Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

نشكر أدريانا بريسكو وجيل سميث ورابي مراد وألين ج. رانجيل على المشورة والتوجيه في دمج بعض هذه الخطوات في سير العمل لدينا. كما أننا ممتنون لكاثرين ويليامز، وإليزابيث ريبواه، وناتاشا بيتشياني على تعليقاتهم على المخطوطة. وقد دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة جورج هيويت لزمالة البحوث الطبية إلى A.M.M.

يتبع هذا البروتوكول إرشادات رعاية الحيوانات في جامعة كاليفورنيا في إيرفين.
1. إعداد مكتبة RNA-seq
<ol><li>عزل الجيش الملكي النيبالي باستخدام الطرق التالية.<ol>
<li>جمع العينات. إذا كان الجيش الملكي النيبالي هو أن يتم استخراجها في وقت لاحق، فلاش تجميد العينة أو مكان في حل تخزين الجيش ?...

الغرض من هذا البروتوكول هو تقديم مخطط تفصيلي للخطوات اللازمة لوصف عائلة الجينات باستخدام بيانات الحمض النووي الريبي-seq. وقد ثبت أن هذه الأساليب تعمل لمجموعة متنوعة من الأنواع ومجموعات البيانات4و34و35. وقد تم تبسيط خط الأنابيب الذي أنشئ هنا...

وقد سهل التقدم في تكنولوجيات التسلسل تسلسل الجينوم والنسخ من الكائنات الحية غير النموذجية. بالإضافة إلى زيادة جدوى تسلسل الحمض النووي والحمض النووي الريبي من العديد من الكائنات الحية ، وفرة من البيانات متاحة للجمهور لدراسة الجينات ذات الأهمية. الغرض من هذا البروتوكول هو توفير خطوات المعلوماتية الحيوية للتحقيق في التطور الجزيئي والتعبير عن الجينات التي قد تلعب دورا هاما في الكائن الحي ذات الاهتمام.
التحقيق في تطور الجينات أو الجينات الأسرة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تطور النظم البيولوجية. عادة ما يتم تحديد أفراد عائلة الجينات من خلال تحديد الزخارف المحفوظة أو تسلسل الجينات المتجانسة. تم التحقيق في تطور عائلة الجينات سابقا باستخدام الجينوم من الكائنات الحية نموذج ذات الصلة البعيدة1. ويتمثل أحد القيود المفروضة على هذا النهج في أنه ليس من الواضح كيف تتطور هذه الأسر الجينية في الأنواع ذات الصلة الوثيقة ودور الضغوط البيئية الانتقائية المختلفة. في هذا البروتوكول، ونحن تشمل البحث عن homologs في الأنواع ذات الصلة الوثيقة. من خلال توليد فيلوجيني على مستوى الفيلوم، يمكننا أن نلاحظ الاتجاهات في تطور الأسرة الجينية مثل الجينات المحفوظة أو الازدواجية الخاصة بالنسب. على هذا المستوى، يمكننا أيضا التحقيق فيما إذا كانت الجينات هي تقويم العظام أو البارالوجات. في حين أن العديد من التجانسات تعمل على الأرجح بشكل مماثل لبعضها البعض ، إلا أن هذا ليس بالضرورة هو الحال2. دمج الأشجار النباتية في هذه الدراسات مهم لحل ما إذا كانت هذه الجينات المتجانسة هي تقويم العظام أم لا. في eukaryotes، العديد من تقويم العظام الاحتفاظ بوظائف مماثلة داخل الخلية كما يتضح من قدرة البروتينات الثدييات لاستعادة وظيفة تقويم العظام الخميرة3. ومع ذلك ، هناك حالات حيث يقوم جين غير تقويم العظام بوظيفة مميزة4.
تبدأ الأشجار النباتية في تحديد العلاقات بين الجينات والأنواع ، ومع ذلك لا يمكن تعيين الوظيفة فقط على أساس العلاقات الوراثية. توفر دراسات التعبير الجيني إلى جانب الشروح الوظيفية وتحليل الإثراء دعما قويا لوظيفة الجينات. الحالات التي يمكن فيها قياس التعبير الجيني ومقارنته عبر الأفراد أو أنواع الأنسجة يمكن أن تكون أكثر دلالة على الوظيفة المحتملة. يتبع البروتوكول التالي الأساليب المستخدمة في التحقيق في جينات الأوبسين في Hydra vulgaris7، ولكن يمكن تطبيقها على أي نوع وأي عائلة جينية. وتوفر نتائج هذه الدراسات أساسا لمزيد من التحقيق في وظائف الجينات وشبكات الجينات في الكائنات غير النموذجية. على سبيل المثال ، فإن التحقيق في فيلوجيني من opsins ، وهي البروتينات التي تبدأ سلسلة نقل ضوئي ، يعطي سياقا لتطور العينين والكشف عن الضوء8و9و10و11. في هذه الحالة ، يمكن للكائنات غير النموذجية وخاصة الأنواع الحيوانية القاعدية مثل cnidarians أو ctenophores توضيح الحفظ أو التغيرات في سلسلة النقل الضوئي والرؤية عبر clades12و13و14. وبالمثل، فإن تحديد البيلوجيني والتعبير وشبكات عائلات الجينات الأخرى سيخبرنا بالآليات الجزيئية الكامنة وراء التكيفات.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

غالبا ما يكون تقطير مجموعات البيانات الكبيرة والإبلاغ عنها، مثل الجينوم الكامل أو بيانات النسخ، مهمة شاقة. إحدى الطرق لكسر النتائج هي التركيز على عائلة جينية واحدة أو أكثر مهمة للكائن الحي والدراسة. في هذا البروتوكول، نحدد الخطوات المعلوماتية الحيوية لتوليد فيلوجيني وتحديد التعبير عن الجينات ذات الاهتمام. يمكن للأشجار النباتية إعطاء فكرة عن كيفية تطور الجينات داخل الأنواع وفيما بينها وكذلك الكشف عن علم الكائنات الحية. ويمكن تعزيز هذه النتائج باستخدام بيانات الحمض النووي الريبي-seq لمقارنة التعبير عن هذه الجينات في مختلف الأفراد أو الأنسجة. ويمكن أن تكشف دراسات التطور الجزيئي والتعبير عن أساليب التطور وحفظ وظيفة الجينات بين الأنواع. يمكن أن يكون توصيف عائلة الجينات بمثابة نقطة انطلاق للدراسات المستقبلية ويمكن أن يسلط الضوء على عائلة جينية مهمة في جينوم جديد أو ورقة نسخ.

تم تلخيص الطرق المذكورة أعلاه في الشكل 1 وتم تطبيقها على مجموعة بيانات من أنسجة هيدرا فولغاريس. H. vulgaris هو اللافقاريات المياه العذبة التي تنتمي إلى Cnidaria فيلوم الذي يشمل أيضا الشعاب المرجانية، قناديل البحر، شقائق النعمان البحر. H. vulgaris يمكن أن تتكاثر لا جن?...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

الغرض من هذا البروتوكول هو التحقيق في تطور والتعبير عن الجينات المرشحة باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي.

خط أنابيب المعلوماتية الحيوية للتحقيق في التطور الجزيئي والتعبير الجيني باستخدام الحمض النووي الريبي-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

يحدد هذا البروتوكول الخطوات المعلوماتية الحيوية للتحقيق في التطور الجزيئي والتعبير عن الجينات المرشحة. هنا نقدم تعليمات شاملة بحيث يمكن لأي شخص لديه خبرة المعلوماتية الحيوية الحد الأدنى من تشغيل من خلال هذا البروتوكول. يمكن تطبيق خط الأنابيب هذا على أي كائن حي وأي عائلة جينية.إحدى القضايا الشائعة عند القيام المعلوماتية الحيوية هي فشل البرامج النصية قذيفة. عند محاولة هذا البروتوكول، تأكد من أن لديك أحدث البرامج، اقرأ ملفات الخطأ، وتحقق من الدليل بعناية. للبدء، قم بتسجيل الدخول إلى حساب نظام المجموعة الكمبيوتر على محطة طرفية أو إطار تطبيق PuTTY.على المحطة الطرفية، قم بتنزيل الإصدار 2.8.1 من مجموعة أدوات SRA باستخدام Wget، ثم قم بإنهاء تثبيت البرنامج. ابحث NCBI عن رقم الانضمام SRA للعينات المطلوبة، ثم الحصول على بيانات تسلسل RNA في إطار المحطة الطرفية. الحصول على ملفين FASTQ لنوع الملفات المقترنة نهاية.العثور على الجينوم المرجعي على الانترنت إذا كان أحد موجود. للحصول على تجميع مرجع اكتب wget في إطار المحطة الطرفية ثم لصق عنوان الارتباط. إذا كان متوفرا، أيضا نسخ ملف GTF والبروتين FASTA ملف للجينوم المرجعي.فهرسة الجينوم، ثم خريطة يقرأ وحساب التعبير لكل عينة. إعادة تسمية ملف النتائج إلى شيء وصفي، وإنشاء مصفوفة من جميع التهم. افتح نافذة متصفح الإنترنت واذهب إلى NCBI GenBank.في شريط البحث، اكتب اسم جين الاهتمام واسم الأنواع ذات الصلة الوثيقة التي تم تسلسلها. على يسار شريط البحث، حدد Protein ( Protein)، ثم انقر فوق بحث. استخراج التسلسلات بالنقر فوق إرسال إلى ثم حدد ملف.ضمن تنسيق ، حدد FASTA، ثم انقر فوق إنشاء ملف. نقل FASTA ملف من المتجانسات إلى كتلة الكمبيوتر باستخدام إطار محطة طرفية محلية أو FileZilla. بعد ذلك ، ابحث عن الجينات المرشحة باستخدام BLAST + على مجموعة الكمبيوتر ، قم بإجراء قاعدة بيانات BLAST من الجينوم أو البروتين المترجم بالنص ، FASTA.BLAST تسلسل الجينات متجانسة من NCBI إلى قاعدة بيانات الأنواع ذات الاهتمام، ثم عرض ملف الإخراج باستخدام الأمر أكثر من ذلك. نسخ معرفات جينية فريدة من نوع الاهتمام إلى ملف نصي جديد. استخراج تسلسل الجينات المرشحة.لتأكيد التعليقات التوضيحية الجينية باستخدام التبادل BLAST، انتقل إلى أداة البحث عن المحاذاة المحلية BLAST، وحدد BLASTP، ثم الصق تسلسلات المرشح، وحدد قاعدة بيانات تسلسل البروتين غير المتكررة، وانقر فوق BLAST. فتح MEGA، انقر على محاذاة، ثم تحرير بناء المحاذاة، حدد إنشاء محاذاة جديدة، وانقر فوق موافق. حدد البروتين. عند فتح نافذة المحاذاة، انقر على تحرير.انقر فوق إدراج تسلسلات من ملف، وحدد FASTA مع تسلسل البروتين من الجينات المرشحة والمتجانسات المحتملة. حدد كافة التسلسلات. العثور على رمز الذراع وتحوم فوقه.وينبغي أن أقول تسلسل محاذاة باستخدام خوارزمية العضلات. انقر فوق رمز الذراع، ثم انقر فوق محاذاة البروتين لمحاذاة تسلسل تحرير المعلمات أو انقر فوق موافق لاستخدام المعلمات الافتراضية. تم تطبيق هذا البروتوكول على أنسجة هيدرا فولغاريس وهو اللافقاريات المياه العذبة التي تنتمي إلى Cnidaria فيلوم.تم التحقيق في جينات أوبسين للحصول على نظرة ثاقبة في تطور العينين والكشف عن الضوء في الحيوانات. تم استخراج تسلسل الجينات المرتبطة opsin من H.vulgaris والأنواع الأخرى في ملف FASTA من بنك NCBI GenBank. تم محاذاة جينات الأوبسين في MEGA ، مما يجعل من الممكن تحديد هيدرا أوبسين التي كانت تفتقد حمض أميني محفوظ لليسين ضروري لربط جزيء حساس للضوء.تم إنشاء شجرة أقصى احتمال باستخدام تسلسل opsin من هيدرا vulgaris والأنواع الأخرى. يشير الفيلوجيني إلى أن جينات الأوبسين تتطور من خلال الازدواجية الخاصة بالنسب في cnidarians ، وربما عن طريق الازدواجية جنبا إلى جنب في H.vulgaris. بعد ذلك ، تم إجراء تحليل التعبير التفاضلي في edgeR للتحقيق في التعبير المطلق عن جينات الأوبسين.لتحديد ما إذا كان واحد أو أكثر من opsins هي ما يصل تنظيمها في hypostome ، أو الرأس ، ومقارنات الزوج الحكيم من hypostome مقابل عمود الجسم ، في مهدها المنطقة والقدم ، وأجريت مخالب. وتبين أن 774 1 نسخة تم التعبير عنها بشكل متفاوت بين الهيبوستوم وعمود الجسم. تم تحديد الجينات التي تم تنظيمها عبر مقارنات متعددة ، وتم إجراء إثراء وظيفي في Blast2GO.وأخيرا، تم التحقيق في التعبير المطلق عن جينات الأوبسين في أنسجة مختلفة خلال مراحل مختلفة من الناشئة، وخلال نقاط زمنية مختلفة من التجديد. الفحص البصري للمحاذاة والشجرة سيؤكد ما إذا كانت الجينات المرشحة تنتمي إلى عائلة الاهتمام. الجينات التي تختلف كثيرا في التسلسل أو مجموعة خارج كل شيء آخر، وربما هي جزء من عائلة الجينات المختلفة.يمكن اعتبار نتائج هذا البروتوكول مولدة للفرضية. يمكن لخط الأنابيب هذا تسليط الضوء على الجينات المرشحة للدراسة وظيفيا في الدراسات المستقبلية. بعد استكشاف تعبير هيدرا أوبسين، نستخدم الآن تقنيات مماثلة للتحقيق في الجينات ذات الصلة عبر الأنواع من أجل تحديد أوجه التشابه والاختلاف في الوظيفة.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

الجزيئية تطور Recombinase تري

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

التحضير لزراعة الخلايا المكونة للدم الابتدائية من نخاع عظام الفئران لElectroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

باستخدام الجينات Electroporation MXcell بولسير النظام لTransfect الخلايا الأولية ذات الكفاءة العالية

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

باستخدام خلية مكافحة الآلي لتبسيط دراسات التعبير الجيني : ضربة قاضية سيرنا من IL - 4 التعبير الجيني في الخلايا التابعة Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

البارافين ، جزءا لا يتجزأ من والمجمدة أقسام ذبابة الفاكهة</emالعضلات الكبار>

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

إعادة إعماره في المختبر من أحدث T. castaneum تيلوميراز

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

بروتوكول لبنية البروتين القائم على الحاسوب والتنبؤات وظيفة

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

قياس معدل الأيض في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; باستخدام قياس التنفس

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

والتجريبية وبروتوكول المعلوماتية الحيوية لتحليل-RNA وما يليها من دور التعرض للضوء الكمون في النمر الآسيوي البعوض،<em&gt; بحمى الضنك</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...