Name: photodiode-based optical imaging for recording network dynamics with single-neuron resolution in non-transgenic invertebrates
Uploaded: 2020-07-09T15:00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי NSF 1257923 ו- NIH 1U01NS10837. המחברים מבקשים להכיר בסיועו של ז'אן וונג במעבדה.

<ol>
	<li>Miller, C. T., Hale, M. E., Okano, H., Okabe, S., Mitra, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Principles+for+Next-Generation+Neuroscience.">Comparative Principles for Next-Generation Neuroscience.</a> Frontiers in Behavioral Neuroscience. 13 (12), (2019).</li><li>Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+from+the+bottleneck:+benefits+of+the+comparative+approach+to+modern+neuroscience.">Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience.</a> Trends in Neuroscience. 38 (5), 273-278 (2015).</li><li>Bolker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+organisms:+There's+more+to+life+than+rats+and+flies.">Model organisms: There's more to life than rats and flies.</a> Nature. 491 (7422), 31-33 (2012).</li><li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+matters:+the+importance+of+comparative+studies+and+the+potential+for+synergy+between+neuroscience+and+evolutionary+biology.">Diversity matters: the importance of comparative studies and the potential for synergy between neuroscience and evolutionary biology.</a> JAMA Neurology. 69 (8), 987-993 (2012).</li><li>Chase, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Behavior and its neural control in gastropod molluscs. , (2002).</li><li>Salzberg, B. M., Grinvald, A., Cohen, L. B., Davila, H. V., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+recording+of+neuronal+activity+in+an+invertebrate+central+nervous+system:+simultaneous+monitoring+of+several+neurons.">Optical recording of neuronal activity in an invertebrate central nervous system: simultaneous monitoring of several neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 40 (6), 1281-1291 (1977).</li><li>Frost, W. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Spiking+Activity+of+Many+Individual+Neurons+in+Invertebrate+Ganglia.">Monitoring Spiking Activity of Many Individual Neurons in Invertebrate Ganglia.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 859, 127-145 (2015).</li><li>Frost, W. N., Wang, J., Brandon, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stereo-compound+hybrid+microscope+for+combined+intracellular+and+optical+recording+of+invertebrate+neural+network+activity.">A stereo-compound hybrid microscope for combined intracellular and optical recording of invertebrate neural network activity.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 148-154 (2007).</li><li>Frost, W. N., Wu, J. -. Y., Covey, E., Carter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+imaging.">Voltage-sensitive dye imaging.</a> Basic Electrophysiological Methods. , 169-195 (2015).</li><li>Brown, G. D., Yamada, S., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+component+analysis+at+the+neural+cocktail+party.">Independent component analysis at the neural cocktail party.</a> Trends in Neuroscience. 24 (1), 54-63 (2001).</li><li>Hill, E. S., Moore-Kochlacs, C., Vasireddi, S. K., Sejnowski, T. J., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+independent+component+analysis+for+rapid+spike+sorting+of+optical+recording+data.">Validation of independent component analysis for rapid spike sorting of optical recording data.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (6), 3721-3731 (2010).</li><li>Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+deconstruction+reveals+the+dynamical+and+physical+building+blocks+of+a+locomotion+motor+program.">Modular deconstruction reveals the dynamical and physical building blocks of a locomotion motor program.</a> Neuron. 86 (1), 304-318 (2015).</li><li>Bruno, A. M., Frost, W. N., Humphries, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+spiral+attractor+network+drives+rhythmic+locomotion.">A spiral attractor network drives rhythmic locomotion.</a> ELife. 6, 27342 (2017).</li><li>Hill, E. S., Bruno, A. M., Vasireddi, S. K., Frost, W. N., Naik, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICA+applied+to+VSD+imaging+of+invertebrate+neuronal+networks.">ICA applied to VSD imaging of invertebrate neuronal networks.</a> Independent Component Analysis for Audio and Biosignal Applications. , 235-246 (2012).</li><li>Jahan-Parwar, B., Fredman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+control+of+locomotion+in+Aplysia:+role+of+the+central+ganglia.">Neural control of locomotion in Aplysia: role of the central ganglia.</a> Behavioral and Neural Biology. 27 (1), 39-58 (1979).</li><li>Jin, W., Zhang, R. J., Wu, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dye+imaging+of+population+neuronal+activity+in+cortical+tissue.">Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue.</a> Journal of Neuroscience Methods. 115 (1), 13-27 (2002).</li><li>Neveu, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+Configurations+of+Compression+and+Truncation+of+Neuronal+Activity+Underlie+l-DOPA-Induced+Selection+of+Motor+Patterns+in+Aplysia.">Unique Configurations of Compression and Truncation of Neuronal Activity Underlie l-DOPA-Induced Selection of Motor Patterns in Aplysia.</a> eNeuro. 4 (5), 17 (2017).</li><li>Cai, Z., Neveu, C. L., Baxter, D. A., Byrne, J. H., Aazhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+neuronal+network+functional+connectivity+with+directed+information.">Inferring neuronal network functional connectivity with directed information.</a> Journal of Neurophysiology. 118 (2), 1055-1069 (2017).</li><li>Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Wang, J., Bruno, A. M., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+Formation+in+Tritonia+via+Recruitment+of+Variably+Committed+Neurons.">Memory Formation in Tritonia via Recruitment of Variably Committed Neurons.</a> Current Biology. 25 (22), 2879-2888 (2015).</li><li>Briggman, K. L., Abarbanel, H. D., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+neuronal+populations+during+decision-making.">Optical imaging of neuronal populations during decision-making.</a> Science. 307 (5711), 896-901 (2005).</li><li>Briggman, K. L., Kristan, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+dedicated+and+multifunctional+neural+circuits+generating+distinct+behaviors.">Imaging dedicated and multifunctional neural circuits generating distinct behaviors.</a> Journal of Neuroscience. 26 (42), 10925-10933 (2006).</li><li>Tomina, Y., Wagenaar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+double-sided+microscope+to+realize+whole-ganglion+imaging+of+membrane+potential+in+the+medicinal+leech.">A double-sided microscope to realize whole-ganglion imaging of membrane potential in the medicinal leech.</a> ELife. 6, 29839 (2017).</li><li>Chang, P. Y., Jackson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interpretation+and+optimization+of+absorbance+and+fluorescence+signals+from+voltage-sensitive+dyes.">Interpretation and optimization of absorbance and fluorescence signals from voltage-sensitive dyes.</a> Journal of Membrane Biology. 196 (2), 105-116 (2003).</li><li>Parsons, T. D., Salzberg, B. M., Obaid, A. L., Raccuia-Behling, F., Kleinfeld, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+optical+recording+of+patterns+of+electrical+activity+in+ensembles+of+cultured+Aplysia+neurons.">Long-term optical recording of patterns of electrical activity in ensembles of cultured Aplysia neurons.</a> Journal of Neurophysiology. 66, 316-333 (1991).</li><li>Katz, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+central+pattern+generators+and+rhythmic+behaviours.">Evolution of central pattern generators and rhythmic behaviours.</a> Transactions of the Royal Society of London, Series B. 371 (1685), 20150057 (2016).</li><li>Moroz, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiversity+Meets+Neuroscience:+From+the+Sequencing+Ship+(Ship-Seq)+to+Deciphering+Parallel+Evolution+of+Neural+Systems+in+Omic's+Era.">Biodiversity Meets Neuroscience: From the Sequencing Ship (Ship-Seq) to Deciphering Parallel Evolution of Neural Systems in Omic's Era.</a> Integrative and Comparative Biology. 55 (6), 1005-1017 (2015).</li><li>Frost, W. N., Tian, L. -. M., Hoppe, T. A., Mongeluzi, D. L., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+mechanism+for+prepulse+inhibition.">A cellular mechanism for prepulse inhibition.</a> Neuron. 40, 991-1001 (2003).</li><li>Hill, E. S., Vasireddi, S. K., Bruno, A. M., Wang, J., Frost, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable+neuronal+participation+in+stereotypic+motor+programs.">Variable neuronal participation in stereotypic motor programs.</a> PLoS One. 7 (7), 40579 (2012).</li><li>London, J. A., Zecevic, D., Cohen, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+optical+recording+of+activity+from+many+neurons+during+feeding+in+Navanax.">Simultaneous optical recording of activity from many neurons during feeding in Navanax.</a> Journal of Neuroscience. 7 (3), 649-661 (1987).</li><li>Wu, J., Cohen, L. B., Falk, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+during+different+behaviors+in+Aplysia:+A+distributed+organization.">Neuronal activity during different behaviors in Aplysia: A distributed organization.</a> Science. 263 (5148), 820-823 (1994).</li><li>Marder, E., North, G., Greenspan, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Searching+for+insight.">Searching for insight.</a> In Invertebrate Neurobiology. , 1-18 (2007).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אחד הפרטים החשובים ביותר ביישום גישת הדמיית VSD בקנה מידה גדול שלנו הוא למזער רטט, אשר מייצר תנועות של קצוות ניגודיות על פני הדיודות, וכתוצאה מכך אותות חפצים גדולים. מכיוון ש-VSDs של ספיגה מייצרים שינויים באחוזים קטנים מאוד בעוצמת האור עם פוטנציאל פעולה, ממצאי רטט, אם לא נמנעים, יכולים לטשטש את אותות העניין העצביים. אנו משתמשים במספר שיטות כדי למזער חפצי רטט. ראשית, חדר ההדמיה שלנו ממוקם בקומת הקרקע, אשר מבודד את ההכנה מרעידות הקשורות לבניית ציוד לטיפול באוויר ומקורות רבים אחרים. שנית, נעשה שימוש בטבלת בידוד מבוססת קפיץ, אשר משתמשי PDA אחרים אישרו מספקת שיכוך רטט טוב יותר מאשר שולחן האוויר הנפוץ יותר16. שלישית, נעשה שימוש במטרות טבילת מים, אשר מבטלות תנודות תמונה הנובעות מאדוות פני השטח. רביעית, ההכנה המצולמת נלחצה קלות בין מכסה התא התחתון לבין שבר כיסוי לחוץ מלמעלה המוחזק במקום על ידי תקעים סיליקון או ג'לי נפט, עוד יותר מייצב את ההכנה. זה גם משטח את פני השטח הקומורים של הגנגליון או הגרעינים להיות בתמונה, וכתוצאה מכך נוירונים יותר במישור של המוקד של המטרה, אשר מגדיל את מספר הנוירונים שתועדו.
כדי למקסם את יחס האות לרעש עבור השינויים הקטנים מאוד במידת ספיגת אור VSD הנובעים מפוטנציאל פעולה, חיוני להשיג אור כמעט רווי באמצעות ההכנה ל- PDA, ובמקביל למזער את ההלבנה של הצבע. כדי לכך, אנו עובדים בדרך כלל ב 3-4 V של עוצמת אור במנוחה, כפי שנמדד עם מתג רווח לוח הבקרה של מחשב כף היד במיקום 1x (464 המגברים של מחשב כף היד רוויים ב 10 V של אור). במהלך רכישת נתונים גורם רווח זה משתנה ל- 100x. קבלת מספיק אור כדי להגיע 3-4 V כפי שנמדד על ידי מחשב כף היד יכול להתבצע במספר דרכים. ראשית, השתמש במקור תאורת LED אולטרה-רייט המספק אורך גל המתאים למאפייני הספיגה של צבע הספיגה בשימוש. בהתאם לכך, נעשה שימוש במנורה קולימת LED 735-nm, החופפת לאורכי הגל האופטימליים של RH155 ו- RH482. שנית, במידת הצורך, השתמש במכנס תת-הבמה ההפוך שמרכז את האור ממקור תאורת ה-LED לאזור קטן יותר. שלישית, כווננו את גובה המעיבוי כדי להשיג תאורת קולר, המבטיקה בהירות גבוהה, אפילו לאיכות תמונה מרבית. רביעית, ודא שאין מסנני חום במסלול האופטי, שיכולים להחליק את אורך הגל של מנורת ה- LED 735 ננומטר. חמישית, להסיר מפזר, אם יש צורך יותר אור, מן המסלול האופטי. שישית, השתמש במטרות NA גבוהות, המספקות רזולוציה מרחבית גבוהה, ומאפשרות רמות מספיקות של אור כדי להגיע מחשב כף היד בעוצמות מנורה נמוכות יותר. זה איפשר לנו למזער את ההלבנה עד כדי כך שנוכל להשיג מספר קבצי רכישה של משך של 10-20 דקות לכל הכנה באמצעות אותה עוצמת אור בכל הקבצים וללא אובדן משמעותי של משרעת האות או הצורך בהכתמה מחדש. באופן מכריע, אם הנסיין רוצה לעקוב אחר נוירונים על פני קבצים ארוכים אלה, להבטיח כי מישור המוקד אינו משתנה, וכי ההכנה אינה זזה. לבסוף, דרך נוספת לנתב מספיק אור אל מחשב כף היד היא להשתמש בבעלי חיים צעירים יותר, שיש להם גרעים דקים יותר, ולכן פחות אטומים.
מעת לעת אנו מוצאים כי יחס האות לרעש של האותות האופטיים מתדרדר ו / או מקצבי תוכנית המנוע הם תת-אופטימליים (למשל, איטיים או לא תקינים). כאשר זה מתחיל להתרחש באופן עקבי, אנו מערבבים פתרונות טריים של VSD. Aliquots של VSD בדרך כלל להישאר קיימא במשך כ 6 חודשים במקפיא -20 °C .. בהקשר זה, ראוי לציין כי עבור ברגיה, התוצאות הטובות ביותר הושגו עד כה עם ספיגה VSD RH482. כמו RH482 הוא ליפופילי יותר מאשר RH155, זה עשוי להכתים טוב יותר את הנוירונים הקטנים יחסית של ברגיה או להישאר בממברנות העצביות בצורה יעילה יותר בטמפרטורת המלח הקלטה גבוהה יותר המשמשת למין טרופיזה.
מגבלה אחת של הדמיה מבוססת PDA של פעילות עצבית מתייחסת צימוד AC של אותות המתח בחומרה לפני שלב ההפללה מראש 100x: למרות שזה מייצג תכונה הכרחית כדי להסיר את היסט DC הגדול המיוצר על ידי רמת האור במנוחה גבוהה הנדרשת על ידי טכניקה זו, צימוד AC מהותי PDA מונע את מדידת שינויים איטיים בפוטנציאל הממברנה, כגון אלה המשויכים לכניסות סינפטיות. אם יש צורך בהקלטת שינויים פוטנציאליים איטיים או יציבים, ניתן להשתמש במערכת הדמיית מצלמות CMOS מצמיד DC כדי ללכוד פעילות תת-קרקעית. ביירן ועמיתיו השתמשו לאחרונה במערך כזה עם RH155 כדי לדמיין את הפעילות של נוירונים בגנגליון buccal של אפלזיה17,18. השתמשנו בשתי המערכות ומצאנו כי מצלמת CMOS, בשל צפיפות הגלאים הגבוהה בהרבה שלה (128 x 128), מייצרת קבצי נתונים גדולים פי 50 לאותו זמן הדמיה7. הקבצים הקטנים יותר של מחשב כף היד מאפשרים עיבוד וניתוח מהירים יותר. זה גם מאפשר הקלטות ניסיון יחיד מורחבות (איור 4) ומחקרים של למידה, שבהם נתונים מניסויים מרובים ממוסמרים לקובץ אחד גדול לפני מיון ספייק, ומאפשר ארגון רשת להיות במעקב כמולמידה מתפתחת 19.
בחקירות אחרות המבוססות על מצלמה, VSDs פלואורסצנטי שימשו את קריסטן ועמיתיו כדי לבחון את תפקוד הרשת בגרעינים המגזריים של העלוקה. במחקר משפיע אחד זה הוביל לזיהוי של נוירון המעורב בהחלטה של החיה לשחות או לזחול20. במחקר אחר, קריסטן ואח ' בחנו את המידה שבה התנהגויות השחייה והזחילה של העלוקה מונעות על ידי מעגלים רב תכליתיים לעומת מעגלים ייעודיים21. לאחרונה, Wagenaar ועמיתיו השתמשו במיקרוסקופ דו-צדדי להדמיית מתח המאפשר להם להקליט כמעט מכל הנוירונים בגנגליון מגזרי עלוקה22. בניגוד לשיטות הדמיה רבות המבוססות על מצלמה, יתרון שיטת ההדמיה מבוססת ה-PDA שלנו הוא מיון ספייק מהיר ובלתי משוחד על ידי ICA, צורה של הפרדת מקור עיוורת שלא כוללת החלטות לגבי גבולות עצביים לעיבוד תוצאות.
לגבי הבחירה של VSDs, יתרון אחד של צבעי הספיגה RH155 ו RH482 הוא פוטוטוקסיה קטנה עד לא הקשורה אליהם23,24, המאפשר זמני הקלטה ארוכים יותר מהרגיל עבור VSDscent פלואורסצנטי. יתר על כן, VSDs ספיגה מהירה אנו משתמשים מתאימים היטב להקלטת פוטנציאל פעולה סומטית overshooting בתכשירי גסטרופוד, שהם בדרך כלל 80 mV משרעת. כפי שמוצג באיור 3G, השיטה האופטית שלנו יכולה לתעד חבטות פוטנציאליות לפעולה (אף אחת מההקלטות שלנו אינה ממוצעת מעקב): הדבר מצביע על כך שה-VSDs שאנו משתמשים בהם אמורים להיות מסוגלים להבחין בפוטנציאל פעולה במערכות מודל אחרות שמחליפות במידה מסוימת ולכן אינן מגזימות עד שהן מגיעות לסומה. עם זאת, הגישה האופטית שלנו לא יכול להיות אידיאלי עבור מינים הידועים להפגין פוטנציאל פעולה מופחת מאוד כאשר נרשם סומה.
מחקר עדכני רב על רשתות עצביות מתמקד במספר קטן של מינים מהונדסים מעצב. עם זאת, מדעי המוח נהנים ממחקר של מגוון רחב של מינים שונים מבחינה פילוגנטית. חקר מינים רבים ושונים מספק תובנות על האופן שבו מעגלים מתפתחים25,26, ומאיר עקרונות של תפקוד הרשת שעשויים להיות נפוצים על פני פילה1,2,3,4,27. עד כה יישמנו את שיטת ההדמיה שלנו על מספר מינים של גסטרופודים, כולל אפליה קליפורניקה8,11,12,13,14,28, טריטוניה דיומדאה8,9,11,14,19,28, טריטוניה פסטיבה28, Pleurobranchaea californica (נתונים שלא פורסמו), ולאחרונה ברגיה סטפניאה (איור 5). ערעור של גישה זו הוא כי זה יכול להיות מיושם בקלות על מינים רבים, ללא צורך בבעלי חיים מהונדסים. אנו רוצים להכיר בכך שהשימוש שלנו בהדמיית VSD עם צבעי ספיגה מהירה ו- PDA הולך בעקבות עבודה חלוצית שהשיגה זאת בהכנות נבאנקס29 ואפילזיה30. הדגש שלנו על מהירות הגישה שלנו הוא בחלקו תשובה לחששות כי חוקרים רבים עשויים להיות יותר ויותר מסרבים ליזום מחקרי רשת במינים חדשים בשל חשש כי שנים של מחקר יהיה צורך לאפיין ארגון רשת בסיסי לפני שיוכלו לחקור שאלות מדעיות עניין רחב למדעי המוח31. בהתאם לכך, המטרה שלנו כאן היא להדגים טכניקה שמזרזת מאוד את התהליך – עד כדי כך שניתן לקבל תובנות משמעותיות באותו יום על ארגון הרשת מהכנות בודדות.

הפיתוח של קווים מהונדסים של חסרי חוליות כגון Drosophila ו- C. elegans סיפק מערכות חזקות שבהן הבסיסים העצביים של התנהגות עשויים להיחקר אופטית מניפולציה. עם זאת, תכשירים מיוחדים אלה עשויים להיות החיסרון של הפחתת ההתלהבות למחקרי מעגל עצבי של מינים לא מהונדסים, במיוחד לגבי כניסת מינים חדשים למחקר מדעי המוח. התמקדות אך ורק במערכת מודל אחת או שתיים מזיקה לחיפוש אחר עקרונות כלליים של פונקציית הרשת, מכיוון שמחקרים השוואתיים מייצגים מסלול חיוני שבאמצעותו מתגלים עקרונות כאלה1,2,3,4. המטרה שלנו כאן היא להדגים גישה הדמיה בקנה מידה גדול לקבלת תובנה מהירה לתוך המבנה הפונקציונלי של רשתות עצביות gastropod, במאמץ להקל על מחקרים השוואתיים של תפקוד הרשת העצבית.
רכיכות גסטרופוד כגון אפליה, לימנאה, טריטוניה, Pleurobranchaea ואחרים שימשו זמן רב כדי לחקור עקרונות של תפקוד הרשת העצבית, במידה רבה משום שההתנהגויות שלהם מתווכות על ידי נוירונים גדולים, לעתים קרובות לזיהוי אישי הממוקמים על פני השטח של הגרעינים, מהשהופךאותם נגישים בקלות לטכניקות הקלטה 5 .  בשנות ה-70 פותחו צבעים רגישים למתח (VSDs) שיכולים להשתלב בקרום הפלזמה, אשר אפשרו עד מהרה את ההקלטות הראשונות ללא אלקטרודה של פוטנציאל הפעולה שנוצר על ידי נוירונים מרובים6. כאן, אנו מדגימים את השימוש שלנו VSDs כדי לבחון את פעילות הרשת במספר מינים של גסטרופודים, כולל אחד חדש למדעי המוח, ברגיה סטפניאה. מכשיר ההדמיה הוא מערך פוטודיודה (PDA) זמין מסחרית של 464 אלמנטים, אשר מדגם ב-1,600 פריימים לשנייה (איור 1),אשר, כאשר משתמשים בו עם VSDs לספיגה מהירה, חושף את פוטנציאל הפעולה של כל הנוירונים המוקלטים7. האותות שנרשמו על ידי כל הדיודות מוצגים מיד לאחר הרכישה ומונחים על גבי תמונה של הגנגליון בתוכנת רכישת מחשב כף היד, מה שמאפשר לחקור נוירונים מעניינים עם אלקטרודות חדות באותה הכנה8,9.
בנתוני מחשב כף היד הגולמיים, דיודות רבות מתעדות באופן יתיר את הנוירונים הגדולים יותר, ורבות מהן מכילות גם אותות מעורבים מתאי עצב מרובים. נקודת מפנה הייתה פיתוח של שיטת מיון ספייק אוטומטית באמצעות ניתוח רכיבים עצמאי כדי לעבד במהירות כל ערכת נתוני PDA גולמיים של 464 ערוצים לתוך קבוצה חדשה של עקבות, שבה כל נוירון מוקלט מופיע בעקבות נפרדים המכילים רק את פוטנציאל הפעולה שלו10,11.
במאמר זה אנו מתארים את הצעדים החיוניים הכרוכים בהשגת הקלטות פוטנציאליות לפעולה בקנה מידה גדול ממערכות העצבים גסטרופוד עם מערך פוטודיודה ו VSDs ספיגה מהירה.  יתר על כן, אנו ממחישים שיטות אנליטיות שניתן להשתמש בהן לאשכולות ומיפוי הנוירונים המתועדים אופטית ביחס להרכבים התפקודיים שלהם, ולאפיון תכונות ברמת האוכלוסייה שלעתים קרובות אינן נראות לעין באמצעות בדיקה פשוטה של עקבות הירי12,13.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1022px;" width="1022">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Achromat 0.9 NA swing condenser</td>
			<td style="width:196px;">Nikon</td>
			<td style="width:248px;">N/A</td>
			<td style="width:332px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:196px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:248px;">CL-100 with SC-20</td>
			<td>Controls perfusion saline temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Chamber thermometer</td>
			<td style="width:196px;">Physitemp</td>
			<td style="width:248px;">BAT-12 with IT-18 microprobe</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Digital camera</td>
			<td style="width:196px;">Optronics</td>
			<td style="width:248px;">S97808</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dissecting forceps</td>
			<td style="width:196px;">Dumont</td>
			<td style="width:248px;">#5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Dissecting scissors</td>
			<td style="width:196px;">American Diagnostic Corp.</td>
			<td style="width:248px;">ADC-3410Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Imaging microscope</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:248px;">BX51WIF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Imaging perfusion chamber</td>
			<td style="width:196px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:248px;">PC-H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:196px;">Instant Ocean</td>
			<td style="width:248px;">SS6-25</td>
			<td>Makes 25 gallons at a time</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Master-8 pulse stimulator</td>
			<td style="width:196px;">A.M.P.I.</td>
			<td style="width:248px;">Master-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microdispenser</td>
			<td style="width:196px;">Drummond Scientific</td>
			<td style="width:248px;">3-000-752</td>
			<td>Dye applicator for pressure staining</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Microdissection scissors</td>
			<td style="width:196px;">Moria</td>
			<td style="width:248px;">15371-92</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Minutien pins (0.1 mm)</td>
			<td style="width:196px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:248px;">NC9677548</td>
			<td>For positioning and stabilizing CNS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Motorized microscope platform</td>
			<td style="width:196px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:248px;">GHB-BX</td>
			<td>Gibraltar platform</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">NeuroPlex imaging software</td>
			<td style="width:196px;">RedShirtImaging</td>
			<td style="width:248px;">NeuroPlex</td>
			<td>Compatible with the WuTech photodiode array</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Objective lenses</td>
			<td style="width:196px;">Olympus</td>
			<td style="width:248px;">XLPLN10XSVMP, XLUMPLFLN20XW, LUMPLFLN40XW, UAPON40XW340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">PE-100 polyethylene tubing</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:248px;">63018-726</td>
			<td>Tubing to make suction electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:196px;">Instech</td>
			<td style="width:248px;">P720 with DBS062SDBSU tube set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Petroleum jelly</td>
			<td style="width:196px;">Equate</td>
			<td style="width:248px;">NDC 49035-038-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Photodiode array with control panel</td>
			<td style="width:196px;">WuTech Instruments</td>
			<td style="width:248px;">469-IV photodiode array</td>
			<td>Contact jianwu2nd@gmail.com for ordering information</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">RH155</td>
			<td style="width:196px;">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td style="width:248px;">sc-499432</td>
			<td>Voltage-sensitive dye</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">RH482</td>
			<td style="width:196px;">Univ of Conn. Health Center</td>
			<td style="width:248px;">JPW-1132</td>
			<td>Voltage-sensitive dye; special order from Leslie Leow</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Silicone earplugs</td>
			<td style="width:196px;">Mack&#39;s</td>
			<td style="width:248px;">Model 7</td>
			<td>To be use for preparation compression</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Staining PE tubing</td>
			<td style="width:196px;">VWR</td>
			<td style="width:248px;">63018-xxx</td>
			<td>Different sizes depending on fit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:196px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:248px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Thorlabs LED and driver</td>
			<td style="width:196px;">Thorlabs</td>
			<td style="width:248px;">M735L2-C1, DC2100</td>
			<td>LED lamp and driver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tygon tubing</td>
			<td style="width:196px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:248px;">14-171-xxx</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vibration isolation table</td>
			<td style="width:196px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:248px;">MK26</td>
			<td>Spring-based</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

photodiode-based optical imaging for recording network dynamics with single-neuron resolution in non-transgenic invertebrates

התפתחות של תכשירים מהונדסים ללא חוליות שבהן ניתן להקליט את הפעילות של קבוצות של נוירונים הניתנים לתמרון עם אור מייצג התקדמות מהפכנית למחקרים של הבסיס העצבי של ההתנהגות. עם זאת, החיסרון של התפתחות זו הוא נטייתה למקד את החוקרים במספר קטן מאוד של אורגניזמים "מעצבים" (למשל, C. elegans ו Drosophila), פוטנציאל להשפיע לרעה על המרדף אחר מחקרים השוואתיים על פני מינים רבים, אשר נדרש לזיהוי עקרונות כלליים של תפקוד הרשת. המאמר הנוכחי ממחיש כיצד הקלטה אופטית עם צבעים רגישים למתח במוחם של מינים גסטרופודיים שאינם מהונדסים יכולה לשמש במהירות (כלומר, במהלך ניסויים בודדים) לחשוף תכונות של הארגון הפונקציונלי של הרשתות העצביות שלהם עם רזולוציה של תא אחד. אנו מתארים בפירוט את שיטות הניתוח, הכתמים וההקלטה המשמשות את המעבדה שלנו כדי להשיג עקבות פוטנציאליים לפעולה מעשרות עד ~ 150 נוירונים במהלך תוכניות מוטוריות רלוונטיות מבחינה התנהגותית במערכת ן של מינים גסטרופוד מרובים, כולל אחד חדש למדעי המוח – nudibranch ברגיה סטפניאה. ההדמיה מתבצעת עם צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודה של 464 אלמנטים שדוגם במהירות של 1,600 פריימים לשנייה, מהר מספיק כדי ללכוד את כל פוטנציאל הפעולה שנוצר על ידי הנוירונים המוקלטים. הקלטות מרובות של מספר דקות ניתן להשיג לכל הכנה עם מעט מאוד אות הלבנת או פוטוטוקסיה. הנתונים האופטיים הגולמיים שנאספו בשיטות המתוארות ניתן לנתח לאחר מכן באמצעות מגוון שיטות מאוירות. ניתן להשתמש בגישה האופטית שלנו לבדיקת פעילות הרשת במגוון מינים לא מהונדסים, מה שהופך אותה להתאמה היטב למחקרים השוואתיים על האופן שבו המוחות מייצרים התנהגות.

טריטוניה מגע עור עם טורף כוכב הים מפעיל את השחייה המילוט של טריטוניה דיומדאה, המורכבת מסדרה קצבית של כיפופי גוף שלמים המניעים אותו למקום מבטחים(איור 3A). בהכנות מוח מבודדות, גירוי קצר לעצב דוושה 3 (PdN3) מעורר את תוכנית מנוע השחייה הקצבית (SMP) להתנהגות זו, הניתנת לזיהוי בקלות בהקלטות אופטיות מגנגרי הדוושה. איור 3B מתאר את הפריסה של ניסוי הדמיה VSD שנועד לתעד את פעילות הירי של נוירונים על פני השטח הגביים של גנגליון דוושת טריטוניה השמאלית, שעליה הוצב מחשב כף היד, כגירוי ל- PdN3 הנגדי (מימין) מעורר את ה- SMP. נתונים גולמיים ומסוננים (מסנן Bandpass Butterworth, ניתוקים של 5 ו-100 הרץ) מ-20 דיודות הקלטה לפני, במהלך ואחרי גירוי של PdN3 מוצגים באיורים 3C, D בהתאמה. הגירוי העצבי הועבר 20 s לתוך קובץ 2 דקות. מיד לאחר הרכישה, ניתן להציג את האותות הנמדדים על ידי כל 464 הדיודות של מערך ההקלטות על גבי תמונה של ההכנה בתוכנת ההדמיה (איור 3E). בשלב זה, עקבות רבים מכילים קוצים שנרשמו באופן מיותר מאותם נוירונים, וכמה עקבות מכילים קוצים מיותר נוירון אחד. מיון ספייק של עקבות הדיודה המסוננים עם ICA הניב 53 עקבות עצביות ייחודיות, 30 מהן מוצגות באיור 3F. ניתן להעריך את הקינטיקה של קוצים בודדים באיור 3G, המרחיב קטע של ארבעה עקבות מאיור 3F (תיבה אדומה); הדיוק של אלגוריתם מיון ספייק ICA אומת בעבר באמצעות הקלטות אלקטרודה חדות בו זמנית, אשר הראו כי כל קוצים בעקבות ממוינים תואמים קוצים מוקלטים תאית נוירונים בודדים11,14.
אפלזיה גירוי זנב מרתיע מאוד לאפליסיה californica מעורר תגובת בריחה קצבית סטריאוטיפית בת שני חלקים15. השלב הראשון של התגובה הוא דהירה של כמה מחזורים של ריאות ראש ומשיכות זנב שמזיזות את החיה במהירות קדימה. זה בדרך כלל מלווה בתקופה של זחילה, הכוללת גלים חוזרים ונשנים של התכווצויות שרירים ראש-זנב המניעים את החיה קדימה במהירות איטית יותר במשך מספר דקות(איור 4A). כדי ללכוד את תוכניות מנוע הבריחה האלה בהקלטות אופטיות, מחשב כף היד התמקד במשטח הגנגליון הימני של הגנגליון הימני של הדוושה בהכנה מוחית מבודדת, ואלקטרודה יניקה הונחה על עצב הדוושה contralateral (שמאל) 9 (PdN9; איור 4ב. דקה אחת לתוך הקלטה אופטית רציפה של 20 דקות(איור 4C),PdN9 היה מגורה כדי לעורר את רצף תוכנית מנוע זחילת הדהירה. ההפצות המרחביות הגאוסיות הטעונות של האותות מכל 81 הנוירונים המתועדים מופו על גבי הגנגליון(איור 4D). הפחתת ממדיות החלה על ההקלטה המלאה גילתה כי שלבי הדהירה (ציאן) והסריקה (כחול כהה) של תוכנית הבריחה כבשו אזורים נפרדים ויצרו מסלולים שונים, דמויי ספירלה ולולאה, בהתאמה, בחלל הרכיבים העיקרי (איור 4E).
שלושה סרטונים המבוססים על ההקלטה של אפליה המתוארת באיור 4 מדגימים סוגים נוספים של ניתוחים שניתן לבצע בערכות נתונים כאלה. וידאו 1 מדמיין את הירי של כל הנוירונים המוקלטים לאורך כל ההקלטה. התקופה הראשונית שלאחר הגירוי של תוכנית מנוע הבריחה התאפיינה בדהירה, שבה הפעילות בגנגליון התאפיינה בהתפרצות מתחלפת של אשכולות פונקציונליים שונים(וידאו 2). הדהירה עברה לאחר מכן לזחילה, שבה הפעילות על פני אשכולות עצביים נותרה פאזית באופן רחב אך הניחה מסלול סיבובי נגד כיוון השעון בגנגליון(וידאו 3). שני הסרטונים האחרונים משלבים גם קיבוץ קונצנזוס, החושף את הירי והמיקומים של ההרכבים הפונקציונליים השונים לשלבי הדהירה והסריקה של תגובת הבריחה בנפרד. שים לב כי נוירונים רבים שהוקצו לאותו אשכול הן בשלבי הדהירה והן בשלבי הזחילה הראו קרבה פיזית זה לזה בגנגליון, בהתאם לממצאים קודמים12.
ברגיה האיאוליד נודיברנץ' ברגיה סטפניאה (איור 5A)מייצג מערכת מודלים חדשה למדעי המוח. מערך ההדמיה לניסוי טיפוסי בברגהיה מוצג באיור 5B. כדי לעורר פעילות עצבית רחבת היקף, אלקטרודה יניקה הונחה על עצב הדוושה השמאלי הבולט ביותר, וגירוי עצבי הועבר 30 s לתוך הקלטה של 2 דקות. עקבות מעובדות של ICA חשפו פעילות ספונטנית ומעוררת גירויים ב-55 נוירונים(איור 5C). זיהוי הקהילה באמצעות קיבוץ קונצנזוס זיהה עשרה הרכבים פונקציונליים נפרדים, המתוארים באיור 5D בגרף רשת ובאיור 5E, המארגן מחדש את העקבות המוצגות באיור 5C בהתבסס על משימות ההקבצות שלהם. ההפצות הגאוסיות של האותות מכל הנוירונים המוקלטים מועלות על גבי תמונה של ההכנה באיור 5F כדי לציין את מיקומם של כל 55 הנוירונים המוקלטים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig1.jpg"> איור 1: תצוגות של מערך ההדמיה האופטי ומערך הפוטודיודה (PDA). (A)אסדת ההדמיה האופטית, הכוללת את מחשב כף היד, המצלמה הדיגיטלית, המיקרוסקופ והבמה. (B)העיצוב הפנימי של מחשב כף היד, שבו סיבים אופטיים מחברים את צמצם ההדמיה ל-464 פוטודיודות. שורה של מגפים ממוקמת מעל פוטודיודות. (C)הפנים המשושה של צמצם ההדמיה, שאליו מתמקד האזור המצולם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig2.jpg"> איור 2: תרשים זרימה הממחיש את זרימת העבודה החיונית בהשגת הקלטות אופטיות. השלבים החיוניים בפרוטוקול הדמיית VSD, החל מהפעלה והכתמה ועד לפרטי ההדמיה, מתוארים בתרשים זרימה זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig3.jpg"> איור 3: תוצאות של טריטוניה דיומדאה, הממחישות נתונים גולמיים, אדנוןוסייק. (א) טריטוניה בורחת מכוכב הים הטורף פיקנופודיה הלינטודידים דרך השחייה שלה, המורכבת מכיפופים גב וגחוניים לסירוגין של הגוף. (B)סכמטי של כיוונון ההדמיה. Ce = אונה מוחית של גנגליון המוח; Pl = אונה pleural של גנגליון המוח; Pd = גנגליון דוושות. (C)נתונים גולמיים מ -20 פוטודיודות, המציגים פעילות בגנגליון הדוושה השמאלי לגירוי של PdN3 הנגדי (גירוי המצוין על ידי החץ). (D)נתונים מסוננים מאותן דיודות כמו ב- C (מסנן באטרוורת' של 5 ו- 100 הרץ). (E)פלט תוכנת הדמיה שבו עקבות דחוסים שנאספו על ידי כל 464 הדיודות מוחלפים על גבי תמונה של ההכנה. מיקומן של 20 הדיודות שעקבותיהן מוצגות ב- C ו- D מסומנות באדום. (F)שלושים עקבות נוירון יחיד נבחר שנוצרו על ידי מיון ספייק באמצעות ICA. (G)תצוגה מורחבת של ארבעה עקבות נוירון יחיד, המתאימים לתיבה האדומה ב- F, מציגה את פוטנציאל הפעולה שלהם ברזולוציה זמנית גבוהה יותר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig4.jpg"> איור 4: תוצאות אפליה קליפורניקה, הממחישות הקלטה ארוכת טווח, מיפוי אותות והפחתת ממדים. (א)שני השלבים של תוכנית מנוע הבריחה הרציף של אפליה, הדהירה והסריקה. (B)סכמטי של כיוונון ההדמיה. Ce = גנגליון מוחי; Pl = גנגליון pleural; Pd = גנגליון דוושות. (C)הקלטה של 20 דקות של 81 נוירונים בגנגליון הדוושה הימני מגיב לגירוי ל- PdN9 הנגדי (המצוין על ידי החץ). פסים ירוקים, ציאן וכחול כהה מתחת לעקבות מציינים את תקופת טרום הגירוי, את הדהירה ואת שלבי הסריקה של תוכנית מנוע הבריחה, בהתאמה. (D)תמונה של ההכנה עם הפצות גאוסיות נאיביליות ממופות של המיקומים של כל 81 מקורות האות העצביים שזוהו על ידי ICA. המתווה הירוק מייצג את המיקום של הפנים המשושה של מחשב כף היד ביחס לגנגליון. המספרים על כל גאוסיאן תואמים למספרי המעקב ב- C. (ה)הפחתת ממדיות באמצעות ניתוח רכיבים עיקריים המתווה את שלושת הרכיבים העיקריים הראשונים זה נגד זה במהלך קובץ 20 הדקות. תקופות הבסיס, הדהירה והזחילה שלפני גירוי מוצגות בירוק, ציאן וכחול כהה, בהתאמה. ראה קטעי וידאו 1-3 עבור אנימציות של ירי עצבי המתאים להקלטה זו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61623/61623fig5.jpg"> איור 5: תוצאות ברגיה סטפניאה, מין חדש למדעי המוח, הממחיש גרפים ברשת, קיבוץ פונקציונליומיפוי אותות דו-צדדיים. (א) דגימת ברגיה. (B)סכמטי של כיוונון ההדמיה. Ce = אונה מוחית של גנגליון המוח; Pl = אונה pleural של גנגליון המוח; Pd = גנגליון דוושות; קרנף = גנגליון קרנף. (C)עקבות המציגים את הפעילות הספונטנית והמעוררת גירוי של 55 נוירונים דו-צדדיים בגרעפי המוח (אספקת הגירוי מסומנת על ידי החץ). (D)גרף רשת המציג את עשרת ההרכבים הפונקציונליים, שלכל אחד מהם מוקצה צבע ייחודי, שזוהה באמצעות קיבוץ באשכולות. צמתים בעלילה זו מייצגים נוירונים, כאשר המרחק במרחב הרשת מייצג את מידת מתאם הירי בתוך ובין הרכבים. (E)העקבות ב- C מסודרות מחדש ומקודדות בצבע (בהתאם לסכימת הצבעים של D) להרכבים פונקציונליים. (ו)תמונה של ההכנה המציגה את מיקומי האותות הממופים מכל נוירון מוקלט, ואת מספרי המעקב ב- C ו- E שאליהם הם תואמים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/61623fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: אנימציה של תוכנית הלוקומוטור המלאה של אפליה בת 20 הדקות . האטימות של הצורות הלבנות מעל 81 נוירונים בודדים בגנגליון הדוושה הימני (פאנל שמאלי) הונעה על ידי עקבות עצביים מתאימים (פאנל ימני) ומגוונת באופן ליניארי כפונקציה של שיעור ספייק ממוצע (binned לכל 0.61 s של זמן אמת בהקלטה). עבור כל נוירון, אטימות מלאה נוטרשה לקצב הירי המרבי שלה לאורך זמן ההקלטה. שנייה אחת של הזמן שחלף בסרטון מייצגת 12.2 שניות של זמן אמת. סרגל קנה המידה מתאים לזמן אמת, כאשר הקווים הירוקים, הציאן והכחול הכהה מתחת לעקבות המציינים את שלבי הבסיס, הדהירה והסריקה שלפני הגירוי של תוכנית ה- locomotor escape, בהתאמה. התיבות הצהובות סביב שלב הדהירה וחלק משלב הסריקה מציינים את קטעים הקלטה המשמשים ליצירת ההנפשות בסרטונים 2 ו - 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video1(Full)_reduced.mp4" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)</a>
וידאו 2: אנימציה של שלב הדהירה של תוכנית locomotor לברוח אפליה. קיבוץ קונצנזוס בוצע על כל 81 הנוירונים המוקלטים רק בשלב הדהירה של תוכנית המנוע כדי להפיק את ההרכבים הפונקציונליים, באמצעות הגישה והתוכנה המתוארות והופכות לזמינות בנציג12. הרכבים עצביים המציגים בעיקר טוניק או דפוסי ירי לא סדירים במהלך שלב זה של תוכנית הבריחה הושמטו מסרטון זה. את פוטנציאל הפעולה של הנוירונים השייכים להרכבים השחורים וירוקי הזית ניתן לשמוע ברצועת השמע של הווידאו, כאשר הנוירונים והשעקבות המתאימים מודגשים. שיעורי היתד הממוצעים נוטרו את הנורמליזציה כמו בסרטון 1 ועם ביננינג זמן שווה; 1 s של זמן שחלף בסרטון מתאים 6.1 s של זמן אמת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video2(Gallop).mp4" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)</a>
וידאו 3: אנימציה של שלב הסריקה של תוכנית locomotor לברוח אפליה. קיבוץ קונצנזוס בוצע על כל 81 הנוירונים המוקלטים רק בשלב הזחילה של תוכנית המנוע כדי להפיק את ההרכבים הפונקציונליים. הרכבים המציגים בעיקר טוניק או דפוסי ירי לא סדירים בשלב זה של תוכנית המנוע הושמטו מסרטון זה. שיעורי העלייה הממוצעת נוטרו כמו בסרטונים 1 ו-2 ועם ביננינג זמן שווה; 1 s של זמן שחלף בסרטון מתאים כ 12.2 s של זמן אמת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61623/Video3(Crawl)_reduced.mp4" target="_blank">נא לחץ כאן כדי להציג וידאו זה. (לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates at JoVE.com

Photodiode-Based Optical Imaging for Recording Network Dynamics with Single-Neuron Resolution in Non-Transgenic Invertebrates

פרוטוקול זה מציג שיטה להדמיית פעילות אוכלוסיה עצבית עם רזולוציה של תא יחיד במינים לא מהונדסים של חוליות באמצעות צבעים רגישים למתח ספיגה ומערך פוטודיודות. גישה זו מאפשרת זרימת עבודה מהירה, שבה ניתן לבצע הדמיה וניתוח במהלך יום אחד.

הדמיה אופטית מבוססת פוטודיודה להקלטת דינמיקה ברשת עם רזולוציית נוירון יחיד בבלתי חוליות לא מהונדסים

The development of transgenic invertebrate preparations in which the activity of specifiable sets of neurons can be recorded and manipulated with light ...

Research

JoVE Journal

Biology

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Non-invasive 3D-Visualization with Sub-micron Resolution Using Synchrotron-X-ray-tomography

לא פולשני-3D ויזואליזציה עם תת מיקרון החלטה שימוש Synchrotron-X-ray-טומוגרפיה

Little is known about the internal organization of many micro-arthropods with body sizes below 1 mm. The reasons for that are the small size and the hard ...

Proper Care and Cleaning of the Microscope

טיפול ניקוי נאות של המיקרוסקופ

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a ...

Major Components of the Light Microscope

הרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ אור

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

שלב ניגודיות הפרעות דיפרנציאלי ניגודיות (DIC) מיקרוסקופית

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

הדמיה של סידן דינמיקה באוכלוסיות משנה של תאים הלבלב איון של העכבר

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

ליגריזציה דינמיקה של קולטני פני שטח תא בתאי חיים על ידי סך הכל השתקפות פנימית מיקרוסקופ פלואורסצנטית בשילוב עם ניתוח מספר ובהירות

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...