Name: a model membrane platform for reconstituting mitochondrial membrane dynamics
Uploaded: 2020-09-02T15:00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics at JoVE.com

लेखकों चार्ल्स एच हूड फाउंडेशन बाल स्वास्थ्य अनुसंधान पुरस्कार और मैसाचुसेट्स जनरल अस्पताल में आणविक जीव विज्ञान विभाग से उदार समर्थन से समर्थन स्वीकार करते हैं ।

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कोई नहीं.

इन विट्रो मॉडल-झिल्ली सिस्टम अच्छी तरह से परिभाषित स्थितियों के तहत जटिल झिल्ली प्रक्रियाओं का वर्णन कर सकते हैं। ये प्रणालियां जटिल आणविक प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक न्यूनतम घटकों को आणविक तंत्र 6,15,20,,38से प्रकट करने के लिए अलग कर सकती हैं ।15 झिल्ली प्रोटीन के लिए, लिपोसोम्स और प्लानर समर्थित बिलेयर आम पुनर्गठन प्रणाली हैं। ठोस समर्थित लिपिड बिलायर के विपरीत, पॉलीमर-टेथर्ड बाइलियर्स में सब्सट्रेट और समर्थित झिल्ली के बीच बहुलक तकिया बड़े झिल्ली प्रोटीन की मुफ्त गतिशीलता की अनुमति देता है, और ट्रांसमेम्ब्रेन-प्रोटीन को स्वतंत्र रूप से34को फैलाना और इकट्ठा करने की अनुमति देता है। इन विशेषताओं ने हमें माइटोकॉन्ड्रिया इनर-झिल्ली संलयन36के काइनेटिक्स की जांच करने में मदद की।
हमने लैंगम्यूर-ब्लॉडगेट/लैंगमुइर-शेफर (एलबी/एलएस) तकनीकों का उपयोग करके एक बहुलक-सीमित लिपिड बाइलेयर तैयार किया । यह हमें असममित लिपिड घटकों के साथ एक बाइलेयर तैयार करने की अनुमति देता है। सेलुलर झिल्ली में असममित पत्रक संरचना होती है, और एलबी/एलएस दृष्टिकोण ऐसे बाइलेयर्स के अध्ययन की अनुमति देता है। शेफर ट्रांसफर के साथ, एक पूरे ग्लास सब्सट्रेट को लिपिड बाइलेयर द्वारा कवर किया जा सकता है। बाइलेयर तैयारी के लिए एक साफ सतह तैयार करना महत्वपूर्ण है। इसके अतिरिक्त, यह एक Schaefer हस्तांतरण सही ढंग से प्रदर्शन करने के लिए अभ्यास लेता है । असफल शेफर स्थानांतरण लिपिड बाइलेयर में अवांछित दोष पैदा कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में फिल्म बैलेंस में जोड़ा गया प्रेशर 20% कार्डियोलिपिन वाले बाइलेयर के लिए लागू होता है। अन्य घटकों के साथ बाइलेयर्स के लिए, प्रमुख घटकों के सतह दबाव-क्षेत्र को संदर्भित करें। एक वैकल्पिक विधि लैंगमुर-ब्लॉडगेट/वेसिकल फ्यूजन (एलबी/वीएफ) विधि है, जहां नीचे लिपिड मोनोलेयर को एक लैंगमुर गर्त के हवा-पानी इंटरफेस से एक साफ सब्सट्रेट पर स्थानांतरित किया जाता है, फिर लिपोसोम समर्थित लिपिड मोनोलेयर के शीर्ष पर फ्यूज होते हैं और अंतिम बिलेयर39बनाते हैं। एलबी/वीएफ विधि का उपयोग करके झिल्ली प्रोटीन का पुनर्गठन एलबी/एलएस की तुलना में अधिक सीधा है, क्योंकि पुनर्गठन प्रोटियोलिपोसोम्स के संलयन के माध्यम से किया जा सकता है । हालांकि, वेसिकल फ्यूजन को अतिरिक्त लिपोसोम्स के अलावा की आवश्यकता होती है, जो एकाग्रता पर निर्भर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन पर निर्भर झिल्ली की घटनाओं के अध्ययन को जटिल बना सकता है।
एक पसंदीदा कार्यात्मक अभिविन्यास में बहुलक-टेथरेड लिपिड बाइलेयर्स और लिपोसोम दोनों में ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन का सफल पुनर्गठन महत्वपूर्ण है, फिर भी लागू करना मुश्किल है। इसके लिए प्रायोगिक नियंत्रणों की आवश्यकता है। बहुलक-सीमित लिपिड बिलायर के लिए, पुनर्गठन के दौरान लिपिड बाइलेयर की अखंडता को बनाए रखना भी महत्वपूर्ण है। लिपिड बाइलेयर को भंग करने से रोकने के लिए सर्फेक्टेंट सांद्रता को अपेक्षाकृत कम रखा जाना चाहिए, लेकिन ब्याज37,,40के प्रोटीन के विकृति को रोकने के लिए पर्याप्त उच्च। यहां वर्णित विधि एकल अणु अध्ययनों के लिए झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए आदर्श है, लेकिन बड़े पैमाने पर अध्ययन के लिए जरूरी नहीं है। सर्फेक्टेंट विकल्प एक और महत्वपूर्ण विचार है। अक्सर, शुद्धिकरण और भंडारण के लिए उपयोग किया जाने वाला सर्फेक्टेंट एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। सर्फेक्टेंट की अधिकतम एकाग्रता आमतौर पर सीएमसी36के ~ 200 गुना कम होती है, एक ऐसी सीमा में जहां सर्फेक्टेंट प्रोटीन स्थिरता बनाए रखता है और झिल्ली36की अखंडता को बनाए रखता है। 2 या 3 सर्फेक्टेंट युक्त कॉकटेल पर विचार किया जा सकता है। लिपोसोम्स में पुनर्गठन के लिए, सर्फेक्टेंट की कम एकाग्रता आवश्यक नहीं है। हालांकि, सीएमसी के नीचे सर्फेक्टेंट सांद्रता लिपोसोम्स के लिए एक समान आकार और आकृतिविज्ञान वितरण को बनाए रखने के लिए बेहतर है। सामग्री डाई के रिसाव को रोकने के लिए, डाई युक्त बफर के खिलाफ डायलाइज़ करना आवश्यक है।
लिपोसोम-आधारित संलयन परख के विपरीत, हमने जो मंच स्थापित किया है वह झिल्ली संलयन के प्रत्येक चरण के काइनेटिक्स की जांच करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है। यह विधि निकट-देशी परिस्थितियों में ट्रांसमेम्ब्रान फ्यूजन प्रोटीन का अध्ययन करने की क्षमता प्रदान करती है। मॉडल झिल्ली प्लेटफार्मों झिल्ली प्रोटीन विधानसभा और अल्पाधिकार, झिल्ली "मूर्तिकला", और उपकोशिकीय वातावरण में प्रोटीन के प्रोटीन लिपिड बातचीत, माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली की तरह अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है । यह विधि झिल्ली-प्रोटीन इंटरप्ले में महत्वपूर्ण शारीरिक स्थितियों की खोज की अनुमति देती है, जैसे कि बाइलेयर संरचना विषमता। लिपोसोम्स और पॉलीमर समर्थित बाइलेयर्स दोनों के बाइलेयर गुणों में एक प्रमुख माइटोकॉन्ड्रियल लिपिड, कार्डियोलिपिन की भूमिका को परिभाषित किया जाना बाकी है। आयनिक शक्ति, झिल्ली मोटाई, झिल्ली कठोरता, झिल्ली वक्रता, और झिल्ली लोच गुण जैसे गुण सभी विशिष्ट कार्यात्मक राज्यों में असेंबली करने के लिए प्रोटीन की क्षमता को प्रभावित कर सकते हैं। भविष्य के अध्ययन रचनात्मक मॉडल झिल्ली प्रणाली लागू करने के लिए झिल्ली प्रोटीन संगठन और समारोह के नए पहलुओं को उजागर करने की क्षमता है ।

झिल्ली विभाजन यूकेरियोटिक कोशिकाओं की एक बानगी है1 (चित्रा 1A)। जैविक झिल्ली को दो आयामी सॉल्वेंट से अधिक के रूप में पहचाना जाता है, और प्रोटीन फ़ंक्शन और मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स असेंबली2, 3,को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने वाले वातावरण के रूप में मानाजाताहै। देशी लिपिड लिगांड होते हैं जो झिल्ली प्रोटीन गतिविधि को विनियमित करते हैं3,4 झिल्ली स्थानिक संगठन और झिल्ली की विविध आकृतियों में मूर्तिकला की क्षमता नए कार्यों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण भौतिक गुण हैं3, 5,5.
मॉडल झिल्ली प्लेटफॉर्म बायोमिमेटिक सिस्टम हैं जो हमें सेलुलर झिल्ली संरचना, गतिशीलता और फ़ंक्शन6,,7,8को समझने में मदद करसकतेहैं। मॉडल झिल्ली में आम तौर पर परिभाषित जैव भौतिक गुणों (कठोरता, मोटाई और लोच) के साथ अच्छी तरह से परिभाषित संरचना का एक लिपिड मिश्रण शामिल होता है। फ्लोरेसेंस इमेजिंग के साथ मिलकर, मॉडल झिल्ली प्लेटफॉर्म झिल्ली संरचना,और कार्य9,10, 11के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमतिदेतेहैं।, लिपिड बाइलेयर पुनर्गठन रणनीतियों का उपयोग जाल-मध्यस्थता झिल्ली संलयन9,10,डीएनए-मध्यस्थता झिल्ली संलयन 12, और वायरल फ्यूजन,11,,13का अध्ययन करने के लिए किया गया है।11 इस तरह के तरीकों का लाभ एक नमूदार प्रतिक्रिया घटना14से पहले मध्यवर्ती चरणों के लिए गतिज जानकारी प्राप्त करने की क्षमता है ।
प्लाज्मा झिल्ली बड़े पैमाने पर मॉडल झिल्ली का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। लिपिड चरण पृथक्करण वाले बाइलेयर्स को सेलुलर सिग्नलिंग11 , 15,,16में महत्वपूर्ण लिपिडबेड़ासंरचनाओं का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है । सेल रिसेप्टर्स के संगठन की जांच के लिए माइक्रोपैटर्न्ड लिपिड प्लानर बाइलेयर्स17,,18 का उपयोग किया गया है। झिल्ली-साइटोस्केलेटन संगठन, सेल सिग्नलिंग के दौरान झिल्ली प्रोटीन विभाजन, और सेल-सेलसंपर्कों 19पर माइग्रेशन का अध्ययन करने के लिए पॉलीमिमेटिक सिस्टम के रूप में बहुलक या जेल समर्थित झिल्ली का उपयोग किया गया है।
उपकोशिकीय ऑर्गेनेल्स20का अध्ययन करने के लिए कृत्रिम झिल्ली प्रणालियां भी लागू की जा रही हैं । ऑर्गेनेल्स में विशिष्ट मॉर्फोलोजी होते हैं जो अलग-अलग उप-वातावरण बनाते हैं। एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) नेटवर्क एक उदाहरण है। लिपोसोम्स में रेटिकुलन के पुनर्गठन पर, सेलुलर ईआर के समान गुणों के साथ ट्यूबलर झिल्ली संरचनाएं21बनती हैं। एटास्टिन के अलावा, एक ईआर फ्यूजन प्रोटीन, लिपिसोम्स से लिपिड ट्यूबल को एक नेटवर्क20बनाने के लिए प्रेरित कर सकता है। यह एक उदाहरण है कि प्रोटियोलोपसोम ऑर्गेनेल आकृति विज्ञान और गतिशीलता में कार्यात्मक अंतर्दृष्टि कैसे प्रदान कर सकते हैं।
माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संलयन और विखंडन22 , 23, 24 ,,,25केस्वास्थ्यकेलिए आवश्यक हैं ।24 डायनामिन परिवार का एक सेट जीटीपैस माइटोकॉन्ड्रिया झिल्ली संलयन को उत्प्रेरित करता है। एमएफएन 1/2 बाहरी झिल्ली संलयन को उत्प्रेरित करता है। Opa1 मध्यस्थता आंतरिक झिल्ली संलयन26 (चित्रा 1B)। Opa1 के दो रूप हैं: एक लंबा रूप (एल-ओपा1), माइटोकॉन्ड्रियल इनर-झिल्ली के लिए ट्रांसमेम्ब्रान-लंगर, और इंटरमेम्ब्रेन अंतरिक्ष में मौजूद एक 'घुलनशील' लघु रूप (एस-Opa1) । दो Opa1 रूपों का अनुपात दो प्रोटेस, ओमा1 और Yme1L,,27, 28, 29,,30की गतिविधि द्वारा विनियमित कियाजाताहै।30 Opa1 विनियमन में महत्वपूर्ण प्रश्नों में शामिल हैं: ओपा1 के दो रूप, (छोटे और लंबे) झिल्ली संलयन और उनके नियामक परस्पर क्रिया28,29, 31,,,32,,,33कैसे मध्यस्थता करते हैं।32
यहां हम माइटोकॉन्ड्रियल इन-झिल्ली संलयन की जांच करने के लिए सफलतापूर्वक लागू एक पुनर्गठन रणनीति का वर्णन करते हैं जिसने आंतरिक झिल्ली संलयन में एल-और एस-ओपा1 की भूमिकाओं को स्पष्ट किया। हमने एक पॉलीमर-टेथर्ड लिपिड बाइलेयर और 200 एनएम यूनिलैमलर वेसिकल्स का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल इनर-झिल्ली की नकल करने वाला एक मंच विकसित किया। लिपिड बाइलेयर के नीचे एक बहुलक तार के लाभों में निम्नलिखित शामिल हैं। सबसे पहले, यह पुनर्गठित ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन को संरक्षित करता है, जो अन्यथा ग्लास स्लाइड34की निकटता से बाधित हो सकता है। दूसरे, यह लिपिड बाइलेयर और ग्लास सब्सट्रेट के बीच एक मोटी पानी की परत में कार्य करता है, जो पोर खोलने9के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है, और तीसरा खूंटी बहुलक की चिपचिपा प्रकृति झिल्ली वक्रता35को बदलने की अनुमति देती है। हमने झिल्ली संलयन(चित्रा 1सी-एफ)में चरणों की विशेषता के लिए तीन-रंग फ्लोरेसेंस इमेजिंग का उपयोग किया।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig1v2.jpg"> चित्रा 1: माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संलयन की निगरानी। (A)ऑर्गेनेल्स सेलुलर झिल्ली के डिब्बे होते हैं। (ख)माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संलयन के अनुक्रमिक कदम। माइटोकॉन्ड्रिया की बाहरी झिल्ली का संलयन Mfn1 और/या Mfn2 द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है, जबकि आंतरिक झिल्ली संलयन Opa1 द्वारा मध्यस्थता की जाती है । (सी-एफ) माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संलयन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो पुनर्गठन मंच की योजनाबद्ध। मंच में दो भाग शामिल हैं: एक प्रोटियोलिपोसोम और एक बहुलक-टेथर्ड लिपिड बाइलेयर, दोनों पुनर्गठित एल-Opa1 के साथ। फ्लोरोसेंट लेबल, जिसमें दो अलग-अलग फ्लोरोसेंट झिल्ली रंग और एक सामग्री मार्कर शामिल हैं, झिल्ली संलयन के दौरान चरणों को अलग करने में मदद करते हैं। दो झिल्ली मार्कर (Cy5-PE (लाल) और टेक्सासरेड पीई (नारंगी) एक FRET जोड़ी बनाते हैं, जो क्लोज झिल्ली डॉकिंग पर रिपोर्ट कर सकते हैं। टेक्सासरेड-पीई का प्रसार जो प्रोटियोलिपोम को लेबल करता है, लिपिड डेमिक्सिंग (हेमिफसियन) का संकेतक है। सामग्री रिलीज कैल्सीन सिग्नल (हरे रंग में दिखाया गया) के dequenching के माध्यम से निगरानी की जाती है। बायोरेंडर का उपयोग करके बनाए गए पैनल ए और बी। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5)</td>
			<td>Avanti polar lipid</td>
			<td>Cat #: 810335C1mg</td>
			<td>membrane fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 880130P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 710335P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850375P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850757P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A20181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial with PTFE liner</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-332</td>
			<td>sample vials to keep lipid solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>298-500/ C295-4</td>
			<td>Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slide (1 well)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71878-05</td>
			<td>applied as Schaefer Slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS analysis tool</td>
			<td>Smith Lab, University of Akron</td>
			<td></td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji /ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>SCR_002285</td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP Disodium salt</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>Cat #: 10106399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langmuir &#38; Langmuir-Blodgett Trough</td>
			<td>Biolin Scientifc</td>
			<td>KN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850091P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat #: D310 25 GM</td>
			<td>surfactant for reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#945;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat #: O311HA 25 GM</td>
			<td>surfactant for reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC Membranes 0.2&#956;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Opa1 antibody</td>
			<td>NOVUS BIOLOGICALS</td>
			<td>Cat #: NBP2-59770</td>
			<td>antibody for Opa1 C-terminal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>Intelligent imaging</td>
			<td>RRID: SCR_014300</td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon threaded seal tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0636085</td>
			<td>taflon tape for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat #: T1395MP</td>
			<td>membrane fluorescent markers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model membrane platform for reconstituting mitochondrial membrane dynamics

ऑर्गेनेल के विविध कार्यों और सेलुलर प्रतिक्रियाओं के लिए माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता आवश्यक है। भीड़, स्थानिक रूप से जटिल, माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली नियामक कारकों को अलग करने के लिए एक चुनौतीपूर्ण वातावरण है। प्रोटीन और लिपिड घटकों का प्रायोगिक नियंत्रण विनियमन के विशिष्ट प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकता है। फिर भी, इन कारकों में मात्रात्मक हेरफेर सेलुलर परख में चुनौतीपूर्ण है। माइटोकॉन्ड्रिया इनर-झिल्ली संलयन के आणविक तंत्र की जांच करने के लिए, हमने एक इन विट्रो पुनर्गठन मंच पेश किया जो माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक झिल्ली के लिपिड वातावरण की नकल करता है। यहां हम लिपिड बाइलेयर्स तैयार करने और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए विस्तृत चरणों का वर्णन करते हैं। मंच ने माइटोकॉन्ड्रियल आंतरिक-झिल्ली संलयन में मध्यवर्ती के विश्लेषण और मात्रात्मक तरीके से व्यक्तिगत संक्रमण के लिए काइनेटिक्स की अनुमति दी। यह प्रोटोकॉल असममित लिपिड संरचना के साथ बाइलेयर्स के निर्माण का वर्णन करता है और एक तकिया बाइलेयर में ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन के पुनर्गठन के लिए सामान्य विचारों का वर्णन करता है। विधि अन्य झिल्ली प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

पुनर्गठित ट्रांसमेम्ब्रान प्रोटीन स्वतंत्र रूप से फैलता है और झिल्ली में सजातीय रूप से वितरित किया जाता है।
उदाहरण के लिए लिपिड बाइलेयर और उसके लिपिड तरलता की छवियां जो एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मान्य हैं , चित्र 4में दिखाई गई हैं । फोटोब्लैचिंग से पहले और बाद में बाइलेयर में लिपिड वितरण चित्र 4ए, बीमें दिखाया गया है । लिपिड बाइलेयर की एकरूपता को पुनर्गठन से पहले और बाद में एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कल्पना की गई थी(चित्रा 4डी, ई)। लिपिड बाइलेयर में पुनर्गठित एल-ओपा1 को फ्लोरेसेंस सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) द्वारा मान्य किया गया था। हम बाइलेयर की लिपिड डिफ्यूजनिटी का मूल्यांकन करने के लिए डाई संयुग्मित लिपिड का उपयोग करते हैं। पुनर्गठित Opa1 को फ्लोरोसेंट-टैग एंटी-Opa1 सी-टर्मिनल एंटीबॉडी का उपयोग करके लेबल किया गया था। बाइलेयर लिपिड प्रसार को 1.46 ± 0.12 माइक्रोन2/s के रूप में मापा गया था, जबकि बाइलेयर-पुनर्गठित एल-ओपा1 का प्रसार गुणांक 0.88 ± 0.10 माइक्रोन2/s था। एफसीएस वक्र्स से तीव्रता रीडआउट ने संकेत दिया कि एल-ओपा1 का 75% लिपिड बाइलेयर(चित्रा 4जी, एच)में पुनर्गठित किया गया है। इन परिणामों से पता चलता है कि एल-ओपा1 स्वतंत्र रूप से बहुलक-सीमित लिपिड बाइलेयर में स्वयं को कार्यात्मक परिसरों में इकट्ठा करने की क्षमता के साथ फैलाता है।
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig04.jpg"> चित्र 4: मॉडल झिल्ली में लिपिड और पुनर्गठित प्रोटीन का वितरण। (ए-सी) एक लिपिड बाइलेयर और उसके लिपिड तरलता की उदाहरण छवियां एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा मान्य हैं। (Aफोटोब्लैचिंग से पहले बाइलेयर में सजातीय लिपिड वितरण। (ख)फोटोब्लैचिंग के तुरंत बाद स्नैपशॉट । (ग)फ्लोरेसेंस रिकवरी के बाद चित्रित बिलेयर पुनर्गठन के बाद झिल्ली की अच्छी लिपिड तरलता को इंगित करता है । (D,E) पहले(डी)और ई के बाद(ई)एल-Opa1 पुनर्गठन के प्रतिनिधि छवियों से संकेत मिलता है कि पुनर्गठन प्रक्रिया ने बाइलेयर में दोष पैदा नहीं किया । एलेक्सा 488 संयुग्मित एंटीबॉडी(एफ)के साथ लेबल एल-Opa1 की प्रतिनिधि TIRF छवि पुनर्गठन पर Opa1 का एक सजातीय वितरण दिखा। जी प्रतिनिधि कच्चे फोटॉन फ्लोरोसेंट सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा एल-Opa1 संकेत की गिनती । नियंत्रण में, कोई एल-Opa1 बिलेयर में पुनर्गठन किया गया था, जबकि एंटीबॉडी जोड़ा और कुल्ला किया गया था । एल-Opa1 का प्रसार झिल्ली में लिपिड की तुलना में काफी धीमा है, जो ट्रांसमेम्ब्रेन एल-ओपा1(एच)के सफल पुनर्गठन के अनुरूप है। स्केल बार: 10 माइक्रोन करें इस <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig04large.jpg" target="_blank">आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
फ्लोरेसेंस स्टेप ब्लीचिंग ने संकेत दिया कि एल-ओपा1 की औसतन 2-3 प्रतियां दिए गए लिपोसोम(चित्रा 5ए, बी)में पुनर्गठित की गई थीं। डीएलएस(चित्रा 5सी)का उपयोग करके पुनर्गठन के बाद Opa1 पुनर्गठित प्रोटिटोलिपोसोम के आकार वितरण का परीक्षण किया गया था। प्रोटियोलिपोसोम्स में Opa1 के पुनर्गठन को भी एफसीएस का उपयोग करके सत्यापित किया गया था। मुक्त एंटीबॉडी का प्रसार गुणांक 164 ± 22 माइक्रोन2/ लिपिड डाई के साथ लेबल किए गए लिपोसोम्स के लिए प्रसार गुणांक 2.22 ± 0.33 माइक्रोन2/s था, और एल-ओपा1 प्रोटियोलिपोसोम के लिए प्रसार गुणांक एक टेक्सासरेड लेबल एंटी-उनकी एंटीबॉडी 2.12 ± 0.36 m2/s था।
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig05.jpg"> चित्रा 5: प्रोटियोलिपोसोम्स का निर्माण और लक्षण वर्णन। (क)एन्केसेटेड, शमन कैल्सीन के साथ प्रोटेओलिपोसोम गढ़ने में कदम । (ख)फ्लोरोसेंट स्टेप-ब्लीचिंग के प्रतिनिधि आंकड़े लिपोसोम में एम्बेडेड एल-ओपा1 की औसतन 2-3 प्रतियां दिखाते हैं । (ग)जीटीपी इनक्यूबेशन (ग्रीन) के बाद बिना किसी न्यूक्लियोटाइड 1 एच के प्रोटेलिपपोसोम्स (लाल) का प्रतिनिधि आकार वितरण । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा झिल्ली टेदरिंग, लिपिड डेमिक्सिंग/हेमिफसेशन, और पोर खोलने का पता लगाना।
टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी(चित्रा 6 ए)का उपयोग करके लिपिड बाइलेयर की सतह पर टेक्सासरेड के संकेत को देखकर झिल्ली टेदरिंग की निगरानी की जाती है। झिल्ली लिपिड डेमिक्सिंग (हेमीफ्यूजन) व्यवहार को टेक्सासरेड के माध्यम से निगरानी की गई थी क्योंकि डाई लिपिड बाइलेयर में लिपोसोम्स से फैलती है। कैल्सीन डिक्वेंचिंग केवल लिपिड डेमिक्सिंग से पूर्ण संलयन ताकना गठन को अलग करने में मदद करता है। यह उन स्थितियों के बीच तुलना की अनुमति देता है जहां कण हेमिफ्यूजन (अंजीर 6B) पर स्टाल करते हैं, और कण जो पूर्ण संलयन(चित्रा 6C)के लिए आगे बढ़ते हैं।
झिल्ली टेदरिंग लिपोसोम्स से एक स्थिर लिपिड संकेत द्वारा इंगित की जाती है। दूरी का मूल्यांकन दो झिल्ली36के लेबल के बीच FRET संकेत के आधार पर किया जा सकता है । हेमिफुशन सिग्नल में कैल्सीन सिग्नल(चित्रा 6B, निचलीपंक्ति) में कोई डीक्लेंचिंग नहीं है, लेकिन टेक्सासरेड सिग्नल का तेजी से क्षय लिपिड बाइलेयर(चित्रा 6B ऊपरी पंक्ति) में डाई के प्रसार को इंगित करता है। पूर्ण संलयन (पोर खोलने के साथ) दोनों लिपिड क्षय और सामग्री रिलीज(चित्रा 6C)सुविधाएं । टेक्सासरेड तीव्रता और कैल्सीन तीव्रता को झिल्ली संलयन36के काइनेटिक्स के लिए मात्रात्मक विवरण प्रदान करने के लिए समय-निर्भर तरीके से ट्रैक किया जा सकता है।
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig06.jpg"> चित्रा 6: प्रतिनिधि परिणाम कण टेदरिंग (ए, स्केल बार 10 माइक्रोन), हेमीफ्यूजन (बी, स्केल बार 0.5 माइक्रोन), और फ्यूजन (सी, स्केल बार 0.5 माइक्रोन) दिखा। (A)जीटीपी अतिरिक्त से पहले Opa1-पुनर्गठित लिपिड बाइलेयर को सीमित प्रोटियोलिपोमोस। (ख)हेमिफुशन का एक उदाहरण । बी में ऊपरी पंक्ति लिपिड डेमिक्सिंग (टेक्सासरेड सिग्नल, लाल), बी में निचली पंक्ति इन स्थितियों के तहत कोई सामग्री रिलीज (कैल्सीन सिग्नल, ग्रीन) नहीं दिखाती है। (ग)लिपिड बाइलेयर के साथ प्रोटियोलिपोसोम फ्यूजिंग का एक प्रतिनिधि ट्रेस । सामग्री रिलीज कैल्सिन (निचली पंक्ति, हरे) के dequenching दिखाने की निचली पंक्ति में छवियों से देखा जा सकता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig06large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

माइटोकॉन्ड्रियल फ्यूजन एक महत्वपूर्ण होमोस्टेटिक प्रतिक्रिया है जो माइटोकॉन्ड्रियल गतिशीलता में अंतर्निहित है। यहां वर्णित माइटोकॉन्ड्रियल इन-झिल्ली संलयन का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो पुनर्गठन प्रणाली है जो झिल्ली टेदरिंग, डॉकिंग, हेमिफ्यूजन और पोर खोलने को हल कर सकती है। कोशिका झिल्ली प्रणालियों की खोज में इस दृष्टिकोण की बहुमुखी प्रतिभा पर चर्चा की है।

माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली गतिशीलता के पुनर्गठन के लिए एक मॉडल झिल्ली मंच

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

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