן הידרוקסידי וחומצה הידרוכלורית 50 מילימולרית, באמבטיה רציפה המנקה את המגלשות בכל תנאי למשך 30 דקות. נקה את מגלשות הזכוכית במים אולטרה-חמים במשך 10 דקות בין כל תנאי. אחסן את הכיסוי הנקי האטום בתתווית חומצה הידרוכלורית למשך עד שבועיים כדי להבטיח איכות דו שכבתית טובה.נקו את שוקת הפוליטטרה-שפעת-אתילן של מערכת הטבילה Langmuir-Blodgett באמצעות כלורופורם ומים אולטרה-פלורים עד שלא נצפתה הרטבה. לרסס כלורופורם על פני השוקת ולנגב אותו ביסודיות שלוש פעמים עם מגבונים תאית, ולאחר מכן לשטוף אותו שלוש פעמים עם מים אולטרה פלור ולהסיר את המים באמצעות יניקה. בסיום, מכסים את פני השוקת במים אולטרה-חמים נקיים.קח שתי חתיכות של משטח מטופל coverglass מתסכולת הניקוי ולשטוף אותם עם מים אולטרה חוץ במשך כ 30 שניות. הנח את הכריכה באופן גב אל גב באמצעות מהדק המצע כדי להחזיק את מגלשות הזכוכית. לטבול את החלקת הזכוכית מתחת לפני המים על ידי לחיצה ידנית dipper למטה על מערכת הבקרה Langmuir.אפס את מאזן הסרט ולהפיץ בזהירות פתרון B טיפה אחר טיפה בממשק מי האוויר. ודא שומנים מתפשטים רק בממשק מי האוויר ללא טיפות כלורופורם ושומנים שוקעים לתחתית פני השטח polytetrafluoroethylene, אשר תיצור ערוץ השומנים ולמנוע היווצרות monolayer. להפסיק להוסיף שומנים כאשר הקריאה איזון הסרט הוא סביב 15 עד 20 מיליניוטון למטר.המתן 10 עד 15 דקות ולאחר מכן ליזום את בקר המחסום כדי לשנות את שטח הפנים על ידי לחיצה על להתחיל ניסוי. המתן עד שקריאת מאזן הסרטים תגדל ל-37 מיליניוטון למטר ותשמור על הלחץ למשך כ-20 עד 30 דקות. הרם את הכיסוי במהירות של 22 מילימטרים לדקה תוך שמירה על מתח פני השטח במהירות של 37 מילניטון למטר.מונוליאר השומנים עם קשירת פולימר יועבר מממשק מי האוויר אל פני השטח של coverglass דרך תהליך הטבילה Blodgett, ויוצרים את העלון התחתון של השומנים דו שכבתי. נקה את ממשק מי האוויר על ידי יניקה ולשטוף את השוקת עם מים אולטרה שופך. לאחר ניקוי מגלשת זכוכית חד-היטב עם כלורופורם, אתנול ומים אולטרה-חמים, מניחים אותה על השוקת שמתחת לשכבת המים.ודא כי באר פונה כלפי מעלה לכיוון ממשק מי האוויר ויוצקים מים אולטרה-חמים טריים עד מגלשת הזכוכית מכוסה במלואה, ולאחר מכן לטבול את מגלשת הזכוכית מתחת לפני המים כפי שתואר קודם לכן. החזק את coverglass עם monolayer השומנים באמצעות יניקה סיליקון בעדינות לדחוף את monolayer השומנים לממשק מי האוויר. החזק את זכוכית הכיסוי למשך שתיים עד שלוש שניות בממשק ולאחר מכן דחוף אותה כנגד השקופית.תוציא את המגלשה עם הכריכה. קחו את הכריכה ואת הדו-שכבתי למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי ודמיין את השומנים דו-שכבתיים בהתאם לכיווני כתב היד של הטקסט. מכינים צלחת התגבשות המכילה מים אולטרה-חמים ומ מניחים טבעת תמונת מיקרוסקופ נקייה מתחת לצלחת.לטבול את השקופית ואת coverglass המכילים את השומנים דו שכבה מתחת למים. הפרד בעדינות את השקופית ואת הכיסוי, החזק את החלקת הכריכה מלמטה והעבר את כיסוי המשקפיים לטבעת התמונה. החלף את המים האולטרה-פלורים בטבעת התמונה במאגר נתרן כלוריד ביס-טריס, ודא שהשכבה הדו-שכבתית של השומנים אינה חשופה לבועות אוויר כלשהן.הוסף 1.1 ננו-מולאר n-אוקטיל-בטא-glucopyranoside לשכבה הדו-שכבתית השומנים, ולאחר מכן מיד להוסיף את התערובת של 1.2 ננו-מולאר DDM ו 1.3 picomoles של L-OPA1 מטוהרים לתוך טבעת התמונה. דגירה המדגם על שייקר ספסל העליון במהירות נמוכה במשך שעתיים. להפיץ 30 מיליגרם SM-2 שושף חרוזים לתוך שלושה מיליליטר של חיץ ביס-טריס ולנער.השתמש פיפטה פלסטיק להוסיף 5 עד 10 microliters של חרוזים SM-2 שף לטבעת התמונה דגירה אותו במשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף את גם. אמצעי האחסון הסופי של המאגר בטבעת התמונה צריך להיות 1.5 מיליליטר. מכינים מיליגרם אחד של תערובת שומנים A בתספורם כלורופורם, ואז להתאדות כלורופורם תחת זרימת חנקן במשך 20 דקות.שמור את התערובת תחת ואקום לילה כדי ליצור סרט השומנים. להכין 50 מילימולר סידן המכיל חיץ על ידי המסת 15.56 גרם של קלצין ב 50 מיליליטר של 1.5 תמיסת נתרן הידרוקסיד טוחנת. מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר עד קלצ'ין מומס לחלוטין.הוסף 12.5 מילימולרים ביס-טריס ומים אולטרה-חיים לנפח סופי של 500 מיליליטר והתאם את ה- pH ל- 7.5. לוותר על סרט השומנים בקלצין המכיל חיץ, ולאחר מכן לחות את השומנים באופן מלא על ידי חימום ההשעיה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. טופס 200 ליפוזומים ננומטר באמצעות שבלט עם קרום פוליקרבונט.הוסף שני מיקרוגרם של L-OPA1 ב 0.5 micromolar DDM, 2.2 מיליגרם ליפוזום דגירה הפתרון בארבע מעלות צלזיוס במשך 1.5 שעות. הסר את החומר הדיאליזה על ידי דיאליזה עם קלטת דיאליזה 3.5 קילודלטון נגד 250 מיליליטר של 25 מילימולרים ביס-טריס, 150 מילימולר נתרן כלורי, ו 50 מילימולר חיץ סידן בארבע מעלות צלזיוס לילה, שינוי החיץ פעמיים. הסר קלסין נוסף באמצעות עמודת התפלה PD10, ולאחר מכן המשך עם הדמיה וניתוח נתונים כמתואר בכתב היד של הטקסט.תמונות מיקרוסקופיה Epifluorescence של שומנים דו שכבתיים נזילות השומנים שלה מוצגים כאן. התפלגות השומנים מוצגת לפני ואחרי הלבנת תמונות וההומוגניות מוצגת לפני ואחרי ההלבנה מחדש. L-OPA1 מחדש ושומנים דו שכבה אומתה על ידי ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי או FCS.עקומות FCS הצביעו על כך ש-75% מ- L-OPA1 שוחזר לתוך שכבת השומנים הדו-שכבתית, דבר המצביע על כך ש- L-OPA1 מתפזר בחופשיות בשכבת השומנים הפולימרית עם פוטנציאל להרכבה עצמית למתחמים פונקציונליים. הלבנת צעדים פלואורסצנטיים הצביעה על כך שממוצע של שניים עד שלושה עותקים של L-OPA1 שוחזרו בליפוזום נתון. התפלגות הגודל של פרוטאוליפוזום משוחזר L-OPA1 נבדקה לאחר התחדשות באמצעות DLS ואומתה באמצעות FCS.קשירת קרום היה במעקב על ידי התבוננות האות של טקסס אדום על פני השטח של השומנים דו שכבתי באמצעות מיקרוסקופ TIRF. ממברנה השומנים דה ערבוב או hemifusion היה במעקב דרך טקסס אדום כמו סמן ליפוזום מפוזר לתוך השומנים דו שכבתי. Calcein de-quenching עזר להבחין היווצרות נקבוביות היתוך מלא רק ליפיד דה ערבוב, המאפשר השוואה בין תנאים שבהם חלקיקים לעכב ב hemifusion וחלקיקים להמשיך היתוך מלא.קשירת ממברנה הצביעה על ידי אות שומנים יציב מליפוזומים ואות התפכחויות לא כללה דה-מרווה באות הקלצין, אך ריקבון מהיר של האות האדום של טקסס הצביע על דיפוזיה של הצבע לתוך השומנים הדו-שכבתיים. היתוך מלא כלל הן ריקבון השומנים והן שחרור תוכן. כאשר מנסים את החלקיק הזה, זכור לנקות ביסודיות הן את coverglass ואת שוקת Langmuir כדי להבטיח דו שכבות באיכות גבוהה מפוברקים.איכות אוויר טובה היא גם קריטית כדי למנוע פגמים דו שכבתי. טכניקה זו סוללת לנו את הדרך לחקור שאלות חדשות בדינמיקה של קרום המיטוכונדריה ובארגון. ניסוי עתידי מרגש כולל חקירת ההשפעה של א-סימטריה דו-שכבתית, פוטנציאל קרום ומוטנטים הקשורים למחלות בדינמיקה של הממברנה הפנימית של המיטוכונדריה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Mitochondria and Energy Production

SCIENTISTS IN ACTION

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

אריזת חלבון בימוי בתוך החיצון ממברנה השלפוחית ​​מ<em&gt; Coli Escherichia</em&gt;: עיצוב, ייצור טיהור

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Inner-קרום חיידקי תצוגה להקרנת ספרייה של שברי נוגדן

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

קרום המוח Fractation: An<em&gt; אקס ויוו</em&gt; גישה כדי להעריך לוקליזציה חלבון subsynaptic

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

אפיון מובילי הממברנה על ידי ביטוי הטרוולוגי ב -E. coli וייצור ממברנה ושלפוחיות

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

הקרנה עבור התרמוטוגה מארימה ממברנה מאוגדות פירופוספטאז מעכבי

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

PeptiQuick, שילוב של צעד אחד של חלבונים ממברנות לתוך ביוטילדיסקי Peptiquick עבור כריכת חלבון מפושטת

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...