Name: calcium imaging in freely behaving caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration
Uploaded: 2021-04-29T15:00:00
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Wir danken dem Caenorhabditis Genetics Center für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Stämme. Diese Veröffentlichung wurde unterstützt durch JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (Grant Nr. JP18H02483), zu innovativen Bereichen des Projekts "Science of Soft Robot" (Förderkennzeichen JP18H05474), die PRIME der Japan Agency for Medical Research and Development (Fördernummer 19gm6110022h001) und die Shimadzu-Stiftung.

1. Kultivierung von Würmern bis zur Kalziumbildgebung
<ol><li>Übertragen Sie vier Tage vor einem Calcium-Imaging-Experiment zwei erwachsene ST12-Würmer auf eine neue Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) -Platte (Table of Materials), auf der Escherichia coli OP50 in einem quadratischen Muster (ca. 4 mm x 4 mm) mit einem Zellstreuer gestreift sind, so dass der Wurm während der Kalziumbildgebung die meiste Zeit in den Bakterien verbringt12.</li>
	<li>Inkubieren Sie diese NG...

<ol>
	<li>Hill, P. S. M., Wessel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotremology.">Biotremology.</a> Current Biology. 26 (5), 187-191 (2016).</li><li>Fettiplace, R., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensory+and+motor+roles+of+auditory+hair+cells.">The sensory and motor roles of auditory hair cells.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 19-29 (2006).</li><li>Vogel, V., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+force+and+geometry+sensing+regulate+cell+functions.">Local force and geometry sensing regulate cell functions.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (4), 265-275 (2006).</li><li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feeling+force:+physical+and+physiological+principles+enabling+sensory+mechanotransduction.">Feeling force: physical and physiological principles enabling sensory mechanotransduction.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 347-371 (2015).</li><li>Orr, A. W., Helmke, B. P., Blackman, B. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+mechanotransduction.">Mechanisms of mechanotransduction.</a> Developmental Cell. 10 (1), 11-20 (2006).</li><li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress,+temperature,+and+other+physical+stimuli.">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li><li>Chalfie, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+circuit+for+touch+sensitivity+in+Caenorhabditis+elegans.">The neural circuit for touch sensitivity in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 5 (4), 956-964 (1985).</li><li>Wicks, S. R., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integration+of+antagonistic+reflexes+revealed+by+laser+ablation+of+identified+neurons+determines+habituation+kinetics+of+the+Caenorhabditis+elegans+tap+withdrawal+response.">The integration of antagonistic reflexes revealed by laser ablation of identified neurons determines habituation kinetics of the Caenorhabditis elegans tap withdrawal response.</a> Journal of Comparative Physiology. A Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 179 (5), 675-685 (1996).</li><li>Rankin, C. H., Beck, C. D., Chiba, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+a+new+model+system+for+the+study+of+learning+and+memory.">Caenorhabditis elegans: a new model system for the study of learning and memory.</a> Behavioural Brain Research. 37 (1), 89-92 (1990).</li><li>Bozorgmehr, T., Ardiel, E. L., McEwan, A. H., Rankin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+plasticity+in+a+Caenorhabditis+elegans+mechanosensory+circuit.">Mechanisms of plasticity in a Caenorhabditis elegans mechanosensory circuit.</a> Frontiers in Physiology. 4, 88 (2013).</li><li>Sugi, T., Ohtani, Y., Kumiya, Y., Igarashi, R., Shirakawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+optical+quantification+of+mechanosensory+habituation+reveals+neurons+encoding+memory+in+Caenorhabditis+elegans.">High-throughput optical quantification of mechanosensory habituation reveals neurons encoding memory in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17236-17241 (2014).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li><li>Sugi, T., Okumura, E., Kiso, K., Igarashi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+mechanical+stimulation+method+for+quantifying+C.+elegans+mechanosensory+behavior+and+memory.">Nanoscale mechanical stimulation method for quantifying C. elegans mechanosensory behavior and memory.</a> Analytical Sciences: The International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32 (11), 1159-1164 (2016).</li><li>Brownell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compressional+and+surface+waves+in+sand:+used+by+desert+scorpions+to+locate+prey.">Compressional and surface waves in sand: used by desert scorpions to locate prey.</a> Science. 197 (4302), 479-482 (1977).</li><li>Clark, D. A., Gabel, C. V., Gabel, H., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+activity+patterns+in+thermosensory+neurons+of+freely+moving+Caenorhabditis+elegans+encode+spatial+thermal+gradients.">Temporal activity patterns in thermosensory neurons of freely moving Caenorhabditis elegans encode spatial thermal gradients.</a> Journal of Neuroscience. 27 (23), 6083-6090 (2007).</li><li>Tsukada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+spatial+thermal+gradient+encoded+in+thermosensory+neuron+AFD+in+Caenorhabditis+elegans.">Reconstruction of spatial thermal gradient encoded in thermosensory neuron AFD in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Neuroscience. 36 (9), 2571-2581 (2016).</li><li>Piggott, B. J., Liu, J., Feng, Z., Wescott, S. A., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+circuits+and+synaptic+mechanisms+underlying+motor+initiation+in+C.+elegans.">The neural circuits and synaptic mechanisms underlying motor initiation in C. elegans.</a> Cell. 147 (4), 922-933 (2011).</li><li>Nguyen, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+calcium+imaging+with+cellular+resolution+in+freely+behaving+Caenorhabditis+elegans.">Whole-brain calcium imaging with cellular resolution in freely behaving Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), 1074-1081 (2016).</li><li>Schrodel, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nature Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Prevedel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+whole-animal+3D+imaging+of+neuronal+activity+using+light-field+microscopy.">Simultaneous whole-animal 3D imaging of neuronal activity using light-field microscopy.</a> Nature Methods. 11, 727-730 (2014).</li><li>Nichols, A. L. A., Eichler, T., Latham, R., Zimmer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+brain+state+underlies+C.+elegans+sleep+behavior.">A global brain state underlies C. elegans sleep behavior.</a> Science. 356 (6344), (2017).</li><li>Zheng, M., Cao, P., Yang, J., Xu, X. Z. S., Feng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+imaging+of+multiple+neurons+in+freely+behaving+C.+elegans.">Calcium imaging of multiple neurons in freely behaving C. elegans.</a> Journal of Neuroscience Methods. 206 (1), 78-82 (2012).</li><li>Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+collectively+forms+dynamical+networks.">C. elegans collectively forms dynamical networks.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).</li></ol>

Im Allgemeinen erfordert die Quantifizierung der neuronalen Aktivität die Einführung einer Sonde und / oder Einschränkungen der Körperbewegung von Tieren. Für Studien des mechanosensorischen Verhaltens stellen jedoch die invasive Einführung einer Sonde und der Fesseln selbst mechanische Reize dar. C. elegans bietet ein System, um diese Probleme zu umgehen, weil seine Eigenschaften transparent sind und weil es einen einfachen, kompakten neuronalen Schaltkreis hat, der nur 302 Neuronen umfasst. Durch die Kom...

Tiere sind oft nicht lokalisierten mechanischen Reizen wie Vibrationen oder akustischen Wellenausgesetzt 1,2. Da diese Reize die Homöostase, Entwicklung und Fortpflanzung beeinflussen, müssen Tiere ihr Verhalten ändern, um mit ihnen fertig zu werden 3,4,5. Die neuronalen Schaltkreise und Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, sind jedoch kaum verstanden.
Mechanosensorisches Verhalten im Fadenwurz, Caenorhabditis elegans, ist ein einfaches Verhaltensparadigma, bei dem Würmer normalerweise ihr Verhalten von der Vorwärtsbewegung zu einer Rückwärtsfluchtreaktion ändern, wenn sie auf nichtlokalisierte Schwingungen stoßen6. Der neuronale Schaltkreis, der diesem Verhalten zugrunde liegt, besteht hauptsächlich aus fünf sensorischen Neuronen, vier Paaren von Interneuronen und mehreren Arten von Motoneuronen 7,8. Darüber hinaus gewöhnen sich Würmer an solche mechanischen Reize nach dem Training im Abstand mit wiederholter Stimulation 9,10,11. Daher stellt diese einfache Verhaltensreaktion ein ideales System dar, um neuronale Mechanismen zu untersuchen, die sowohl dem nicht lokalisierten Schwingungsverhalten als auch dem Gedächtnis zugrunde liegen. Ein Protokoll für die Kalziumbildgebung bei sich frei verhaltenden Würmern unter dem Einfluss von nicht lokalisierten Schwingungen wird veranschaulicht. Im Vergleich zu zuvor gemeldeten Systemen ist dieses System insofern einfach, als es keine zusätzliche Kamera für die Verfolgung benötigt. Es ermöglicht uns jedoch, die Frequenz, Verschiebung und Dauer der nicht lokalisierten Schwingung zu ändern. Da die Aktivierung der AVA-Interneuronen die Rückwärtsfluchtreaktion induziert, wurden Würmer, die GCaMP, einen Kalziumindikator, und TagRFP, ein calciuminsensitives fluoreszierendes Protein, unter der Kontrolle eines AVA-spezifischen Promotors mitexprimieren, als Beispiel verwendet (siehe Tabelle der Materialien für Details). Das Protokoll demonstriert die Aktivierung von AVA-Neuronen, wenn ein Wurm von der Vorwärts- zur Rückwärtsbewegung wechselt. Dieses Protokoll erleichtert das Verständnis des neuronalen Schaltkreismechanismus, der dem mechanosensorischen Verhalten zugrunde liegt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Data anaylsis software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DualViewImaging.nb</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>For analysis of acquired data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mathematica12</td>
			<td>Wolfram</td>
			<td></td>
			<td>For running data anaysis software DualViewImaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Escherichia coli and C. elegans strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>OP50</td>
			<td>Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lite-1(ce314) strain</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>KG1180</td>
			<td>Light-insensitive mutant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lite-1(ce314) strain expressing NLS-GCaMP-NLS and TagRFP under the control of the AVA-speciric promoter</td>
			<td>author</td>
			<td>ST12</td>
			<td>lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing NLS-GCaMP5G-NLS (NLS; nuclear localization signal) and TagRFP under the control of the flp-18 promoter as an extrachoromosomal arrays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Doppler vibrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lase Doppler vibrometer</td>
			<td>Polytec Japan</td>
			<td>IVS-500</td>
			<td>For quantifying&#160; frequency and displacement generated by the accoustic transducer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse macro system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay.txt</td>
			<td>Author</td>
			<td></td>
			<td>Script for temporally and specially controlling mouse cursol in Windows</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiMacroEx</td>
			<td>Vector</td>
			<td>https://www.vector.co.jp/download/file/winnt/util/fh667310.html</td>
			<td>Free download software for controling mouse cursor based on a script</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nematode growth media plate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar purified, powder</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>01162-15</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto pepton</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>211677</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Wako</td>
			<td>036-00485</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Wako</td>
			<td>034-03002</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-Photassium hydrogenphosphate</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>28727-95</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth, Lennox</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>20066-95</td>
			<td>For culture of E. coli OP50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate anhydrous</td>
			<td>TGI</td>
			<td>M1890</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Dihydrogenphosphate</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>28720-65</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Nakarai tesque</td>
			<td>31320-05</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (60 mm)</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>150270</td>
			<td>For preparation of NGM plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonlocalized vibration device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier</td>
			<td>LEPY</td>
			<td>LP-A7USB</td>
			<td>For stimulation with controllable vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acoustic transducer</td>
			<td>MinebeaMitsumi</td>
			<td>LVC25</td>
			<td>For stimulation with controllable vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WaveGene Ver. 1.5</td>
			<td>Thrive</td>
			<td>http://efu.jp.net/soft/wg/down_wg.html</td>
			<td>Free download software for controling vibration property</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noninvasive calcium imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Channel benchtop 3-phase brushless DC servo controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>BBD202</td>
			<td>Compatible controller for MLS203-1 stages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>479/585 nm BrightLine dual-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-479/585-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>505/606 nm BrightLine dual-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF505/606-Di01-25x36</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>512/25 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-512/25-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>630/92 nm BrightLine single-band bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-630/92-25</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Precision T7600</td>
			<td>Windows7 with Intel Xeon CPU ES-2630 and 8 GB of RAM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-speed x-y motorized stage</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MLS203-1</td>
			<td>Fast XY scannning stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image splitting optics</td>
			<td>Hamamatsu photonics</td>
			<td>A12801-01</td>
			<td>For acquisition of two channel images (GCaMP and TagRFP) generated by W-VIEW GEMINI Image spliting optics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>CoolLED</td>
			<td>pE-4000</td>
			<td>For generating 470 nm and 560 nm excitation light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>Zyla</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>x 2 Objective lens</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MVPLAPO2XC</td>
			<td>Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pKDK66 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pKDK66</td>
			<td>Co-injection marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTAK83 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pTAK83</td>
			<td>Plasmid for expression of TagRFP under the control of&#160; the flp-18 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTAK144 plasmid</td>
			<td>author</td>
			<td>pTAK144</td>
			<td>Plasmid for expression of NLS-GCaMP5G-NLS under the control of&#160; the flp-18 promoter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tracking software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>homingback.vi</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>SubVi file for tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National instruments</td>
			<td></td>
			<td>For running tracking software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zyla Control ver.2.6CI.vi</td>
			<td>author</td>
			<td></td>
			<td>For tracking a fluoresent spot of a worm through feedback control of sCMOS camera and x-y motorized stage</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

calcium imaging in freely behaving caenorhabditis elegans with well-controlled, nonlocalized vibration

Nicht lokalisierte mechanische Kräfte wie Schwingungen und akustische Wellen beeinflussen eine Vielzahl biologischer Prozesse von der Entwicklung bis zur Homöostase. Tiere bewältigen diese Reize, indem sie ihr Verhalten ändern. Das Verständnis der Mechanismen, die einer solchen Verhaltensänderung zugrunde liegen, erfordert eine Quantifizierung der neuronalen Aktivität während des interessierenden Verhaltens. Hier berichten wir über eine Methode zur Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von Caenorhabditis elegans mit nicht lokalisierten Schwingungen spezifischer Frequenz, Verschiebung und Dauer. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingungen unter Verwendung eines akustischen Wandlers und die Quantifizierung evozierter Kalziumreaktionen bei Einzelzellauflösung. Als Beweis für das Prinzip wird die Calciumreaktion eines einzelnen Interneurons, AVA, während der Fluchtreaktion von C. elegans auf Vibration demonstriert. Dieses System wird das Verständnis neuronaler Mechanismen erleichtern, die Verhaltensreaktionen auf mechanische Reize zugrunde liegen.

Hier wird ein Wurm, der sowohl GCaMP als auch TagRFP unter Kontrolle des AVA-Interneuron-spezifischen Promotors exprimiert, als Beispiel für die Kalziumbildgebung bei freiem Verhalten von C. elegans verwendet. GCaMP- und TagRFP-Kanaldaten wurden als eine Reihe von Bildern, von denen einige in Abbildung 6 dargestellt sind, und als Film (Supplemental Movie 1) erhalten. Die Verschiebung der Petriplatte, die durch unser nicht lokalisiertes Schwingungssystem induziert w...

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Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Hier wird ein System zur Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter , nicht lokalisierter Vibration berichtet. Dieses System ermöglicht es den Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nanoskaliger Verschiebung hervorzurufen und Kalziumströme während der Reaktionen von C. elegans auf die Schwingungen zu quantifizieren.

Kalziumbildgebung bei frei verhaltender Caenorhabditis elegans mit gut kontrollierter, nicht lokalisierter Schwingung

Nonlocalized mechanical forces, such as vibrations and acoustic waves, influence a wide variety of biological processes from development to homeostasis. ...

Unser System ermöglicht es Forschern, nicht lokalisierte Schwingungen mit gut kontrollierten Eigenschaften bei nicht skalierter Verschiebung hervorzurufen und den Kalziumstrom während der Reaktionen der Reizstoffe auf die Schwingungen zu quantifizieren. Als Hauptvorteil dieser Technik können wir die neuronalen Mechanismen, die zugrunde liegenden Verhaltensmechanismen, nichtinvasiv untersuchen. Bereiten Sie ein neues Nematodenwachstumsmedium oder eine NGM-Platte vor, auf der Escherichia coli OP50 in einem quadratischen Muster mit einem Zellstreuer gestreift ist, so dass der Wurm während der Kalziumbildgebung die meiste Zeit in den Bakterien verbringt.Übertragen Sie vier Tage vor einem Kalzium-Bildgebungsexperiment zwei erwachsene ST12-Würmer auf die Platte und legen Sie die Platte für vier Tage in einen 20-Grad-Celsius-Inkubator. Führen Sie Kalziumbildgebung mit einem Mikroskop durch, das mit einem akustischen Wandlergerät zur Stimulation, einem 2-fachen Objektiv, einer Hochgeschwindigkeits-CMOS-Kamera und einer Bildaufteilungsoptik ausgestattet ist. Schalten Sie den Präzisionscomputer im motorisierten Stage Controller X Y ein.Schalten Sie dann den Verstärker ein und stellen Sie den Lautstärkeregler auf 10 in der Basis und die Höheneinsteller auf acht. Um GCaMP anzuregen und RFP zu markieren, schalten Sie die 488- und 560-Nanometer-Leuchten der LED-Lichtquelle ein. Stellen Sie die 470- und 550-Nanometer-Messgeräte der Steuerkapsel in der Lichtquelle auf 5% ein, damit die Intensität des LED-Lichts für die Bildgebung geeignet ist.Laden Sie die folgenden Softwarepakete und Fenster herunter und installieren Sie sie. Mausmakro-Software, Software für die Schwingungsdämpfung, Software für das laufende Tracking und Software für die Datenanalyse. Doppelklicken Sie auf die Tracking-Softwaredatei, stellen Sie dann die Belichtungszeit auf 0,033 Sekunden ein und binning auf zwei mal zwei, um eine reibungslose Bildaufnahme zu gewährleisten.Klicken Sie auf die Schaltfläche Ausführen und warten Sie fünf Minuten, um die Software zu stabilisieren. Geben Sie die Informationen für die Bildaufnahme ein. Wenn Sie beispielsweise 500 Bilder ohne Intervall aufzeichnen möchten, geben Sie 500 in das Feld Bilder insgesamt, 500 in das Feld Bilder und Null in das Feld Intervalle ein.Nachdem Sie die Aufnahmetaste eingeschaltet haben, teilen Sie das Fluoreszenzbild mithilfe der Bildaufteilungsoptik auf und projizieren Sie den GCaMP-Kanal und den Tag-RFP-Kanal auf zwei Hälften der CMOS-Kamera. Kalibrieren Sie die Koordinaten des GCaMP und markieren Sie RFP-Kanäle und speichern Sie die Einstellungen. Legen Sie dann das Verzeichnis so fest, dass die Datendatei ausgegeben wird, und deaktivieren Sie die Erfassung.Lesen Sie den Assay. Textdatei mit dem Mausmakrosystem, so dass der Mauszeiger basierend auf den Koordinaten und dem Zeitplan in dieser Datei gesteuert wird und doppelklicken Sie auf die Softwaredatei zur Schwingungskontrolle. Stellen Sie die Koordinaten des Mauszeigers in der Wartezeit bis zur Stimulation nach dem Start der Aufnahme ein und stellen Sie dann die Frequenz- und Amplitudenwerte in der Software zur Schwingungskontrolle ein.Übertragen Sie einen einzelnen Wurm, der sowohl GCaMP als auch Tag-RFP ausdrückt, von der inkubierten Platte auf eine frische NGM-Platte, auf der E coli OP50 gestreift wurde. Befestigen Sie die NGM-Platte mit transparentem Klebeband am akustischen Wandler. Schalten Sie für die Kalziumbildgebung die Erfassungstaste ein und finden Sie den Wurm bei 2,5-facher Vergrößerung.Stellen Sie das Sichtfeld auf 1,1 x 1,1 Millimeter mit einer Auflösung von 2,6 Mikrometern pro Pixel ein. Schalten Sie das helle Licht aus und klicken Sie auf die Homing-Taste, um den fluoreszierenden Punkt eines Wurms zu verfolgen, der die Bewegung der X-Y-Stufe einleitet, um den maximalen Intensitätsbereich des Wurms in der Mitte des Sichtfelds im Tag-RFP-Bild zu halten. Stellen Sie sicher, dass die Intensitätswerte ungefähr 1000 betragen.Wenn nicht, stimmen Sie die 470- und 550-Nanometer-Messgeräte der Kontrollkapsel in der Lichtquelle ab. Drücken Sie die Schaltfläche Ausführen im Mausmakrosystem, um die Mauszeigersteuerung zuzulassen, und überprüfen Sie, ob die BMP-Ausgabedatei ordnungsgemäß erstellt wurde. Erstellen Sie für die Datenanalyse einen Ordner auf dem Desktop und nennen Sie ihn Calcium Imaging", erstellen Sie dann einen Ordner innerhalb des Calcium Imaging-Ordners und nennen Sie ihn CI-Ergebnis für die Ausgabeergebnisdateien.Doppelklicken Sie auf das Dual-View-Imaging. MB-Datei, die in der Datenanalysesoftware geschrieben wurde, und fügen Sie die Dateipfade zum CI-Ergebnisordner in den Ordner mit der BMP-Datei ein. Drücken Sie gleichzeitig die Umschalt- und die Returntaste, um eine automatische Analyse zu starten, die den Wert eines Bereichs mit maximaler Intensität im Tag-RFP-Bild verwendet.Prüfen Sie abschließend, ob die Ausgabedateien im CI-Ergebnisordner entsprechend angelegt sind. In der repräsentativen Analyse wurden GCaMP- und Tag-RFP-Kanaldaten als eine Reihe von Bildern erhalten. Die Verschiebung der Petrischale, die durch ein nicht lokalisiertes Schwingungssystem induziert wurde, wurde ebenfalls quantifiziert.Die Verschiebung kann durch Einstellen des Amplitudenwertes in der Software zur Schwingungsdämpfung sowie des Lautstärkereglers und des Verstärkers gesteuert werden. Während die Frequenz durch Einstellen des Frequenzwertes in der Software reguliert werden kann. Eine transiente Kalziumreaktion von AVA-Neuronen wurde bei Stimulation mit Vibrationen mit einer Frequenz von 630 Hertz und einer Verschiebung von etwa 4,5 Mikrometern pro Sekunde beobachtet, was darauf hindeutet, dass das Ava-Neuron während der Rückwärtsreaktion eines Wurms auf die nicht lokalisierte Stimulation aktiviert wurde.In unserem Verfahren können wir nur ein einzelnes Neuron quantifizieren. Dieses System kann jedoch auch mit einem biometrischen Bildgebungsverfahren kombiniert werden, um mehrere Neuronen oder sogar das gesamte Gehirn nichtinvasiv zu quantifizieren.

Research

JoVE Journal

Behavior

Calcium Imaging in Freely Behaving Caenorhabditis elegans with Well-Controlled, Nonlocalized Vibration

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging fMRI with Auditory Stimulation in Songbirds

Functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) mit Auditive Stimulation in Singvögel

The neurobiology of birdsong, as a model for human speech, is a pronounced area of research in behavioral neuroscience. Whereas electrophysiology and ...

Forschung

Verhalten

Construction of Microdrive Arrays for Chronic Neural Recordings in Awake Behaving Mice

Bau Microdrive Arrays für chronische Neural Recordings in Awake benimmt Mäuse

State-of-the-art electrophysiological recordings from the brains of freely behaving animals allow researchers to simultaneously examine local field ...

Long-term Potentiation of Perforant Pathway-dentate Gyrus Synapse in Freely Behaving Mice

Langzeit-Potenzierung der perforant Pathway-Gyrus dentatus Synapse in Frei Behaving Mäuse

Studies of long-term potentiation of synaptic efficacy, an activity-dependent synaptic phenomenon having properties that make it attractive as a potential ...

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

Zwei-Photonen-Calcium Imaging in Mäuse Navigieren in einer Virtual-Reality-Umgebung

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Die Messung der Fronto-limbischen Aktivität unter Verwendung einer emotionalen Oddball Aufgabe bei Kindern mit familiärer High Risk for Schizophrenia

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Measurement of Vibration Detection Threshold and Tactile Spatial Acuity in Human Subjects

Die Messung der Schwingungserfassungsschwelle und Tactile Spatial Acuity in Human Subjects

Tests that allow the precise determination of psychophysical thresholds for vibration and grating orientation provide valuable information about ...

A Novel Experimental and Analytical Approach to the Multimodal Neural Decoding of Intent During Social Interaction in Freely-behaving Human Infants

A Novel experimentellen und analytischen Ansatz zur multimodalen Neural Decoding of Intent Während Soziale Interaktion in Frei-verhalten menschliche Säuglinge

Understanding typical and atypical development remains one of the fundamental questions in developmental human neuroscience. Traditionally, experimental ...

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

A Wireless, Bidirectional Interface for In Vivo Recording and Stimulation of Neural Activity in Freely Behaving Rats

Ein kabelloses, bidirektionale Schnittstelle für In Vivo Aufnahme und Stimulation der neuronalen Aktivität in Ratten frei Verhalten

In vivo electrophysiology is a powerful technique to investigate the relationship between brain activity and behavior at a millisecond and micrometer ...

Whole Body Vibration Methods with Survivors of Polio

Ganzkörper-Vibration-Methoden mit Überlebenden des Polio

The purpose of the original study was to examine the use of whole body vibration (WBV) on polio survivors with and without post-polio syndrome as a form ...