Name: derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells
Uploaded: 2020-11-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institute of Mental Health Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists (BRAINS) Award R01MH1113858 (till R.K.), en National Institutes of Health Award KL2 TR002542 (PL). ett nationellt institut för klinisk forskares utveckling av mental hälsa K08MH086846 (till R.K.), ett Sydney R Baer Jr Foundation Grant (till P.L.) Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award (till R.K.), Ryan Licht Sang Bipolar Foundation (till R.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (till R.K.), Harvard Stem Cell Institute (till R.K.) och av Steve Willis och Elissa Freud (till R.K.). Vi tackar Dr. Annie Kathuria för hennes kritiska läsning och feedback på manuskriptet.

Mänskliga iPSCs omprogrammerades från fibroblaster av friska givare med hjälp av ett protokoll som godkänts av Institutional Review Boards of Massachusetts General Hospital och McLean Hospital, och karakteriserades enligt beskrivningen i tidigarestudier 44,45,46.
OBS: Kortfattat omprogrammerades fibroblaster till iPSC via mRNA-baserad genetisk omprogrammering47. IPSCs bibeh...

Ändringar och felsökning
I det här protokollet gjorde vi vissa ändringar i att använda en vanlig extracellulär matris och cellodlingsmedia under iPSC-härledning för härledning av BMECs(figur 1). Dessa ändringar påverkade inte förmågan att härleda BMECS från mänskliga iPSCs enligt beskrivningen i Lippmannprotokollet1. En iPSC-linje från en annan frisk donator användes för att visa att detta modifierade pro...

Funktion för blod- hjärnbarriär Blod- hjärnbarriären (BBB) bildar en gräns som begränsar rörelsen av ämnen från blodet till hjärnan. BBB består av hjärnmikrovaskulära endotelceller (BMECs) som bildar ett monoskikt som fodrar vaskulaturen. BMECs, tillsammans med astrocyter, nervceller, pericyter, microglia och extracellulär matris, bildar den neurovaskulära enheten. BMECs har en hårt reglerad paracellulär struktur som gör det möjligt för BBB att upprätthålla hög transendotel elektrisk resistans (TEER), som begränsar passiv diffusion och fungerar som en indikator på barriärintegritet1,2. BMECs har också proteiner som hjälper till med transcellulära rörelser såsom endocytos, transcytos och transmigration, samt extravasation av leukocyter under ett immunsvar3. BMECs förlitar sig på tillströmning och utflöde transportörer för näring och avlägsnande av avfallsprodukter, för att upprätthålla en homeostatisk balans i hjärnan3. Till exempel kan du solute carrier family 2 member 1 (SLC2A1) är en tillströmningstransportör som ansvarar för glukosförflyttningen över BBB4, medan utflödestransportörer som ATP-bindande kassettunderfamilj B-medlem 1 (ABCB1) och ATP-bindande kassettunderfamilj C-medlem 1 (ABCC1) ansvarar för att återföra substrat tillbaka till blodflödet3,5,6,7. ABCB1 substrat inkluderar morfin, verapamil4, och antipsykotika såsom olanzapin och risperidon8, medan ABCC1 transportören har en mängd olika substrat inklusive sulfat konjugat, vinkrisin och glukuronid konjugat4.
Tillämpning av BBB-modeller vid psykiatriska störningar BBB dysfunktion har varit inblandad i ett antal neurologiska och psykiatriska störningar, inklusive schizofreni och bipolär sjukdom9,10. Nyligen används iPSC-härledda ex vivo-cellulära modeller för att förhöra de cellulära och molekylära grunderna för psykiatriska störningar, men dessa modeller tar för närvarande inte hänsyn till den potentiella rollen som neurovaskulaturen11,12,13. Det är hypotesen att perifera inflammatoriska cytokiner som cirkulerar i blodet kan påverka BBB14 , 15,16,17, men det finns också bevis för paracellulär18,19,20,21,22, transcellulär23,24,25,26,27,28,29, och extracellulärmatris 20,29,30,31,32 avvikelser som bidrar till BBB dysfunktion. Störningar av BBB kan leda till att innehållet i blodet kommer in i hjärnan parenkym och aktiverar astrocyter och/eller mikroglia för att frigöra proinflammatoriska cytokiner, som i sin tur initierar ett inflammatorisktsvar 33 som kan ha skadliga effekter på hjärnan34. BMECs är den primära komponenten i BBB och att undersöka strukturen och funktionen hos dessa celler kan öka förståelsen för BBB dysfunktion i neurologiska och psykiatriska störningar.
Alternativa BMEC-modeller Före utvecklingen av effektiva protokoll för härledande BMECs från iPSCs1,6 ,35,36, hade forskare använt odödliga BMECs37 för att studera BBB-funktion. Många av dessa modeller misslyckades dock med att uppnå önskvärda BBB fenotyper, ett sådant fysiologiskt intervall av TEER värden38,39. Att använda iPSCs har fördelen att behålla den genetiska bakgrunden hos den individ från vilken cellerna härleds. Forskare arbetar aktivt med att etablera iPSC-härledda ex vivo mikromiljömodeller som rekapitulerar den mänskliga hjärnans struktur och funktion. Forskare har utvecklat metoder för att härleda BMECs som strukturellt och fysiologiskt liknar BMECs som finns in vivo. Metoder för att erhålla renade populationer av iPSC-härledda BMECs kräver ett antal olika steg med protokoll som optimeras under de senasteåren 1,6,35,36. I allmänhet odlas iPSC-härledda BMECs i Essential 6 (E6) medium i 4 dagar, följt av 2 dagar i humant endotel serum-fritt medium (hESFM) kompletterat med grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF), retinosyra (RA) och B27 tillägg. Cellerna odlas sedan på en kolgen IV (COL4) och fibronectin (FN) matris för att erhålla >90% homogena BMECs1.
Identiteten hos BMECs bekräftas av immunofluorescens som visar co-expression av BMEC proteiner inklusive trombocyt-endotel cell vidhäftning molekyl-1 (PECAM1), SLC2A1 och snäva junction proteiner såsom snäva junction protein 1 (TJP1), occludin (OCLN) och claudin-5 (CLDN5)6. Spirande analyser har använts för att bekräfta den angiogena potentialen hos iPSC-härledda BMECs. 6 BBB-integriteten hos BMECs utvärderas genom förekomst av fysiologiska TEER-värden in vitro (~2000Ω x cm2)37 och mätbar aktivitet för utflödestransportörer som ABCB1 och ABCC11,6,36. De senaste metodologiska framstegen från Lippmann-gruppen har lett till iPSC-härledda BMEC-protokoll med minskad experimentell variabilitet och förbättrad reproducerbarhet1. Det är dock inte känt om de kan utvidgas och passeras bortom underodlingsstadiet. Vårt ändrade protokoll syftar till att ta itu med detta problem genom att passa iPSC-härledda BMECs efter dag 8 och bedöma om de kan utökas ytterligare för att behålla BBB-egenskaper efter kryopreservation. Även om inga studier har beskrivit passaging av iPSC-härledda BMECs, finns det ett protokoll för BMEC kryopreservation som behåller fysiologiska BBB egenskaper efter att ha genomgått en frys-tina cykel40. Det är dock inte känt efter cryopreservation BMECs kan passeras och behålla BBB egenskaper.
BMECs som härrör från iPSCs med Lippmann protokollet har använts för att modellera BBB störningar i neurologiska störningar såsom Huntingtons sjukdom7. Sådana iPSC-härledda BMECs har också använts för att undersöka effekterna av bakteriell infektion såsom Neisseria meningitidis eller grupp B Streptococcus på störningar av blod-CSF-barriären respektive BBB41,42. Med hjälp av iPSC-härledda BMECs från 22q borttagning syndrom patienter med schizofreni, observerade forskare en ökning av intercellulär vidhäftning molekyl-1 (ICAM-1), en stor vidhäftningsmolekyl i BMECs som hjälper till med rekrytering och extravasation av leukocyter i hjärnan43. Sammantaget visar dessa studier nyttan av iPSC-härledda BMECs för att studera BBB störningar i komplexa neuropsykiatriska störningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2&#8242;,7&#8242;-dichlorodihydrofluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883-50MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A6964-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 Donkey anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-31572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (PECAM-1) (89C2) Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3528S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CLDN5 (Claudin-5)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>35-2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV from human placenta</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5533-5mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 2 mL Internal Threaded Polypropylene Cryogenic Vial&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;8670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Falcon Flat Bottom Cell Culture Plates (24-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts (12-wells)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 (without phenol red)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2438-50mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey serum</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9663-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (+/+)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epithelial Volt/Ohm (TEER) Meter (EVOM2) STX2</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium (Thermo Fisher)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F2006-2mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A1413202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balance Salt Solution with calcium and magnesium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human endothelial serum-free medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11111044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>InCell Analyzer 6000</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen&#160;Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MK-571</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7571-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NutriStem</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>01-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>33-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 16%</td>
			<td>Electron Microscopy Services</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perkin Elmer Envision 2103 multi-plate Reader</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human VEGF 165</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine 123</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>83702-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLC2A1 (GLUT-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA1-21041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX17</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>81778S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TJP-1 (ZO-1)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PA5-28869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valspodar (Sigma) (cyclosporin A)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>SML0572-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15040066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)</td>
			<td>Tocris/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem cells

Hjärnans mikrovaskulära endotelceller (BMECs) kan skiljas från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) för att utveckla ex vivo cellulära modeller för att studera blod - hjärnbarriär (BBB) funktion. Detta ändrade protokoll innehåller detaljerade steg för att härleda, expandera och cryopreserve BMECs från mänskliga iPSCs med hjälp av en annan givare och reagenser än de som rapporterats i tidigare protokoll. iPSCs behandlas med väsentliga 6 medium i 4 dagar, följt av 2 dagar av mänskliga endotel serum-fri kultur medium kompletteras med grundläggande fibroblast tillväxtfaktor, retinsyra och B27 tillägg. Dag 6 är cellerna underkulturerade på en kollagen/fibronectinmatris i 2 dagar. Immunocytokemi utförs dag 8 för BMEC-marköranalys med CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1 och SLC2A1. Western blotting utförs för att bekräfta BMEC markör uttryck och avsaknad av SOX17, en endodermal markör. Angiogen potential påvisas med en spirande analys. Transendotel elektrisk resistans (TEER) mäts med hjälp av ätpinnarlektroder och voltohmmeter från dag 7. Spillluxtransportöraktivitet för ATP-bindningskassettunderfamilj B-medlem 1 och ATP-bindningskassett underfamilj C-medlem 1 mäts med hjälp av en multiplåtläsare dag 8. Framgångsrik härledning av BMECs bekräftas av förekomsten av relevanta cellmarkörer, låga nivåer av SOX17, angiogen potential, transportöraktivitet och TEER-värden ~2000 Ω x cm2. BMECs utökas fram till dag 10 innan de passar på nybelagda kollagen/fibronectinplattor eller kryopreserverade. Detta protokoll visar att iPSC-härledda BMECs kan utökas och passeras minst en gång. Lägre TEER värden och sämre lokalisering av BMEC markörer observerades dock efter cryopreservation. BMECs kan användas i co-culture experiment med andra celltyper (nervceller, glia, pericytes), i tredimensionella hjärnmodeller (organ-chip och hydrogel), för vascularization av hjärnan organoider, och för att studera BBB dysfunktion i neuropsykiatriska störningar.

Differentiering av BMEC Några kritiska steg i detta protokoll bör följas exakt (figur 1). E6 medium användning på dag 1 är viktigt, eftersom det ofta används för härleda neuroectoderm härstamning från iPSCs inom en relativt kort tidsperiod ger reproducerbara resultat över flera cellinjer36. Ett annat viktigt steg är dag 4 av differentiering, där E6 medium ska bytas till hESFM med utspädd (1:200) B27, 20 ng/mL bFGF och 10 μM RA för ...

Watch this Scientific Journal Video about Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Detta protokoll beskriver en anpassad metod för att härleda, expandera och cryopreserve hjärnan mikrovaskulära endotelceller erhålls genom att differentiera mänskliga inducerade pluripotenta stamceller, och att studera blod hjärnbarriär egenskaper i en ex vivo modell.

Härledning, expansion, kryopreservation och karakterisering av hjärnans mikrovaskulära endotelceller från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

Effektiv Derivering av mänskliga neurala stamceller och nervceller från Pluripotenta mänskliga embryonala stamcellslinjer med liten molekyl Induktion

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Specifikationen av Telencephalic glutamaterg nervceller från mänskliga pluripotenta stamceller

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Isolering och odling av endotelceller från embryonal framhjärnan

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

A cGMP-applicable Expansion Method for Aggregates of Human Neural Stem and Progenitor Cells Derived From Pluripotent Stem Cells or Fetal Brain Tissue

En cGMP-tillämplig Expansion Metod för aggregat av mänskliga neurala Stem och stamceller härledas från pluripotenta stamceller eller fosterhjärnvävnad

A cell expansion technique to amass large numbers of cells from a single specimen for research experiments and clinical trials would greatly benefit the ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder fria Härledning av neurallisten progenitorceller från Human pluripotenta stamceller

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Riktad dopaminerga nerv Differentiering från Human pluripotenta stamceller

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Isolation of Primary Murine Brain Microvascular Endothelial Cells

Isolering av Primär Murina Brain mikrovaskulära endotelceller

The blood-brain-barrier is ultrastructurally assembled by a monolayer of brain microvascular endothelial cells (BMEC) interconnected by a junctional ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Härledning av Leptomeninges Explantation kulturer från obduktions Human Brain Donatorer

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells

Isolering av primära murina skelettmuskulaturen mikrovaskulära endotelceller

The endothelial cells of skeletal muscle capillaries (muscle microvascular endothelial cells, MMEC) build up the barrier between blood stream and skeletal ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...