Name: photodiode-based optical imaging for recording network dynamics with single-neuron resolution in non-transgenic invertebrates
Uploaded: 2020-07-09T15:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل 1257923 NSF والمعاهد القومية للصحة 1U01NS10837. ويرغب أصحاب البلاغ في الاعتراف بمساعدة جان وانغ في المختبر.

<ol>
	<li>Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+for+Next-Generation+Neuroscience.">Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).</li><li>Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+from+the+bottleneck:+benefits+of+the+comparative+approach+to+modern+neuroscience.">Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience.</a> Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).</li><li>Bolker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+organisms:+There's+more+to+life+than+rats+and+flies.">Model organisms: There's more to life than rats and flies.</a> Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+matters:+the+importance+of+comparative+studies+and+the+potential+for+synergy+between+neuroscience+and+evolutionary+biology.">Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology.</a> JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).</li><li>Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , (2002).</li><li>Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+neuronal+activity+in+an+invertebrate+central+nervous+system:+simultaneous+monitoring+of+several+neurons.">Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).</li><li>Frost, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Spiking+Activity+of+Many+Individual+Neurons+in+Invertebrate+Ganglia.">Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).</li><li>Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stereo-compound+hybrid+microscope+for+combined+intracellular+and+optical+recording+of+invertebrate+neural+network+activity.">A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).</li><li>Frost, W. N., Wu, J. -. Y., Covey, E., Carter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+imaging.">Voltage-sensitive dye imaging.</a> Basic Electrophysiological Methods. , 169-195 (2015).</li><li>Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+component+analysis+at+the+neural+cocktail+party.">Independent component analysis at the neural cocktail party.</a> Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).</li><li>Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+independent+component+analysis+for+rapid+spike+sorting+of+optical+recording+data.">Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).</li><li>Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+deconstruction+reveals+the+dynamical+and+physical+building+blocks+of+a+locomotion+motor+program.">Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program.</a> Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).</li><li>Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spiral+attractor+network+drives+rhythmic+locomotion.">A spiral attractor network drives rhythmic locomotion.</a> ELife. 6, 27342 (2017).</li><li>Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N., Naik, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICA+applied+to+VSD+imaging+of+invertebrate+neuronal+networks.">ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks.</a> Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. , 235-246 (2012).</li><li>Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+control+of+locomotion+in+Aplysia:+role+of+the+central+ganglia.">Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia.</a> Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).</li><li>Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+imaging+of+population+neuronal+activity+in+cortical+tissue.">Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).</li><li>Neveu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Configurations+of+Compression+and+Truncation+of+Neuronal+Activity+Underlie+l-DOPA-Induced+Selection+of+Motor+Patterns+in+Aplysia.">Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia.</a> eNeuro. 4 (5), 17 (2017).</li><li>Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+neuronal+network+functional+connectivity+with+directed+information.">Inferring neuronal network functional connectivity with directed information.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).</li><li>Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Formation+in+Tritonia+via+Recruitment+of+Variably+Committed+Neurons.">Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons.</a> Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).</li><li>Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+neuronal+populations+during+decision-making.">Optical imaging of neuronal populations during decision-making.</a> Science. 307 (5711), 896-901 (2005).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors.">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).</li><li>Tomina, Y., Wagenaar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+double-sided+microscope+to+realize+whole-ganglion+imaging+of+membrane+potential+in+the+medicinal+leech.">A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech.</a> ELife. 6, 29839 (2017).</li><li>Chang, P. Y., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+optimization+of+absorbance+and+fluorescence+signals+from+voltage-sensitive+dyes.">Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).</li><li>Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+optical+recording+of+patterns+of+electrical+activity+in+ensembles+of+cultured+Aplysia+neurons.">Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).</li><li>Katz, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+central+pattern+generators+and+rhythmic+behaviours.">Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours.</a> Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).</li><li>Moroz, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+Meets+Neuroscience:+From+the+Sequencing+Ship+(Ship-Seq)+to+Deciphering+Parallel+Evolution+of+Neural+Systems+in+Omic's+Era.">Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era.</a> Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).</li><li>Frost, W. N., Tian, L. -. M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+mechanism+for+prepulse+inhibition.">A cellular mechanism for prepulse inhibition.</a> Neuron. 40, 991-1001 (2003).</li><li>Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+neuronal+participation+in+stereotypic+motor+programs.">Variable neuronal participation in stereotypic motor programs.</a> PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).</li><li>London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+recording+of+activity+from+many+neurons+during+feeding+in+Navanax.">Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax.</a> Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).</li><li>Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+during+different+behaviors+in+Aplysia:+A+distributed+organization.">Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization.</a> Science. 263 (5148), 820-823 (1994).</li><li>Marder, E., North, G., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+insight.">Searching for insight.</a> In Invertebrate Neurobiology. , 1-18 (2007).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

واحدة من أهم التفاصيل في تنفيذ نهجنا التصوير VSD على نطاق واسع هو تقليل الاهتزاز، والتي تنتج حركات حواف التباين عبر الثنائيات، مما أدى إلى إشارات كبيرة artifactual. لأن VSDs امتصاص تنتج تغييرات نسبة مئوية صغيرة جدا في كثافة الضوء مع إمكانات العمل، والتحف الاهتزاز، إذا لم يتم منعها، يمكن أن تحجب إشارات الخلايا العصبية من الفائدة. نحن نستخدم عدة طرق لتقليل القطع الأثرية الاهتزاز. أولا، تقع غرفة التصوير في الطابق الأرضي، والتي تعزل الإعداد عن الاهتزازات المتعلقة ببناء معدات مناولة الهواء والعديد من المصادر الأخرى. ثانيا، تم استخدام جدول العزل القائم على الربيع، والتي أكد المستخدمين المساعد الشخصي الرقمي الأخرى يوفر أفضل المثبطة الاهتزاز من الجدول الهواء أكثر شيوعا16. ثالثا، استخدمت أهداف غمر المياه، التي تقضي على تقلبات الصور الناشئة عن التموجات السطحية. رابعا، تم الضغط بخفة على التحضير الذي يتم تصويره بين قاع غطاء الغرفة وجزء غطاء مضغوط من الأعلى يتم الاحتفاظ به في مكانه بواسطة مقابس السيليكون أو هلام البترول، مما يزيد من استقرار التحضير. هذا يسطح أيضا سطح محدب من العقدة أو العقدة التي يتم تصويرها، مما أدى إلى المزيد من الخلايا العصبية في الطائرة من التركيز على الهدف، مما يزيد من عدد الخلايا العصبية المسجلة.
لتحقيق أقصى قدر من نسبة الإشارة إلى الضوضاء للتغيرات الصغيرة جدا في درجة امتصاص ضوء VSD الناتجة عن إمكانات العمل ، من الضروري تحقيق ضوء شبه مشبع من خلال التحضير إلى المساعد الشخصي الرقمي ، وفي الوقت نفسه تقليل bleaching الضوئي للصبغة. وتحقيقا لهذه الغاية، ونحن نعمل عادة في 3-4 V من شدة الضوء يستريح، كما تقاس مع لوحة التحكم المساعد الشخصي الرقمي كسب التبديل في موقف 1x (مكبرات الصوت المساعد الشخصي الرقمي 464 تشبع في 10 V من الضوء). أثناء الحصول على البيانات يتم تغيير عامل الكسب هذا إلى 100x. الحصول على ضوء كاف للوصول إلى 3-4 V كما يقاس المساعد الشخصي الرقمي يمكن تحقيقه في عدة طرق. أولا، استخدم مصدر ضوء LED فائق المرونة الذي يوفر طول موجة مناسب لخصائص امتصاص صبغة الامتصاص المستخدمة. وبناء على ذلك، تم استخدام مصباح 135 نانومتر LED collimated، الذي يتداخل مع أطوال الموجات امتصاص الأمثل من RH155 وRH482. ثانيا، إذا لزم الأمر، استخدم مكثفا تحت المرحلة العلوية يركز الضوء من مصدر ضوء LED إلى منطقة أصغر. ثالثا، ضبط ارتفاع المكثف لتحقيق إضاءة كوهلر، مما يضمن سطوعا عاليا وجودة صورة فائقة. رابعا، تأكد من عدم وجود مرشحات حرارية في المسار البصري، والتي يمكن أن تضيء الطول الموجي لمصباح LED البالغ 735 نانومتر. خامسا، إزالة الناشرون، إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من الضوء، من المسار البصري. سادسا، استخدم أهداف NA العالية، التي توفر دقة مكانية عالية، وتسمح بمستويات كافية من الضوء للوصول إلى المساعد الشخصي الرقمي بكثافة مصباح أقل. وقد سمح لنا هذا لتقليل photobleaching إلى الحد الذي يمكننا الحصول على العديد من ملفات الاستحواذ من 10-20 دقيقة مدة كل إعداد باستخدام نفس كثافة الضوء عبر جميع الملفات ودون فقدان كبير من سعة إشارة أو الحاجة إلى إعادة تلطيخ. الأهم من ذلك، إذا كان المجرب يرغب في تتبع الخلايا العصبية عبر هذه الملفات أطول، وضمان أن الطائرة المحورية لا تتغير، وأن الإعداد لا يتحرك. وأخيرا ، فإن طريقة إضافية لتوجيه ضوء كاف إلى المساعد الشخصي الرقمي هو استخدام الحيوانات الأصغر سنا ، والتي لديها أرق ، وبالتالي أقل غموضا ganglia.
من وقت لآخر نجد أن نسبة الإشارة إلى الضوضاء للإشارات البصرية تتدهور و / أو إيقاعات البرنامج الحركي هي دون المستوى الأمثل (على سبيل المثال ، بطيئة أو غير طبيعية). عندما يبدأ هذا في الحدوث باستمرار، نخلط الحلول الجديدة ل VSD. Aliquots من VSD تبقى قابلة للحياة عادة لمدة 6 أشهر في الفريزر -20 درجة مئوية. ذات الصلة, تجدر الإشارة إلى أنه بالنسبة لبيرغيا, وقد تم الحصول على أفضل النتائج حتى الآن مع امتصاص VSD RH482. كما RH482 هو أكثر lipophilic من RH155، فإنه قد وصمة عار أفضل الخلايا العصبية أصغر نسبيا بيرغياأو البقاء في الأغشية العصبية بشكل أكثر فعالية في درجة حرارة ملحية تسجيل أعلى المستخدمة لهذا النوع الاستوائي.
أحد قيود التصوير القائم على المساعد الشخصي الرقمي للنشاط العصبي يتعلق باقتران التيار المتردد لإشارات الجهد في الأجهزة قبل خطوة التضخيم المسبق 100x: على الرغم من أن هذا يمثل ميزة ضرورية لإزالة إزاحة DC الكبيرة الناتجة عن مستوى الضوء العالي الذي تتطلبه هذه التقنية ، فإن اقتران AC الجوهري المساعد الشخصي الرقمي يحول دون قياس التغيرات البطيئة في إمكانات الأغشية ، مثل تلك المرتبطة المدخلات متشابك. إذا كان تسجيل التغييرات المحتملة بطيئة أو ثابتة الحالة المطلوبة، يمكن استخدام نظام التصوير كاميرا CMOS مقرونة DC لالتقاط النشاط تحت الحيازة. بيرن وزملاؤه تستخدم مؤخرا مثل هذا الإعداد مع RH155 لتصوير نشاط الخلايا العصبية في العقدة buccal من Aplysia17,18. لقد استخدمنا كلا النظامين ووجدنا أن كاميرا CMOS ، نظرا لكثافة أجهزة الكشف الأعلى بكثير (128 × 128) ، تولد ملفات بيانات أكبر 50x لنفس وقت التصوير7. تسهل الملفات الأصغر في المساعد الشخصي الرقمي المعالجة والتحليل بشكل أسرع. وهذا يتيح أيضا التسجيلات الموسعة لتجربة واحدة(الشكل 4)ودراسات التعلم ، حيث يتم ربط البيانات من تجارب متعددة في ملف واحد كبير قبل فرز الارتفاع ، مما يسمح بتتبع تنظيم الشبكة مع تطور التعلم19.
في تحقيقات أخرى تستند إلى الكاميرا ، تم استخدام VSDs الفلورية من قبل Kristan وزملاؤه لفحص وظيفة الشبكة في العقدة القطاعية لل. في دراسة مؤثرة واحدة أدى هذا إلى تحديد الخلايا العصبية المشاركة في قرار الحيوان للسباحة أو الزحف20. في دراسة أخرى، درس كريستان وآخرون مدى تحرك سلوكيات السباحة والزحف لل من قبل دوائر متعددة الوظائف مقابل مخصصة21. في الآونة الأخيرة ، استخدم Wagenaar وزملاؤه مجهرا على الوجهين لتصوير الجهد الذي يسمح لهم بتسجيل جميع الخلايا العصبية تقريبا في العقدة المجزأة22. على النقيض من العديد من أساليب التصوير القائمة على الكاميرا ، ميزة لدينا طريقة التصوير القائم على المساعد الشخصي الرقمي هو سريع وغير متحيزة ارتفاع الفرز من قبل ICA ، وهو شكل من أشكال فصل المصدر الأعمى الذي لا ينطوي على أي قرارات حول حدود الخلايا العصبية لمعالجة النتائج.
فيما يتعلق باختيار VSDs، ميزة واحدة من الأصباغ امتصاص RH155 وRH482 هو السمية الضوئية القليل إلى لا المرتبطة بها23،24،مما يتيح أوقات تسجيل أطول مما هو معتاد لVSDs الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، فإن VSDs امتصاص سريع نستخدمها هي مناسبة تماما لتسجيل إمكانات العمل الجسدي تجاوز في الاستعدادات gastropod، والتي عادة ما تكون 80 mV في السعة. كما هو مبين في الشكل 3G، يمكن أن الأسلوب البصري لدينا تسجيل العمل المحتملة undershoots (أي من التسجيلات لدينا هي تتبع المتوسط) : وهذا يشير إلى أن VSDs نستخدم ينبغي أن تكون قادرة على تمييز إمكانات العمل في أنظمة النموذج الأخرى التي تتوهين إلى حد ما ، وبالتالي لا تتجاوز بحلول الوقت الذي تصل إلى سوما. ومع ذلك، قد لا يكون نهجنا البصري مثاليا للأنواع المعروفة بأنها تظهر إمكانات عمل مخففة للغاية عند تسجيلها في سوما.
وتركز الكثير من البحوث الحالية على الشبكات العصبية على عدد قليل من الأنواع المعدلة وراثيا مصمم. ومع ذلك، يستفيد علم الأعصاب من دراسة مجموعة واسعة من الأنواع المتميزة وراثيا. دراسة العديد من الأنواع المختلفة يوفر رؤى حول كيفية تطور الدوائر25،26، ويضيء مبادئ وظيفة الشبكة التي قد تكون شائعة عبر فيلا1،2،3،4،27. لقد طبقنا حتى الآن طريقة التصوير لدينا على عدد من أنواع المعدة، بما في ذلك Aplysia californica8،11،12،13،14،28، تريتونيا ديوميديا8،9،11،14،19،28، تريتونيا فيستيفا28، Pleurobranchaea californica (بيانات غير منشورة) ، ومؤخرا بيرغيا stephanieae (الشكل 5). ومن الجاذبية التي يوجهها هذا النهج أنه يمكن تطبيقه بسهولة على العديد من الأنواع، دون الحاجة إلى معدلة وراثيا. نود أن نعترف بأن استخدامنا للتصوير VSD مع أصباغ امتصاص سريعة وPDA يسير على خطى العمل الرائد الذي أنجز هذا في شبه سليمة ، والتصرف نافاناكس29 وAplysia30 الاستعدادات. تركيزنا على سرعة نهجنا هو في جزء منه ردا على المخاوف من أن العديد من المحققين قد تكون مترددة على نحو متزايد لبدء دراسات الشبكة في الأنواع الجديدة بسبب المخاوف من أن سنوات من الدراسة ستكون ضرورية لتوصيف تنظيم الشبكة الأساسية قبل أن تكون قادرة على استكشاف المسائل العلمية ذات أهمية واسعة لعلم الأعصاب31. وبناء على ذلك، فإن هدفنا هنا هو إظهار تقنية تسرع العملية بشكل كبير - لدرجة أنه يمكن الحصول على رؤى كبيرة في نفس اليوم في تنظيم الشبكة من الاستعدادات الفردية.

وقد وفر تطوير خطوط اللافقاريات المعدلة وراثيا مثل دروسوفيلا وسي إليغانز أنظمة قوية يمكن فيها استجواب القواعد العصبية للسلوك والتلاعب بها بصريا. ومع ذلك، قد يكون لهذه الاستعدادات الخاصة الجانب السلبي للحد من الحماس لدراسات الدائرة العصبية للأنواع غير المعدلة وراثيا، لا سيما فيما يتعلق بإدخال أنواع جديدة في أبحاث علم الأعصاب. التركيز حصرا على واحد أو اثنين من النظم النموذجية يضر بالبحث عن المبادئ العامة لوظيفة الشبكة، لأن الدراسات المقارنة تمثل طريقا أساسيا يتم من خلاله اكتشاف هذه المبادئ1و2و3و4. هدفنا هنا هو إظهار نهج التصوير على نطاق واسع للحصول على نظرة سريعة في الهيكل الوظيفي للشبكات العصبية gastropod ، في محاولة لتسهيل الدراسات المقارنة لوظيفة الشبكة العصبية.
الرخويات Gastropod مثل Aplysia، Lymnaea، Tritonia، Pleurobranchaea وغيرها منذ فترة طويلة تستخدم للتحقيق في مبادئ وظيفة الشبكة العصبية، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى أن يتم التوسط في سلوكياتهم من قبل الخلايا العصبية الكبيرة، وغالبا ما يمكن التعرف عليها بشكل فردي تقع على سطح العقدة، مما يجعلها في متناول بسهولة لتسجيل تقنيات5.  في 1970s، تم تطوير الأصباغ الحساسة للجهد (VSDs) التي يمكن أن تتكامل في غشاء البلازما التي سرعان ما مكنت التسجيلات الأولى خالية من القطب الكهربائي من إمكانات العمل التي ولدتها الخلايا العصبية متعددة6. هنا، ونحن نثبت استخدامنا VSDs لدراسة نشاط الشبكة في عدة أنواع من gastropods، بما في ذلك واحد جديد لعلم الأعصاب، بيرغيا stephanieae. جهاز التصوير هو مجموعة ثنائية ضوئية متاحة تجاريا من 464 عنصرا (PDA) التي عينات في 1600 لقطة / ثانية (الشكل 1)، والتي ، عند استخدامها مع VSDs امتصاص سريع ، ويكشف عن إمكانات العمل لجميع الخلايا العصبية المسجلة7. يتم عرض الإشارات المسجلة من قبل جميع الثنائيات مباشرة بعد الاستحواذ وفرضها على صورة للعصابة في برنامج اقتناء المساعد الشخصي الرقمي ، مما يجعل من الممكن التحقيق في الخلايا العصبية ذات الاهتمام مع أقطاب كهربائية حادة في نفس الإعداد8،9.
في بيانات المساعد الشخصي الرقمي الخام، العديد من الثنائيات تسجل بشكل زائد عن الحاجة الخلايا العصبية أكبر، والعديد منها يحتوي أيضا على إشارات مختلطة من الخلايا العصبية متعددة. نقطة تحول كان تطوير آلية ارتفاع الفرز طريقة باستخدام تحليل مكون مستقل لمعالجة بسرعة كل الخام 464 قناة PDA مجموعة البيانات في مجموعة جديدة من آثار, التي تظهر كل الخلايا العصبية المسجلة في تتبع منفصل يحتوي فقط على إمكانات عملها10,11.
في هذه المقالة نوضح الخطوات الأساسية التي ينطوي عليها الحصول على تسجيلات محتملة للعمل على نطاق واسع من الجهاز العصبي gastropod مع مجموعة الصمام الثنائي الضوئي وVSDs امتصاص سريع.  وعلاوة على ذلك نحن نوضح الأساليب التحليلية التي يمكن استخدامها في تجميع ورسم خرائط الخلايا العصبية المسجلة بصريا فيما يتعلق بمجموعاتها الوظيفية ، وخصائص خصائص مستوى السكان التي غالبا ما تكون غير واضحة من خلال التفتيش البسيط لآثار إطلاقالنار 12،13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1022px;" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Achromat 0.9 NA swing condenser</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:248px;">N/A</td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:248px;">CL-100 with SC-20</td>
			<td>Controls perfusion saline temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Chamber thermometer</td>
			<td style="width:196px;">Physitemp</td>
			<td style="width:248px;">BAT-12 with IT-18 microprobe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Digital camera</td>
			<td style="width:196px;">Optronics</td>
			<td style="width:248px;">S97808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont</td>
			<td style="width:248px;">#5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:196px;">American Diagnostic Corp.</td>
			<td style="width:248px;">ADC-3410Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Imaging microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:248px;">BX51WIF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Imaging perfusion chamber</td>
			<td style="width:196px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:248px;">PC-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:196px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:248px;">SS6-25</td>
			<td>Makes 25 gallons at a time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Master-8 pulse stimulator</td>
			<td style="width:196px;">A.M.P.I.</td>
			<td style="width:248px;">Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microdispenser</td>
			<td style="width:196px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:248px;">3-000-752</td>
			<td>Dye applicator for pressure staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Moria</td>
			<td style="width:248px;">15371-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Minutien pins (0.1 mm)</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:248px;">NC9677548</td>
			<td>For positioning and stabilizing CNS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Motorized microscope platform</td>
			<td style="width:196px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:248px;">GHB-BX</td>
			<td>Gibraltar platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">NeuroPlex imaging software</td>
			<td style="width:196px;">RedShirtImaging</td>
			<td style="width:248px;">NeuroPlex</td>
			<td>Compatible with the WuTech photodiode array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Objective lenses</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:248px;">XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PE-100 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:248px;">63018-726</td>
			<td>Tubing to make suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:196px;">Instech</td>
			<td style="width:248px;">P720 with DBS062SDBSU tube set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petroleum jelly</td>
			<td style="width:196px;">Equate</td>
			<td style="width:248px;">NDC 49035-038-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Photodiode array with control panel</td>
			<td style="width:196px;">WuTech Instruments</td>
			<td style="width:248px;">469-IV photodiode array</td>
			<td>Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">RH155</td>
			<td style="width:196px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:248px;">sc-499432</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">RH482</td>
			<td style="width:196px;">Univ of Conn. Health Center</td>
			<td style="width:248px;">JPW-1132</td>
			<td>Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Silicone earplugs</td>
			<td style="width:196px;">Mack&#39;s</td>
			<td style="width:248px;">Model 7</td>
			<td>To be use for preparation compression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Staining PE tubing</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:248px;">63018-xxx</td>
			<td>Different sizes depending on fit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:196px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:248px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Thorlabs LED and driver</td>
			<td style="width:196px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:248px;">M735L2-C1, DC2100</td>
			<td>LED lamp and driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tygon tubing</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:248px;">14-171-xxx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vibration isolation table</td>
			<td style="width:196px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:248px;">MK26</td>
			<td>Spring-based</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodiode-based optical imaging for recording network dynamics with single-neuron resolution in non-transgenic invertebrates

تطوير الاستعدادات اللافقارية المعدلة وراثيا التي يمكن تسجيل نشاط مجموعات محددة من الخلايا العصبية والتلاعب بها مع الضوء يمثل تقدما ثوريا لدراسات الأساس العصبي للسلوك. ومع ذلك ، فإن الجانب السلبي لهذا التطور هو ميله إلى تركيز المحققين على عدد قليل جدا من الكائنات "المصممة" (مثل C. elegans و Drosophila)، مما قد يؤثر سلبا على متابعة الدراسات المقارنة عبر العديد من الأنواع ، وهو أمر ضروري لتحديد المبادئ العامة لوظيفة الشبكة. توضح هذه المقالة كيف يمكن استخدام التسجيل البصري مع الأصباغ الحساسة للجهد في أدمغة أنواع المعدة غير المعدلة وراثيا بسرعة (أي في غضون الوقت من التجارب الفردية) تكشف عن ملامح التنظيم الوظيفي لشبكاتها العصبية بدقة خلية واحدة. نحن الخطوط العريضة بالتفصيل تشريح, تلطيخ, وتسجيل الأساليب المستخدمة من قبل مختبرنا للحصول على آثار العمل المحتملة من عشرات إلى ~ 150 الخلايا العصبية خلال البرامج الحركية ذات الصلة سلوكيا في الجهاز العصبي المركزي من أنواع متعددة gastropod, بما في ذلك واحدة جديدة لعلم الأعصاب – وdyibranch بيرغيا stephanieae. يتم إجراء التصوير مع الأصباغ الحساسة للجهد امتصاص ومجموعة من 464 عنصرا الصمام الثنائي الضوئي أن عينات في 1600 لقطة / ثانية، وبسرعة كافية لالتقاط جميع إمكانات العمل التي تولدها الخلايا العصبية المسجلة. يمكن الحصول على تسجيلات متعددة لعدة دقائق لكل إعداد مع القليل من تبييض الإشارات أو السمية الضوئية. ويمكن تحليل البيانات البصرية الخام التي تم جمعها من خلال الأساليب الموصوفة في وقت لاحق من خلال مجموعة متنوعة من الأساليب المصورة. يمكن استخدام نهج التسجيل البصري لدينا بسهولة للتحقيق في نشاط الشبكة في مجموعة متنوعة من الأنواع غير المعدلة وراثيا ، مما يجعلها مناسبة تماما للدراسات المقارنة حول كيفية توليد الأدمغة للسلوك.

Watch this Scientific Journal Video about Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates at JoVE.com

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتصوير النشاط السكاني للخلايا العصبية بدقة خلية واحدة في الأنواع غير اللافقارية غير المعدلة وراثيا باستخدام الأصباغ الحساسة لجهد الامتصاص ومجموعة الصمام الثنائي الضوئي. ويتيح هذا النهج سير عمل سريع، حيث يمكن متابعة التصوير والتحليل على مدار يوم واحد.

التصوير البصري المستند إلى الصمامات الثنائية الضوئية لتسجيل ديناميكيات الشبكة بدقة أحادية الخلايا العصبية في اللافقاريات غير المعدلة وراثيا

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

وسم الخلايا الجذعية مع الأصباغ نيون للمنظمات غير الغازية مع الكشف عن التصوير الضوئي

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

غير الغازية مع التصور 3D - الفرعية ميكرون القرار باستخدام السنكروترون - X - أشعة التصوير المقطعي

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

العناية والتنظيف السليم للمجهر

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

مكونات رئيسية مجهر الضوء

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

وعلى النقيض من مرحلة التدخل التفاضلية المجهري التباين (DIC)

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

تصوير ديناميات الكالسيوم في السكان الفرعيين من خلايا الفئران جزيرة البنكرياس

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

ديناميات القلة من مستقبلات سطح الخلية في الخلايا الحية من قبل المجهر الداخلي الكلي انعكاس الشامل مع عدد وتحليل السطوع

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...