Name: a model membrane platform for reconstituting mitochondrial membrane dynamics
Uploaded: 2020-09-02T15:00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics at JoVE.com

Авторы признают поддержку фонда Чарльза Х. Худа Child Health Research Award и щедрую поддержку со стороны Департамента молекулярной биологии в Массачусетской больнице общего профиля.

<ol>
	<li>Sackmann, E., Lipowsky, R., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+membranes+architecture+and+function.">Biological membranes architecture and function.</a> Structure and Dynamics of Membranes. 1, 1-63 (1995).</li><li>Rajendran, L., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+and+membrane+dynamics.">Lipid rafts and membrane dynamics.</a> Journal of Cell Science. 118, 1099-1102 (2005).</li><li>Schink, K. O., Tan, K. W., Stenmark, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositides+in+Control+of+Membrane+Dynamics.">Phosphoinositides in Control of Membrane Dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 143-171 (2016).</li><li>Gu, R. X., Ingolfsson, H. I., de Vries, A. H., Marrink, S. J., Tieleman, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ganglioside-Lipid+and+Ganglioside-Protein+Interactions+Revealed+by+Coarse-Grained+and+Atomistic+Molecular+Dynamics+Simulations.">Ganglioside-Lipid and Ganglioside-Protein Interactions Revealed by Coarse-Grained and Atomistic Molecular Dynamics Simulations.</a> Journal of Physical Chemistry B. 121 (15), 3262-3275 (2017).</li><li>Schafer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+actin+dynamics+and+membrane+dynamics+during+endocytosis.">Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (1), 76-81 (2002).</li><li>Chan, Y. H., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+systems+and+their+applications.">Model membrane systems and their applications.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 11 (6), 581-587 (2007).</li><li>Biswas, K. H., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+Live+Cell-Supported+Membrane+Interfaces+for+Signaling+Studies.">Hybrid Live Cell-Supported Membrane Interfaces for Signaling Studies.</a> Annual Reviews in Biophysics. 48, 537-562 (2019).</li><li>Pick, H., Alves, A. C., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Vesicle+Assays+Using+Liposomes+and+Cell-Derived+Vesicles:+From+Modeling+Complex+Membrane+Processes+to+Synthetic+Biology+and+Biomedical+Applications.">Single-Vesicle Assays Using Liposomes and Cell-Derived Vesicles: From Modeling Complex Membrane Processes to Synthetic Biology and Biomedical Applications.</a> Chemical Reviews. 118 (18), 8598-8654 (2018).</li><li>Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+SNARE-mediated+vesicle+fusion+observed+in+vitro+by+polarized+TIRFM.">Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM.</a> Biophysical Journal. 99 (12), 4047-4055 (2010).</li><li>Kiessling, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fusion+of+synaptic+vesicles+with+reconstituted+target+SNARE+membranes.">Rapid fusion of synaptic vesicles with reconstituted target SNARE membranes.</a> Biophysical Journal. 104 (9), 1950-1958 (2013).</li><li>Yang, S. T., Kiessling, V., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+tension+at+lipid+phase+boundaries+as+driving+force+for+HIV+fusion+peptide-mediated+fusion.">Line tension at lipid phase boundaries as driving force for HIV fusion peptide-mediated fusion.</a> Nature Communication. 7, 11401 (2016).</li><li>Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+fusion+observed+by+content+transfer+across+a+tethered+lipid+bilayer.">Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer.</a> Biophysical Journal. 101 (8), 37 (2011).</li><li>Chao, L. H., Klein, D. E., Schmidt, A. G., Pena, J. M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+conformational+rearrangements+in+flavivirus+membrane+fusion.">Sequential conformational rearrangements in flavivirus membrane fusion.</a> Elife. 3, 04389 (2014).</li><li>Floyd, D. L., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+kinetic+intermediates+in+single-particle+dwell-time+distributions.">Analysis of kinetic intermediates in single-particle dwell-time distributions.</a> Biophysical Journal. 99 (2), 360-366 (2010).</li><li>Sezgin, E., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+membrane+platforms+to+study+protein-membrane+interactions.">Model membrane platforms to study protein-membrane interactions.</a> Molecular Membrane Biology. 29 (5), 144-154 (2012).</li><li>Ge, Y., Gao, J., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Cholesterol+Level+Alter+Integrin+Sequestration+in+Raft-Mimicking+Lipid+Mixtures.">Changes in Cholesterol Level Alter Integrin Sequestration in Raft-Mimicking Lipid Mixtures.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 158-167 (2018).</li><li>Dutta, D., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned,+multicomponent+supported+lipid+bilayers+for+cellular+systems.">Micropatterned, multicomponent supported lipid bilayers for cellular systems.</a> Methods in Cell Biology. 120, 53-67 (2014).</li><li>Groves, J., Ferrari, M., Desai, T., Bhatia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+Lipid+Bilayers+as+Mimics+for+Cell+Surfaces+and+as+Tools+in+Biotechnology.">Supported Lipid Bilayers as Mimics for Cell Surfaces and as Tools in Biotechnology.</a> BioMEMS and Biomedical Nanotechnology. , (2006).</li><li>Shoaib, T., Nalam, P. C., He, Y., Chen, Y., Espinosa-Marzal, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+Morphology,+Diffusivity,+and+Indentation+of+Hydrogel-Supported+Lipid+Bilayers.">Assembly, Morphology, Diffusivity, and Indentation of Hydrogel-Supported Lipid Bilayers.</a> Langmuir. 33 (28), 7105-7117 (2017).</li><li>Wang, N., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+the+reticular+ER+network+-+mechanistic+implications+and+open+questions.">Reconstituting the reticular ER network - mechanistic implications and open questions.</a> Journal of Cell Science. 132 (4), 227611 (2019).</li><li>Powers, R. E., Wang, S., Liu, T. Y., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+tubular+endoplasmic+reticulum+network+with+purified+components.">Reconstitution of the tubular endoplasmic reticulum network with purified components.</a> Nature. 543 (7644), 257-260 (2017).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fusion+and+fission:+interlinked+processes+critical+for+mitochondrial+health.">Fusion and fission: interlinked processes critical for mitochondrial health.</a> Annual Reviews of Genetics. 46, 265-287 (2012).</li><li>Nunnari, J., Suomalainen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+in+sickness+and+in+health.">Mitochondria: in sickness and in health.</a> Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).</li><li>Wai, T., Langer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Dynamics+and+Metabolic+Regulation.">Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation.</a> Trends in Endocrinology Metabolism. 27 (2), 105-117 (2016).</li><li>Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+fusion+and+fission+in+cell+life+and+death.">Mitochondrial fusion and fission in cell life and death.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (12), 872-884 (2010).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitofusins+Mfn1+and+Mfn2+coordinately+regulate+mitochondrial+fusion+and+are+essential+for+embryonic+development.">Mitofusins Mfn1 and Mfn2 coordinately regulate mitochondrial fusion and are essential for embryonic development.</a> Journal of Cell Biology. 160 (2), 189-200 (2003).</li><li>Ishihara, N., Fujita, Y., Oka, T., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+morphology+through+proteolytic+cleavage+of+OPA1.">Regulation of mitochondrial morphology through proteolytic cleavage of OPA1.</a> EMBO Journal. 25 (13), 2966-2977 (2006).</li><li>Anand, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+i-AAA+protease+YME1L+and+OMA1+cleave+OPA1+to+balance+mitochondrial+fusion+and+fission.">The i-AAA protease YME1L and OMA1 cleave OPA1 to balance mitochondrial fusion and fission.</a> Journal of Cell Biology. 204 (6), 919-929 (2014).</li><li>Mishra, P., Carelli, V., Manfredi, G., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolytic+cleavage+of+Opa1+stimulates+mitochondrial+inner+membrane+fusion+and+couples+fusion+to+oxidative+phosphorylation.">Proteolytic cleavage of Opa1 stimulates mitochondrial inner membrane fusion and couples fusion to oxidative phosphorylation.</a> Cell Metabolism. 19 (4), 630-641 (2014).</li><li>Baker, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+OMA1+activation+and+autocatalytic+turnover+regulate+OPA1-dependent+mitochondrial+dynamics.">Stress-induced OMA1 activation and autocatalytic turnover regulate OPA1-dependent mitochondrial dynamics.</a> EMBO Journal. 33 (6), 578-593 (2014).</li><li>DeVay, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coassembly+of+Mgm1+isoforms+requires+cardiolipin+and+mediates+mitochondrial+inner+membrane+fusion.">Coassembly of Mgm1 isoforms requires cardiolipin and mediates mitochondrial inner membrane fusion.</a> Journal of Cell Biology. 186 (6), 793-803 (2009).</li><li>Rainbolt, T. K., Lebeau, J., Puchades, C., Wiseman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+Degradation+of+YME1L+and+OMA1+Adapts+Mitochondrial+Proteolytic+Activity+during+Stress.">Reciprocal Degradation of YME1L and OMA1 Adapts Mitochondrial Proteolytic Activity during Stress.</a> Cell Reports. 14 (9), 2041-2049 (2016).</li><li>Ban, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+selective+mitochondrial+fusion+by+heterotypic+action+between+OPA1+and+cardiolipin.">Molecular basis of selective mitochondrial fusion by heterotypic action between OPA1 and cardiolipin.</a> Nature Cell Biology. 19 (7), 856-863 (2017).</li><li>Tanaka, M., Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer-supported+membranes+as+models+of+the+cell+surface.">Polymer-supported membranes as models of the cell surface.</a> Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).</li><li>Shilts, K., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+cell-surface+mimetics+as+engineered+cell+substrates.">Tunable cell-surface mimetics as engineered cell substrates.</a> Biochimica Biophysica Acta Biomembrane. 1860 (10), 2076-2093 (2018).</li><li>Ge, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+forms+of+Opa1+cooperate+to+complete+fusion+of+the+mitochondrial+inner-membrane.">Two forms of Opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane.</a> Elife. 9, 50973 (2020).</li><li>Ge, Y., Siegel, A. P., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand+binding+alters+dimerization+and+sequestering+of+urokinase+receptors+in+raft-mimicking+lipid+mixtures.">Ligand binding alters dimerization and sequestering of urokinase receptors in raft-mimicking lipid mixtures.</a> Biophysical Journal. 107 (9), 2101-2111 (2014).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems,+lipid+rafts,+and+cell+membranes.">Model systems, lipid rafts, and cell membranes.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 33, 269-295 (2004).</li><li>Kiessling, V., Liang, B., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituting+SNARE-mediated+membrane+fusion+at+the+single+liposome+level.">Reconstituting SNARE-mediated membrane fusion at the single liposome level.</a> Methods in Cell Biology. 128, 339-363 (2015).</li><li>Siegel, A. P., Kimble-Hill, A., Garg, S., Jordan, R., Naumann, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+ligands+change+integrin+sequestering+but+not+oligomerization+in+raft-mimicking+lipid+mixtures.">Native ligands change integrin sequestering but not oligomerization in raft-mimicking lipid mixtures.</a> Biophysics Journal. 101 (7), 1642-1650 (2011).</li></ol>

Ни один.

Модель-мембранные системы In vitro могут описывать сложные мембранные процессы в четко определенных условиях. Эти системы могут различать минимальные компоненты, необходимые для сложных молекулярныхпроцессов, чтобы выявитьмолекулярные механизмы 6, 15,,20,,,38. Для мембранных белков липосомы и планарные двуслойные являются распространенными системами восстановления. В отличие от твердо поддерживаемых липидных билейеров, полимерная подушка между субстратом и поддерживаемой мембраной в полимерно-привязанных билейерах позволяет свободно подвижность больших мембранных белков, а трансмембранные белки свободно рассеиватьсяи собирать 34. Эти особенности помогли нам исследовать кинетику митохондрий внутренне-мембранногосинтеза 36.
Мы подготовили полимерно-привязанный липидный билейлер с использованием методов Langmuir-Blodgett/Langmuir-Schaefer (LB/LS). Это позволяет нам подготовить билейер с асимметричными липидными компонентами. Клеточные мембраны имеют асимметричный состав листовок, а подход LB/LS позволяет изучать такие билейеры. При передаче Шефера весь стеклянный субстрат может быть покрыт липидным билейером. Очень важно подготовить чистую поверхность для подготовки билейера. Кроме того, требуется практика для правильного выполнения передачи Шефера. Неудачная передача Шефера может создать нежелательные дефекты в липидном билейзере. В этом протоколе, давление, добавленное к балансу пленки применимо для билейера, содержащего 20% кардиолипин. Для двухслойных с другими компонентами обратитесь к изотерму области поверхностного давления ключевых компонентов. Альтернативным методом является метод лангмуир-Блоджетт/Везикл (LB/VF), при котором нижний липидный монослой переносится из воздушно-водяного интерфейса корыта Лангмуира на чистый субстрат, затем липосомы сливаются с верхней частью поддерживаемого липидного монослой и образуют окончательныйбилейтер 39. Восстановление мембранных белков с использованием метода LB/VF более просто, чем LB/LS, так как восстановление может быть выполнено путем слияния протеолипосом. Однако слияние пузырьков требует добавления избыточных липосом, что может осложнить изучение мембранных явлений, зависящих от концентрациозависимых белково-белковых взаимодействий.
Успешное восстановление трансмембранных белков в полимерно-привязанные липидные билейеры и липосомы в предпочтительной функциональной ориентации имеет важное значение, но трудно обеспечить. Для этого необходимы экспериментальные элементы управления. Для полимерно-привязанных липидных двуслойных, важно также поддерживать целостность липидного билейера во время восстановления. Концентрации сурфактанта должны быть относительно низкими, чтобы предотвратить растворение липидного билейера, но достаточно высоко, чтобы предотвратить денатурациюбелка интереса 37,40. Описанный здесь метод идеально подходит для восстановления мембранных белков для одномекулярных исследований, но не обязательно масштабируем для крупномасштабных исследований. Surfactant выбор является еще одним важным соображением. Часто сурфактант, используемый для очистки и хранения, является хорошей отправной точкой. Максимальная концентрация сурфактанта, как правило, в 200 раз меньше CMC36, в диапазоне, где сурфактант поддерживает стабильность белка и предотвращает агрегацию белка, сохраняя при этом целостностьмембраны 36. Коктейли, содержащие 2 или 3 сурфактантов могут быть рассмотрены. Для восстановления липосомы, низкая концентрация сурфактанта не является необходимым. Тем не менее, концентрации сурфактантов ниже CMC предпочтительнее для поддержания равномерного размера и распределения морфологии для липосом. Чтобы предотвратить утечку содержания красителя, необходимо диализуть против красителя, содержащего буфер.
В отличие от анализа синтеза на основе липосомы, созданная платформой обеспечивает подход к исследованиям кинетики каждого шага мембранного синтеза. Этот метод обеспечивает возможность изучения трансмембранных белков синтеза в почти родных условиях. Модель мембранных платформ может быть применена для изучения сборки мембранного белка и олигомеризации, мембранной «скульптуры» и белково-липидного взаимодействия белков в субклеточных средах, таких как митохондриальная внутренняя мембрана. Этот метод также позволяет изумить важные физиологические условия в мембранно-белковом взаимодействии, такие как асимметрия состава билейера. Роль ключевого митохондриального липида, кардиолипина, в свойствах билейера как липосом, так и полимерных билейеров еще предстоит определить. Такие свойства, как ионная прочность, толщина мембраны, мембранная жесткость, мембранная кривизна и мембранные эластичные свойства, могут влиять на способность белков к сборке в специфические функциональные состояния. Будущие исследования, творчески применяя модель мембранных систем, имеют потенциал, чтобы раскрыть новые аспекты организации и функции мембранного белка.

Мембранная разобщенизация является отличительной чертой эукариотическихклеток 1 (рисунок 1A). Биологические мембраны все чаще признаются как более чем двумерный растворитель, и рассматриваются как окружающая среда, играющая важную роль в регулировании функции белка и макромолекулярногокомплекса сборки 2,,3. Родные липиды лиганды, которые регулируют активность мембранногобелка 3,4. Мембранная пространственная организация и способность мембран быть скульптурные в различные формы являются важными физическими свойствами для выбора новыхфункций 3,,5.
Модель мембранных платформ – это биомиметические системы, которые могут помочь нам понять структуру клеточных мембран, динамикуи функцию6,7,,8. Модельные мембраны обычно состоят из липидной смеси четко определенного состава, с определенными биофизическими свойствами (жесткость, толщина и эластичность). В сочетании с флуоресценцией изображения, модели мембранных платформ позволяют количественныйанализ структуры мембраны ифункции9 ,10,11. Липидный bilayer стратегии восстановления были использованы для изучения SNARE-опосредованноеслияние мембраны 9,10, ДНК-опосредованное слияниемембраны 12, ивирусный синтез 11,13. Преимуществом таких методов является возможность получения кинетической информации для промежуточных шагов, предшествующих наблюдаемому событиюреакции 14.
Плазменная мембрана была тщательно изучена с использованием модельных мембран. Билайеры с разделением липидной фазы были разработаны для изучения структур липидного плота, важных в клеточнойсигнализации11,15,,16. Микропаттернные липидные планарныебилейеры 17,18 были использованы для исследования организации клеточных рецепторов. Полимерные или гелеобразующие мембраны используются в качестве биомиметических систем для изучения мембранно-цитоскелетной организации, секционирования мембранного белка во время сигнализации клеток и миграции в контактыклеток-клеток 19.
Искусственные мембранные системы также применяются для изучения подклеточных органелл20. Органеллы имеют характерные морфологии, которые создают различные подсреду. Одним из примеров является эндоплазмическая сеть reticulum (ER). При восстановлении стикулонов в липосомы образуются трубчатые мембранные структуры со свойствами, похожими на клеточныйER. Добавление атластина, белка синтеза ER, может вызвать липидные трубоубийки из липосом, чтобы сформировать сеть20. Это один из примеров того, как протеолипосомы могут обеспечить функциональное понимание органеллы морфологии и динамики.
Митохондриальный синтез мембран и деление имеют важное значение для здоровьямитохондриальной популяции 22,,23,,24,,25. Набор динамин семьи GTPases катализирует митохондрии мембраны слияния. Mfn 1/2 катализает слияние внешней мембраны. Opa1 опосредует синтез внутреннеймембраны 26 (рисунок 1B). Opa1 имеет две формы: длинная форма (l-Opa1), трансмембранная, закрепленная на митохондриальной внутренней мембране, и «растворимая» короткая форма (s-Opa1), присутствуют в интермембранном пространстве. Соотношение двух форм Opa1 регулируется активностью двух протеаз, Oma1 и Yme1L27,,28,,29,,30. Важные вопросы в регулировании Opa1 включают в себя: как две формы Opa1, (короткий и длинный) посредником мембраны слиянияи их нормативного взаимодействия 28,29,31,32,33.
Здесь мы описываем стратегию восстановления, успешно применяемую для исследования митохондриального синтеза внутренней мембраны, которая прояснил роль l- и s-Opa1 во внутреннем мембранном синтезе. Мы разработали платформу, имитирующую митохондриальную внутреннюю мембрану с использованием полимерно-привязанного липидного билейера и 200 нм униламелларов. Преимущества полимерного троса под липидным билейером включают в себя следующее. Во-первых, он сохраняет восстановленный трансмембрановый белок, который в противном случае может быть нарушен близостью к стеклянной горке34. Во-вторых, он служит толстым слоем воды между липидным билейером и стеклянным субстратом, что облегчает изучениепор открытия 9,и в-третьих, вязко-вязкостатический характер полимера PEG позволяет мембранной кривизныизменения 35. Мы использовали трехцветную флуоресценцию для характеристики шагов в мембранном синтезе(рисунок 1C-F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Мониторинг синтеза митохондриальных мембран. (A)Органеллы являются клеточными мембранами отсеков. (B)Последовательные шаги митохондриального синтеза мембран. Слияние внешней мембраны митохондрий катализуется Mfn1 и/или Mfn2, в то время как синтез внутренней мембраны опосредован Opa1. (C-F) Схема платформы восстановления in vitro для изучения митохондриального синтеза мембран. Платформа включает в себя две части: протеолипосому и полимерно-привязанный липидный бислой, оба с восстановленным l-Opa1. Флуоресцентные этикетки, в том числе два различных флуоресцентных мембранных красителя и маркер содержимого, помогают различать шаги во время мембранного синтеза. Два мембранных маркера (Cy5-PE (красный) и TexasRed PE (оранжевый) делают пару FRET, которая может сообщать о близкой мембранной стыковке. Диффузия TexasRed-PE, которая маркирует протеолипосому, является показателем демиксирования липидов (гемифузии). Выпуск содержимого контролируется путем dequenching кальцина сигнала (показано зеленым цветом). Панели A и B созданы с использованием Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(Cyanine 5)</td>
			<td>Avanti polar lipid</td>
			<td>Cat #: 810335C1mg</td>
			<td>membrane fluorescent markers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 880130P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1&#39;,3&#39;-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 710335P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18:1 (&#916;9-Cis) PC (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850375P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850757P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A20181</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber vial with PTFE liner</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-955-332</td>
			<td>sample vials to keep lipid solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat #: C0875; PubChem Substance ID: 24892279</td>
			<td>fluorescent dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>298-500/ C295-4</td>
			<td>Fisher brand Chloroform is usually quite reliable for lipid works.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Concavity slide (1 well)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>71878-05</td>
			<td>applied as Schaefer Slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS analysis tool</td>
			<td>Smith Lab, University of Akron</td>
			<td></td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji /ImageJ</td>
			<td>Fiji</td>
			<td>SCR_002285</td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Cover Glasses: Circles</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>12-545-102</td>
			<td>Cover glass for solid supported lipid bilayers, the item is now discontinued as authors prepared the manuscript. An alternative is Fisher brand premium cover glass with catalog number: 12-548-5M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP Disodium salt</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH INC</td>
			<td>Cat #: 10106399001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langmuir &#38; Langmuir-Blodgett Trough</td>
			<td>Biolin Scientifc</td>
			<td>KN2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-&#945;-lysophosphatidylinositol (Liver, Bovine) (sodium salt)</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>Cat #: 850091P</td>
			<td>lipid molecules</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Extruder</td>
			<td>Avanti Polar lipids</td>
			<td>610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Dodecyl-&#946;-D-Maltopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat #: D310 25 GM</td>
			<td>surfactant for reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-Octyl-&#945;-D-Glucopyranoside</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>Cat #: O311HA 25 GM</td>
			<td>surfactant for reconstitution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC Membranes 0.2&#956;m</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>610006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Opa1 antibody</td>
			<td>NOVUS BIOLOGICALS</td>
			<td>Cat #: NBP2-59770</td>
			<td>antibody for Opa1 C-terminal detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slidebook</td>
			<td>Intelligent imaging</td>
			<td>RRID: SCR_014300</td>
			<td>software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon threaded seal tape</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0636085</td>
			<td>taflon tape for sample storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt (Texas Red DHPE)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Cat #: T1395MP</td>
			<td>membrane fluorescent markers</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a model membrane platform for reconstituting mitochondrial membrane dynamics

Митохондриальная динамика имеет важное значение для различных функций органеллы и клеточных реакций. Переполненная, пространственно сложная митохондриальная мембрана является сложной средой для различения регуляторных факторов. Экспериментальный контроль белковых и липидных компонентов может помочь ответить на конкретные вопросы регулирования. Тем не менее, количественное манипулирование этими факторами является сложной задачей в клеточном анализе. Для исследования молекулярного механизма синтеза внутренней мембраны митохондрий мы внедрили платформу экстракорпорального восстановления, которая имитирует липидную среду митохондриальной внутренней мембраны. Здесь мы описываем подробные шаги по подготовке липидных билейеров и восстановлению митохондриальных мембранных белков. Платформа позволила количественно провести анализ промежуточных элементов в митохондриальном синтезе внутренней мембраны и кинетики для отдельных переходов. Этот протокол описывает изготовление билейеров с асимметричным липидным составом и описывает общие соображения для восстановления трансмембранных белков в мягкий билейер. Метод может быть применен для изучения других мембранных систем.

Восстановленный трансмембранный белок свободно рассеивается и однородно распространяется в мембране.
Пример изображения липидного билейзера и его липидной текучести, подтвержденной микроскопией эпифлюоресценции, показан на рисунке 4. Распределение липидов в билейе до и после фотоблейинга показано на рисунке 4A,B. Однородность липидного билейера была визуализирована с помощью эпифлюоресценционного микроскопа до и после восстановления(рисунок 4D,E). l-Opa1 восстановлен в липидном бислойном был подтвержден спектроскопией корреляции флуоресценции (FCS). Мы используем спряженные липиды красителя для оценки липидной диффузивности билейера. Восстановленный Opa1 был помечен с помощью флуоресцентных тегов анти-Opa1 C-терминал антитела. Диффузия липидов билейера измерялась как 1,46 и0,12 мкм 2/с,в то время как коэффициент диффузии двухслойно-восстановленного l-Opa1 составил 0,88 и 0,10мкм 2/с. Интенсивность считывания с кривых FCS указывается 75% l-Opa1 воссоздается в липидный бислой(рисунок 4G,H). Эти результаты свидетельствуют о том, что l-Opa1 свободно рассеивается в полимерно-привязанном липидном бислойном с потенциалом самостоятельной сборки в функциональные комплексы.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig04.jpg"> Рисунок 4: Распределение липидов и восстановленного белка в мембране модели. (A-C) Пример изображения липидного билейзера и его липидной текучести, подтвержденной микроскопией эпифлюоресценции. (A)Однородное распределение липидов в билейе до фотоотвержения. (B)Снимок сразу после фотоотчета. (C)Bilayer, изображенный после восстановления флуоресценции, указывает на хорошую липидную текучесть мембраны после восстановления. (D,E) Репрезентативные изображения распределениялипидов до (D), и после ( E ) l-Opa1 восстановление указывают на процесс восстановления не создает дефектов в билей.E Представитель TIRF изображение l-Opa1 помечены Alexa 488 конъюгированных антител (F), показывая однородное распределение Opa1 после восстановления. G. Представитель сырого фотона подсчитывает l-Opa1 сигнал флуоресцентной корреляционные спектроскопии. В контроле, не l-Opa1 был восстановлен в bilayer, в то время как антитела были добавлены и промыть. Диффузия l-Opa1 значительно медленнее, чем липиды в мембране, в соответствии с успешным восстановлением трансмембрана l-Opa1 (H). Шкала бар: 10 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Отбеливание шага флуоресценции показало, что в среднем 2-3 копии l-Opa1 были восстановлены в данной липосоме(рисунок 5A,B). Распределение размеров восстановленных протеолипосом Opa1 было протестировано после восстановления с использованием DLS(рисунок 5C). Восстановление Opa1 в proteoliposomes также было проверено с помощью FCS. Коэффициент диффузии свободных антител составил 164 и 22мкм 2/с; Коэффициент диффузии для липосом, помеченных липидным красителем, составил 2,22 и 0,33мкм 2/с,а коэффициент диффузии для протеолипосом l-Opa1, связанных с помеченным TexasRed анти-Его антителом, составил 2,12 и 0,36мкм 2/с.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig05.jpg"> Рисунок 5: Изготовление и характеристика протеолипосом. (A)Шаги в изготовлении протеолипосом с инкапсулированными, закаленными кальцинами. (B)Репрезентативные данные флуоресцентного отбеливания шагов показывают в среднем 2-3 копии l-Opa1, встроенных в липосому. (C)Распределение размеров представителей протеолипосом (красных) без нуклеотида 1 ч после инкубации GTP (зеленый). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Обнаружение мембранного привязывания, демиксирования липидов/гемифузии и открытия пор при флуоресцентной микроскопии.
Мембранное привязывание контролируется путем наблюдения сигнала TexasRed на поверхности липидного бислойного с помощью микроскопии TIRF(рисунок 6A). Мембрана липидов demixing (гемифузия) поведение было проверено через TexasRed как краситель рассеивается из липосом в липидный билейзер. Кальцин dequenching помогает отличить полное образование пор синтеза от только липидного демиксирования. Это позволяет сравнивать условия, при которых частицы заглохли при гемифузии (рис. 6B), и частицами, которые перейти к полномуслиянию (рисунок 6C).
Мембранное привязывание указывается стабильным липидным сигналом от липосом. Расстояние может быть оценено на основе сигнала FRET между этикетками двух мембран36. Сигнал гемифузии не имеет dequenching в сигнале кальцина(рисунок 6B, нижний ряд), но быстрый распад сигнала TexasRed указывает на диффузию красителя в липидный бислой(рисунок 6B верхний ряд). Полное слияние (с открытием поры) имеет как липидный распад, так и выпусксодержимого (рисунок 6C). TexasRed интенсивности и интенсивности кальцина можно отслеживать в зависимости от времени образом, чтобы обеспечить количественные детали для кинетики мембранного синтеза36.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61620/61620fig06.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативные результаты, показывающие привязывание частиц (A, шкала бар 10 мкм), гемифузия (B, шкала бар 0,5 мкм), и слияние (C, шкала бар 0,5 мкм). (A) Протеолипосомы привязали к Opa1-восстановленный липидный билейлер до добавления GTP. (B)Пример гемифузии. Верхний ряд в B показывает липидный демиксинг (сигнал TexasRed, красный), нижний ряд в B не показывает релиз содержимого (кальцин-сигнал, зеленый) в этих условиях. (C) Репрезентативный след протеоливого сплава с липидным билейером. Выпуск контента можно наблюдать на изображениях в нижнем ряду, показывающих dequenching кальцина (нижний ряд, зеленый). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61620/61620fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics at JoVE.com

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Митохондриальный синтез является важной гомеостатической реакцией, лежащей в основе митохондриальной динамики. Описана здесь система восстановления in vitro для изучения митохондриального синтеза внутренней мембраны, которая может решить мембранные привязывания, стыковки, гемифузии и открытия пор. Обсуждается универсальность этого подхода при изучении клеточных мембранных систем.

Модель Мембранная платформа для восстановления митохондриальной динамики мембран

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

В этой частице мы вводим платформу экстракорпорального восстановления, которая имитирует липидную среду внутренней мембраны митохондрий. Эта платформа может быть использована для исследования молекулярных механизмов синтеза внутренней мембраны митохондрий. Основным преимуществом этой методики является то, что она позволяет количественное исследование интегральных мембранных белков и мембранных белков в близкой родной среде.Для начала смешайте растворы A и B в соответствии с рукописными направлениями, затем генерируйте липидную смесь, добавляя рассчитанный объем раствора хранения в янтарные флаконы со стеклянным шприцем. Матч окончательный объем, добавив дополнительный хлороформ во флаконы. Выпекать микроскоп coverglass слайды при температуре 520 градусов по Цельсию в течение 30 минут.После выпечки, охладить их до комнатной температуры. Добавьте около 10 граммов гидроксида натрия в 500 миллилитров метанола при перемешивании. Перемешать в течение двух часов, продолжая добавлять гидроксид натрия в раствор до тех пор, пока осадки начинают показывать.Очистите стеклянные горки в растворе додецил сульфата натрия, метанол, насыщенный гидроксидом натрия, и 50 миллимоляреловую соляную кислоту, последовательно ванну sonicating слайды под каждым условием в течение 30 минут. Очистите стеклянные горки в ультрапурной воде в течение 10 минут между каждым условием. Храните очищенное стекло крышки, запечатанное раствором соляной кислоты в течение двух недель, чтобы обеспечить хорошее двухслойное качество.Очистите политетрафторэтилен корыта системы погружения Лангмуир-Блоджетт с использованием хлороформа и ультрапурной воды до тех пор, пока не будет наблюдаться смачивание. Спрей хлороформа на поверхности корыта и протрите его тщательно три раза с целлюлозой салфетки, затем промыть его три раза с ультрачистой водой и удалить воду через всасывания. После завершения, покрыть поверхность корыта с чистой ультрачистой водой.Возьмите два куска поверхности обработанные стекловолокна из раствора для очистки и промыть их ультрапурной водой в течение примерно 30 секунд. Поместите стекло крышки в спину к спине образом с помощью субстратного зажима для проведения стеклянных слайдов. Погрузите стеклянную горку под поверхностью воды, вручную нажав на ковш вниз по системе управления Langmuir.Нулевой баланс пленки и тщательное распространение раствора B капля за каплей на воздушном водном интерфейсе. Убедитесь, что липиды распространяются только на воздушном водном интерфейсе без хлороформных и липидных капель, опускаясь на дно политратравтороэтиленовой поверхности, что создаст липидный канал и предотвратит образование монослой. Прекратите добавлять липиды, когда считывание баланса пленки составляет от 15 до 20 миллиньютон на метр.Подождите от 10 до 15 минут, а затем инициировать барьер контроллер изменить площадь поверхности, нажав начать эксперимент. Подождите, пока считывание баланса пленки увеличится до 37 миллиньютон на метр и держать давление в течение примерно 20 до 30 минут. Поднимите стекло крышки со скоростью 22 миллиметра в минуту, сохраняя при этом поверхностное натяжение на уровне 37 миллиньютон на метр.Липидный монослой с полимерной привязкой будет перенесен из интерфейса воздушной воды на поверхность крышки через процесс погружения Blodgett, образуя нижнюю листовку липидного двухслоя. Очистите интерфейс воздушной воды путем всасывания и промыть корыто с ультрачистой водой. После очистки одноуходного стеклянного слайда с хлороформом, этанолом и ультрапурной водой установите ее на корыто под слоем воды.Убедитесь, что колодец обращен к интерфейсу воздушной воды и залить свежей ультрапурной водой до тех пор, пока стеклянная горка не будет полностью покрыта, затем погрузите стеклянную горку под поверхность воды, как описано ранее. Держите стекло крышки с липидным монослой с помощью кремниевой присоски и осторожно нажмите липидный монослой к интерфейсу воздушной воды. Держите крышку стекла в течение двух-трех секунд на интерфейсе, а затем нажмите его на слайд.Возьмите слайд с крышкой. Возьмите стекло для крышки и двухслойный к микроскопу эпифторесценции и изображение липидного двухслоя в соответствии с текстовыми рукописными направлениями. Приготовьте хрустальную тарелку, содержащую ультрапурную воду, и поместите под блюдо чистое кольцо с изображением микроскопа.Погрузите этот слайд и стекло, которые содержат липидный двухслой под водой. Аккуратно разделите слайд и стекло для крышки, удерживая слайд из стеклоокрывательного стекла снизу и перенесите стекло крышки в кольцо изображения. Замените ультрапурную воду в кольце изображения буфером хлорида натрия bis-tris, убедившись, что липидный бислой не подвергается воздействию пузырьков воздуха.Добавьте 1,1 наномолярного n-октил-бета-глюкопираноида в липидный двухслойный слой, а затем немедленно добавьте смесь 1,2 наномолярного DDM и 1,3 пикомолов очищенных L-OPA1 в кольцо изображения. Инкубировать образец на скамейке верхней шейкер на низкой скорости в течение двух часов. Распределите 30 миллиграммов смолы SM-2 шарики на три миллилитров буфера бис-три и встряхните.Используйте пластиковую пипетку, чтобы добавить от 5 до 10 микролитров смолы бусы SM-2 к изображению кольцо и инкубировать его в течение 10 минут, а затем промыть смолы шарики. Окончательный объем буфера в кольце изображения должен быть 1,5 миллилитров. Приготовьте один миллиграмм липидной смеси А в растворе хлороформа, затем испарите хлороформ под потоком азота в течение 20 минут.Держите смесь под вакуумом на ночь, чтобы сформировать липидную пленку. Приготовьте 50 миллимолярный кальций, содержащий буфер, растворив 15,56 грамма кальцеина в 50 миллилитров 1,5 молярного гидроксида раствора. Перемешать смесь при комнатной температуре до полного растворения кальцина.Добавьте 12,5 миллимолярные бис-три и ультрапурную воду для конечного объема в 500 миллилитров и отрегулируйте рН до 7,5. Обойти липидную пленку в кальциине, содержащем буфер, затем полностью увлажнить липид, нагревая подвеску при 65 градусах по Цельсию в течение 20 минут. Форма 200 нанометровых липосом через экструзию с поликарбонатной мембраной.Добавьте два микрограмма L-OPA1 в 0,5 микромолярном DDM, 2,2 миллиграмма липосомы и инкубировать раствор при четырех градусах по Цельсию в течение 1,5 часов. Удалите сурфактант путем диализа с помощью кассеты с 3,5 килодалтонным диализом против 250 миллилитров 25 миллимолярные бис-три, 150 миллимолярный хлорид натрия и 50 миллимолярный буфер кальция при четырех градусах Цельсия за одну ночь, изменив буфер дважды. Удалите дополнительный кальцеин с помощью столбца для дезавуирования PD10, а затем приступайте к анализу изображений и данных, описанным в текстовой рукописи.Здесь показаны изображения микроскопии эпифлюоресценции бислоя липидов и его липидной текучести. Распределение липидов показано до и после отбеливания фотографий, а однородность показана до и после восстановления. L-OPA1 восстановлен и липидный двухслойный был подтвержден спектроскопией корреляции флуоресценции или FCS.Кривые FCS показали, что 75% L-OPA1 был восстановлен в липидный двухслойный, предполагая, что L-OPA1 свободно рассеивается в полимерном привязанном липидовом двухслойном с потенциалом для самостоятельной сборки в функциональные комплексы. Отбеливание шага флуоресценции показало, что в среднем две-три копии L-OPA1 были восстановлены в данной липосоме. Распределение размеров восстановленных протеолипосом L-OPA1 было протестировано после восстановления с использованием DLS и проверено FCS.Мембранное привязывание отслеживалось путем наблюдения сигнала Texas Red на поверхности липидного двухслоя с помощью микроскопии TIRF. Мембрана липидного де-смешивания или гемифузии контролируется через Texas Red, как липосомный маркер распространяется в липидный бислой. Кальцеин де-закалки помогли отличить полное образование пор синтеза только липидного де-смешивания, что позволяет сравнение между условиями, когда частицы стойло на гемифузии и частиц, которые приступить к полному слиянию.Мембрана привязывания была показана стабильный липидный сигнал от липосом и выпот сигнала признакам не де-утоления в кальцин сигнала, но быстрый распад Техас Красный сигнал указал диффузии красителя в липидный двухслойный. Полное слияние признакам как липидного распада и содержания релиз. При попытке этой частицы, не забудьте тщательно очистить как стекло для покрытия и Langmuir корыта для обеспечения двух слоев высокого качества изготовлены.Хорошее качество воздуха также имеет решающее значение для предотвращения дефектов в двухслойном. Этот метод прокладывает нам путь к изучению новых вопросов в динамике и организации мембран митохондрий. Захватывающий будущий эксперимент включает изучение влияния двухслойной ассиметрии, мембранного потенциала и связанных с болезнями мутантов в динамике внутренней мембраны митохондрий.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Mitochondria and Energy Production

SCIENTISTS IN ACTION

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Directed Protein Packaging within Outer Membrane Vesicles from Escherichia coli: Design, Production and Purification

Направленный Белок Упаковка в везикул наружной мембраны из<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;: Проектирование, производство и очистка

An increasing interest in applying synthetic biology techniques to program outer membrane vesicles (OMV) are leading to some very interesting and unique ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

Бактериальный Внутренняя мембрана-дисплей для скрининга библиотеки фрагментов антител

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Фракционирование мозговых мембран:<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Подход к оценке локализации сусинаптических белков

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Характеристика Мембранных Транспортеров по гетерологусному выражению в кишечной палочке и производству Мембранных Весиклей

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors

Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы

Membrane-bound pyrophosphatases (mPPases) are dimeric enzymes that occur in bacteria, archaea, plants, and protist parasites. These proteins cleave ...

PeptiQuick, a One-Step Incorporation of Membrane Proteins into Biotinylated Peptidiscs for Streamlined Protein Binding Assays

Pepti'uick, одноступенчатая инкорпорация мембранных белков в биотинилатированные пептидиски для оптимизированных белковых связывающих анализов

Membrane proteins, including transporters, channels, and receptors, constitute nearly one-fourth of the cellular proteome and over half of current drug ...

Native Cell Membrane Nanoparticles System for Membrane Protein-Protein Interaction Analysis

Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Protein-protein interactions in cell membrane systems play crucial roles in a wide range of biological processes- from cell-to-cell interactions to signal ...