Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Vi takker Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad og Aline G. Rangel for råd og vejledning i at indarbejde nogle af disse trin i vores arbejdsgang. Vi er også taknemmelige for Katherine Williams, Elisabeth Rebboah og Natasha Picciani for kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev delvist støttet af en George E. Hewitt Foundation for Medical forskningsstipendium til A.M.M.

Denne protokol følger UC Irvine dyrepleje retningslinjer.
1. RNA-seq bibliotek forberedelse
<ol><li>Isoler RNA ved hjælp af følgende metoder.<ol>
<li>Indsamle prøver. Hvis RNA skal udvindes på et senere tidspunkt, skal prøven eller anbringes i RNA-opbevaringsopløsning15 (Materialetabel).</li>
		<li>Aflive og dissekere organismen til separate væv af interesse.</li>
		<li>Ekstrakter det samlede RNA ved hjælp af et ekstraktionssæt, og purer RNA...

Formålet med denne protokol er at give en oversigt over trinene til at karakterisere en genfamilie ved hjælp af RNA-seq-data. Disse metoder har vist sig at virke for en række arter og datasæt4,34,35. Den rørledning, der er etableret her, er blevet forenklet og bør være let nok til at blive efterfulgt af en nybegynder inden for bioinformatik. Betydningen af protokollen er, at den skitserer alle trin og nødvendige programm...

Fremskridt inden for sekventeringsteknologier har lettet rækkefølgen af genomer og transskriptioner af ikke-modelorganismer. Ud over den øgede gennemførlighed af sekventering af DNA og RNA fra mange organismer er en overflod af data offentligt tilgængelig til undersøgelse af gener af interesse. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe bioinformatiske trin til at undersøge den molekylære udvikling og ekspression af gener, der kan spille en vigtig rolle i den pågældende organisme.
Undersøgelse af udviklingen af et gen eller gen familie kan give indsigt i udviklingen af biologiske systemer. Medlemmer af en genfamilie bestemmes typisk ved at identificere bevarede motiver eller homologe gensekvenser. Genfamiliens udvikling blev tidligere undersøgt ved hjælp af genomer fra fjernt beslægtede modelorganismer1. En begrænsning af denne tilgang er, at det ikke er klart, hvordan disse genfamilier udvikler sig i nært beslægtede arter og den rolle, som forskellige miljømæssige selektive pres. I denne protokol inkluderer vi en søgning efter homologer i nært beslægtede arter. Ved at generere en fylogeni på et phylum-niveau kan vi bemærke tendenser i genfamiliens udvikling, såsom konserverede gener eller afstamningsspecifikke dobbeltarbejde. På dette niveau kan vi også undersøge, om gener er orthologs eller paraloger. Mens mange homologer sandsynligvis fungerer på samme måde som hinanden, er det ikke nødvendigvis tilfældet2. Indarbejde fylogenetiske træer i disse undersøgelser er vigtigt at afgøre, om disse homologe gener er orthologs eller ej. I eukaryoter bevarer mange orthologer lignende funktioner i cellen som det fremgår af pattedyrproteinernes evne til at genoprette funktionen af gær orthologs3. Der er dog tilfælde, hvor et ikke-ortologt gen udfører en karakteriseret funktion4.
Fylogenetiske træer begynder at afgrænse forholdet mellem gener og arter, men funktion kan ikke tildeles udelukkende baseret på genetiske relationer. Genekspressionsundersøgelser kombineret med funktionelle anmærkninger og berigelsesanalyse giver stærk støtte til genfunktion. Tilfælde, hvor genekspression kan kvantificeres og sammenlignes på tværs af enkeltpersoner eller vævstyper, kan være mere sigende for potentiel funktion. Følgende protokol følger metoder, der anvendes til at undersøge opsin gener i Hydra vulgaris7, men de kan anvendes på enhver art og enhver genfamilie. Resultaterne af sådanne undersøgelser danner grundlag for yderligere undersøgelser af genfunktion og gennetværk i organismer uden model. Som et eksempel giver undersøgelsen af opsins fylogeni, som er proteiner, der indleder fototransduktionskaskaden, kontekst til udviklingen af øjne og lysdetektion8,9,10,11. I dette tilfælde kan ikke-model organismer især basale dyrearter som cnidarians eller ctenophores belyse bevarelse eller ændringer i phototransduktion kaskade og vision på tværs af clades12,13,14. På samme måde vil fastsættelsen af fylogeni, udtryk og netværk af andre genfamilier informere os om de molekylære mekanismer, der ligger til grund for tilpasninger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Destillering og rapportering af store datasæt, såsom hele genom- eller transskriptionsdata, er ofte en skræmmende opgave. En måde at nedbryde resultater er at fokusere på en eller flere genfamilier, der er vigtige for organismen og undersøgelsen. I denne protokol skitserer vi bioinformatiske trin til at generere en fylogeni og kvantificere ekspressionen af gener af interesse. Fylogenetiske træer kan give indsigt i, hvordan gener udvikler sig inden for og mellem arter samt afsløre orthology. Disse resultater kan forbedres ved hjælp af RNA-seq data til at sammenligne udtrykket af disse gener i forskellige individer eller væv. Undersøgelser af molekylær evolution og udtryk kan afsløre former for evolution og bevarelse af genfunktion mellem arter. Karakteriseringen af en genfamilie kan tjene som springbræt til fremtidige undersøgelser og kan fremhæve en vigtig genfamilie i et nyt genom eller transskriberingspapir.

Ovennævnte metoder er sammenfattet i figur 1 og blev anvendt på et datasæt af Hydra vulgaris-væv. H. vulgaris er et ferskvands hvirvelløse dyr, der tilhører phylum Cnidaria, som også omfatter koraller, vandmænd og havanemoner. H. vulgaris kan reproducere a seksuelt ved spirende, og de kan regenerere deres hoved og fod, når gennemskåret. I denne undersøgelse sigtede vi mod at undersøge udviklingen og ekspressionen af opsingener i Hydra<...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Formålet med denne protokol er at undersøge udviklingen og ekspressionen af kandidatgener ved hjælp af RNA-sekventeringsdata.

En bioinformatikrørledning til undersøgelse af molekylær udvikling og genekspression ved hjælp af RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Denne protokol skitserer bioinformatiske trin til undersøgelse af den molekylære udvikling og udtryk for kandidatgener. Her giver vi grundige instruktioner, så alle med minimal bioinformatik erfaring kan køre gennem denne protokol. Denne rørledning kan anvendes på enhver organisme og enhver genfamilie.Et almindeligt problem, når du laver bioinformatik, er, at shellscripts svigter. Når du forsøger denne protokol, skal du sørge for, at du har den nyeste software, læse fejlfilerne og kontrollere manualen omhyggeligt. Du kan begynde med at logge på computerklyngekontoen i et terminal- eller PuTTY-programvindue.På terminalen skal du downloade SRA Toolkit version 2.8.1 ved hjælp af Wget og derefter afslutte installationen af programmet. Søg NCBI efter SRA-tiltrædelsesnummeret for de ønskede prøver, og hent derefter RNA-sekvensdataene i terminalvinduet. Hent to FASTQ-filer til typen af parrede filer.Find referencegenomet online, hvis der findes et. Hvis du vil hente en referenceassembly, skal du skrive wget i terminalvinduet og indsætte linkadressen. Hvis den er tilgængelig, skal du også kopiere GTF-filen og protein FASTA-filen til referencegenomet.Indekser genomet, og tilknyt derefter et udtryk for hver prøve. Omdøb resultatfilen til noget beskrivende, og opret en matrix over alle optællinger. Åbn et internetbrowservindue, og gå til NCBI GenBank.Skriv navnet på det interessegen og navnet på nært beslægtede arter, der er blevet sekventeret, i søgefeltet. Vælg Protein til venstre for søgefeltet, og klik derefter på Søg. Udtræk sekvenserne ved at klikke på Send til, og vælg derefter Filer.Vælg FASTA under Formatér, og klik derefter på Opret fil. Flyt FASTA-filen med homologer til computerklyngen ved hjælp af et lokalt terminalvindue eller FileZilla. Søg derefter efter kandidatgener ved hjælp af BLAST+På computerklyngen skal du oprette en BLAST-database fra genomet eller transskriptionsoversat protein, FASTA.BLAST de homologe gensekvenser fra NCBI til databasen over de pågældende arter, og se derefter outputfilen ved hjælp af kommandoen mere. Kopier entydige gen-id'er fra de arter, der er af interesse, til en ny tekstfil. Uddrag sekvenserne af kandidatgener.Hvis du vil bekræfte genanmærkning ved hjælp af Gensidig BLAST, skal du gå til blast-søgeværktøjet for lokal justering, vælge BLASTP, derefter indsætte kandidatsekvenserne, vælge den ikke-redundante proteinsekvensdatabase og klikke på BLAST. Åbn MEGA, klik på Juster, rediger derefter Opret justering, vælg Opret en ny justering, og klik på OK. Vælg Protein. Klik på Rediger, når vinduet Justering åbnes.Klik på Indsæt sekvenser fra fil, og vælg FASTA med proteinsekvenser af kandidatgener og sandsynlige homologer. Vælg Alle sekvenser. Find armsymbolet og hold markøren over det.Det skal sige justere sekvenser ved hjælp af muskel algoritme. Klik på armsymbolet, og klik derefter på Juster protein for at justere sekvenserne Rediger parametre, eller klik på OK for at bruge standardparametre. Denne protokol blev anvendt på væv af Hydra vulgaris, som er et ferskvands hvirvelløse dyr, der tilhører phylum Cnidaria.Opsin gener blev undersøgt for at få indsigt i udviklingen af øjne og lysdetektion hos dyr. Sekvenser for opsin-relaterede gener af H.vulgaris og andre arter blev udvundet i en FASTA-fil fra NCBI GenBank. Opsin-generne blev justeret i MEGA, hvilket gjorde det muligt at identificere Hydra opsiner, der manglede en konserveret lysin aminosyre, der var nødvendig for at binde et lysfølsomt molekyle.Et maksimalt sandsynlighedstræ blev genereret ved hjælp af opsinsekvenser fra Hydra vulgaris og andre arter. Fylogenien antyder, at opsingener udvikler sig ved afstamningsspecifikke duplikationer i cnidarians og potentielt ved tandemduplikation i H.vulgaris. Dernæst blev der udført en differentialudtryksanalyse i edgeR for at undersøge absolut udtryk for opsingener.For at afgøre, om en eller flere opsiner er up-reguleret i hypostome, eller hoved, par-kloge sammenligninger af hypostome versus kroppen kolonne, spirende zone, fod og tentakler blev udført. Det blev konstateret, at 1.774 udskrifter blev differentieret udtrykt mellem hypostome og krop kolonne. De gener, der blev opreguleret på tværs af flere sammenligninger, blev bestemt, og en funktionel berigelse i Blast2GO blev udført.Endelig blev det absolutte udtryk for opsin gener undersøgt i forskellige væv i forskellige stadier af spirende, og i forskellige tidspunkter for regenerering. Visuel inspektion af tilpasningen og træet vil bekræfte, om kandidat gener tilhører familien af interesse. Gener, der er for forskellige i rækkefølge eller en gruppe uden for alt andet, er sandsynligvis en del af en anden genfamilie.Resultater fra denne protokol kan betragtes som hypotesegenererende. Denne pipeline kan fremhæve kandidatgener til at studere funktionelt i fremtidige undersøgelser. Efter at have udforsket Hydra opsin udtryk, bruger vi nu lignende teknikker til at undersøge relaterede gener på tværs af arter for at identificere ligheder og forskelle i funktion.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

En protokol for Computer-Based proteiners struktur og funktion Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse af Global RNA-syntese på enkelt celle niveau efter Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Måling af stofskifte i<em&gt; Drosophila</em&gt; Hjælp respirometri

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentel og Bioinformatik Protokol for RNA-seq Analyser af Fotoperiodisk diapause i den asiatiske Tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...