Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
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我们感谢阿德里亚娜·布里斯科、吉尔·史密斯、拉比·穆拉德和艾琳·兰赫尔在将其中一些步骤纳入我们的工作流程方面提供的建议和指导。我们也感谢凯瑟琳·威廉姆斯、伊丽莎白·雷博亚和娜塔莎·皮恰尼对手稿的评论。这项工作部分得到了乔治·休伊特医学研究基金会对A.M.M的支持。

该协议遵循加州大学欧文分校的动物护理指南。
1. RNA-塞克图书馆准备
<ol><li>使用以下方法分离RNA。<ol>
<li>收集样本。如果RNA要在以后提取，闪光冻结样品或放置在RNA存储解决方案15（材料表）。</li>
		<li>安乐死和解剖生物体，以分离感兴趣的组织。</li>
		<li>使用提取套件提取总RNA，使用RNA净化套件（材料表）净化RNA 注：有协议?...

本协议的目的是提供使用RNA-seq数据描述基因家族的步骤大纲。这些方法已被证明适用于各种物种和数据集4，34，35。这里建立的管道已经简化，应该很容易，随后是生物信息学的新手。该协议的意义在于，它概述了完成可发布分析的所有步骤和必要程序。协议中的一个关键步骤是正确组装全长成绩单，这来自高质量的基因组或...

测序技术的进步促进了非模型生物基因组和转录组的测序。除了从许多生物体中测序DNA和RNA的可行性增加外，还有大量数据可供公开研究感兴趣的基因。本议定书的目的是提供生物信息学步骤，以研究基因的分子进化和表达，这些基因可能在感兴趣的有机体中发挥重要作用。
研究基因或基因家族的进化可以深入了解生物系统的进化。基因家族的成员通常通过识别保存的图案或同源基因序列来确定。基因家族进化以前是利用来自遥远相关模型生物体1的基因组进行研究的。这种方法的一个局限性是，不清楚这些基因家族是如何在密切相关的物种中进化的，以及不同环境选择性压力的作用。在此协议中，我们包括在密切相关的物种中搜索同源物种。通过在植物水平上生成植物，我们可以注意到基因家族进化的趋势，如保存的基因或特定于血统的复制。在这个水平上，我们也可以调查基因是正石还是对等体。虽然许多同源可能彼此类似，但情况不一定如此。在这些研究中加入植物遗传树对于确定这些同源基因是否是正交者非常重要。在真核生物中，许多矫形器在细胞内保留着类似的功能，哺乳动物蛋白质恢复酵母组织细胞3的功能的能力就证明了这一点。然而，在某些情况下，非正直面基因具有特征功能4。
植物树开始描绘基因和物种之间的关系，但功能不能仅仅根据遗传关系来分配。基因表达研究与功能注释和富集分析相结合，为基因功能提供了强有力的支持。基因表达可以跨个体或组织类型进行量化和比较的案例可以更能说明潜在的功能。以下协议遵循的方法，用于研究在海德拉粗俗7的蛋白基因，但他们可以应用于任何物种和任何基因家族。这些研究的结果为进一步研究非模型生物的基因功能和基因网络奠定了基础。例如，对蛋白的植物学研究，这些蛋白是引发光转移级联的蛋白质，为眼睛和光检测的进化提供了背景。在这种情况下，非模型生物，特别是基础动物物种，如神经元或细胞，可以阐明保护或变化的光转移级联和视觉跨越包12，13，14。同样，确定其他基因家族的植物学、表达和网络将告诉我们适应背后的分子机制。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

蒸馏和报告大型数据集（如全基因组或转录组数据）往往是一项艰巨的任务。分解结果的一种方法是关注一个或多个对生物体和研究具有重要意义的基因家族。在此协议中，我们概述了生物信息学步骤，以生成植物学并量化感兴趣的基因表达。植物遗传树可以深入了解基因在物种内部和物种之间是如何进化的，并揭示正学。这些结果可以使用RNA-seq数据来比较这些基因在不同个体或组织中的表达。分子进化和表达的研究可以揭示物种间基因功能的进化和保存模式。基因家族的特征可以作为未来研究的跳板，并能在新的基因组或转录纸中突出一个重要的基因家族。

上述方法在 图1 中总结，并应用于 海德拉粗俗 组织的数据集。 H. 粗俗 是一种淡水无脊椎动物，属于植物 ， 其中也包括珊瑚、水母和海葵。 低俗者 可以通过萌芽无性繁殖，在被分割时可以再生头部和脚部。在这项研究中，我们旨在研究 海德拉7号中蛋白基因的进化和表达。虽然 海德拉 缺乏眼睛，他们表现出光依?...

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A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

本协议的目的是使用RNA测序数据调查候选基因的进化和表达。

使用RNA-seq研究分子进化和基因表达的生物信息学管道

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

该协议概述了研究候选基因的分子进化和表达的生物信息学步骤。在这里，我们提供详尽的说明，使任何具有最少生物信息学经验的人都能通过此协议运行。此管道可应用于任何生物体和任何基因家族。在做生物信息学时，一个常见的问题是外壳脚本失败。在尝试此协议时，请确保您拥有最新的软件、读取错误文件并仔细检查手册。首先，登录终端或 PuTTY 应用程序窗口上的计算机集群帐户。在终端上，使用 Wget 下载 SRA 工具包版本 2.8.1，然后完成程序安装。搜索NCBI的SRA加入号码以获取所需的样本，然后在终端窗口中获取RNA序列数据。获取两个 FASTQ 文件以供配对端文件类型。如果存在，请在线查找参考基因组。要获取参考组件，请在终端窗口中键入 wget，并粘贴链接地址。如果可用，也复制 GTF 文件和蛋白质 FASTA 文件作为参考基因组。索引基因组，然后映射每个样本的读取和计算表达。将结果文件重命名为具有描述性的东西，并生成所有计数的矩阵。打开互联网浏览器窗口，转到NCBI根银行。在搜索栏中，键入感兴趣的基因的名称和已测序的密切相关物种的名称。在搜索栏的左侧，选择蛋白质，然后单击"搜索"。通过单击"发送"提取序列，然后选择"文件"。在格式下，选择 FASTA，然后单击"创建文件"。使用本地终端窗口或文件Zilla将FASTA同名文件移动到计算机集群。接下来，使用 BLAST®在计算机群集上搜索候选基因，从基因组或转录蛋白 FASTA 中建立 BLAST 数据库。将NCBI的同源基因序列爆炸到感兴趣的物种数据库，然后使用命令查看输出文件。将感兴趣的物种中的独特基因 ID 复制到新的文本文件中。提取候选基因的序列。要使用互惠爆炸确认基因注释，请转到 BLAST 本地对齐搜索工具，选择 BLASTP，然后粘贴候选序列，选择非冗余蛋白质序列数据库，然后单击 BLAST。打开MEGA，单击"对齐"，然后编辑"构建对齐"，选择"创建新对齐"，然后单击"确定"。选择蛋白质。当对齐窗口打开时，单击"编辑"。单击"文件"中的插入序列，然后选择具有候选基因和可能同序的蛋白质序列的 FASTA。选择所有序列。找到手臂符号并悬停在它上。它应该说使用肌肉算法对齐序列。单击手臂符号，然后单击"对齐蛋白"以对齐"编辑参数的序列，或单击"确定"以使用默认参数。该协议适用于海德拉粗俗组织，这是一种淡水无脊椎动物，属于植物性神经质。对蛋白基因进行了研究，以深入了解动物眼睛和光线检测的演变。H.Vulgaris和其他物种与蛋白相关的基因序列从NCBI基因银行提取到FASTA文件中。蛋白蛋白基因在MEGA中对齐，使得识别海德拉蛋白成为可能，因为海德拉蛋白缺少结合光敏分子所需的保存的氨基酸。使用来自海德拉粗俗和其他物种的蛋白序列生成了最大可能性树。植物学表明，蛋白基因正在通过神经质的血统特异性复制和H.Vulgaris的串联复制而进化。接下来，在边缘R中进行微分表达分析，以研究蛋白基因的绝对表达。为了确定一个或多个操作素是在下位或头部中向上调节的，对下体与身体柱、萌芽区、脚和触角进行了对比。结果发现，在下层和身体列之间有1774个成绩单的分化表达。在多次比较中被加强调节的基因被确定，并在 Blast2GO 中进行了功能丰富。最后，在不同的萌芽阶段和再生的不同时间点，在不同的组织中研究了蛋白基因的绝对表达。对对齐和树的视觉检查将确认候选基因是否属于利益家族。序列上太不同的基因或其他一切之外的一组基因可能是不同基因家族的一部分。此协议的结果可视为产生假设的结果。这条管道可以突出候选基因，在未来的研究中功能研究。在探索海德拉蛋白表达后，我们现在使用类似的技术来研究不同物种的相关基因，以确定功能的异性和差异。

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