Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

We danken Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad en Aline G. Rangel voor advies en begeleiding bij het opnemen van enkele van deze stappen in onze workflow. We zijn ook Katherine Williams, Elisabeth Rebboah en Natasha Picciani dankbaar voor hun commentaar op het manuscript. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een George E. Hewitt Foundation for Medical research fellowship aan A.M.M.

Dit protocol volgt de richtlijnen voor dierverzorging van UC Irvine.
1. RNA-seq bibliotheekvoorbereiding
<ol><li>Isoleer RNA op de volgende manieren.<ol>
<li>Verzamel monsters. Als RNA op een later tijdstip moet worden geëxtraheerd, moet het monster in de flits worden gevriesdroogd of in RNA-opslagoplossing worden gebracht15 (Tabel met materialen).</li>
		<li>Euthanaseer en ontleed het organisme om weefsels van belang te scheiden.</li>
		<li>Extrahee...

Het doel van dit protocol is om een overzicht te geven van de stappen voor het karakteriseren van een genfamilie met behulp van RNA-seq-gegevens. Het is bewezen dat deze methoden werken voor verschillende soorten en datasets4,34,35. De hier opgerichte pijplijn is vereenvoudigd en moet gemakkelijk genoeg zijn om te worden gevolgd door een beginner in bioinformatica. Het belang van het protocol is dat het alle stappen en noodzakel...

Vooruitgang in sequencingtechnologieën heeft de sequencing van genomen en transcriptomen van niet-modelorganismen vergemakkelijkt. Naast de toegenomen haalbaarheid van het sequentiëren van DNA en RNA van veel organismen, is een overvloed aan gegevens openbaar beschikbaar om genen van belang te bestuderen. Het doel van dit protocol is om bio-informatische stappen te bieden om de moleculaire evolutie en expressie van genen te onderzoeken die een belangrijke rol kunnen spelen in het organisme van belang.
Het onderzoeken van de evolutie van een gen of genenfamilie kan inzicht geven in de evolutie van biologische systemen. Leden van een genfamilie worden meestal bepaald door het identificeren van geconserveerde motieven of homologe gensequenties. Genfamilie-evolutie werd eerder onderzocht met behulp van genomen van verre verwante modelorganismen1. Een beperking van deze benadering is dat het niet duidelijk is hoe deze genfamilies evolueren in nauw verwante soorten en de rol van verschillende selectieve omgevingsdruk. In dit protocol nemen we een zoektocht op naar homologen bij nauw verwante soorten. Door een fylogenie op fylumniveau te genereren, kunnen we trends in de evolutie van genfamilies opmerken, zoals die van geconserveerde genen of afstammingsspecifieke duplicaties. Op dit niveau kunnen we ook onderzoeken of genen orthesen of paralogen zijn. Hoewel veel homologen waarschijnlijk op dezelfde manier met elkaar functioneren, is dat niet noodzakelijk het geval2. Het opnemen van fylogenetische bomen in deze studies is belangrijk om op te lossen of deze homologe genen orthesen zijn of niet. Bij eukaryoten behouden veel ortheologen vergelijkbare functies in de cel, zoals blijkt uit het vermogen van zoogdiereiwitten om de functie van gistortheologen te herstellen3. Er zijn echter gevallen waarin een niet-orthologisch gen een gekarakteriseerde functie vervult4.
Fylogenetische bomen beginnen relaties tussen genen en soorten af te bakenen, maar de functie kan niet alleen worden toegewezen op basis van genetische relaties. Genexpressiestudies in combinatie met functionele annotaties en verrijkingsanalyse bieden een sterke ondersteuning voor de genfunctie. Gevallen waarin genexpressie kan worden gekwantificeerd en vergeleken tussen individuen of weefseltypen kunnen meer vertellen over de potentiële functie. Het volgende protocol volgt methoden die worden gebruikt bij het onderzoeken van opsinegenen in Hydra vulgaris7, maar ze kunnen worden toegepast op elke soort en elke genfamilie. De resultaten van dergelijke studies vormen een basis voor verder onderzoek naar genfunctie en gennetwerken in niet-modelorganismen. Het onderzoek naar de fylogenie van opsines, eiwitten die de fototransductiecascade initiëren, geeft bijvoorbeeld context aan de evolutie van ogen en lichtdetectie8,9,10,11. In dit geval kunnen niet-modelorganismen, met name basale diersoorten zoals cnidarianen of ctenoforen, de instandhouding of veranderingen in de fototransductiecascade en het gezichtsvermogen over de clades12,13,14verduidelijken . Evenzo zal het bepalen van de fylogenie, expressie en netwerken van andere genfamilies ons informeren over de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan aanpassingen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Het distilleren en rapporteren van grote datasets, zoals hele genoom- of transcriptoomgegevens, is vaak een ontmoedigende taak. Een manier om resultaten op te splitsen is door je te concentreren op een of meer genfamilies die belangrijk zijn voor het organisme en de studie. In dit protocol schetsen we bioinformatische stappen om een fylogenie te genereren en de expressie van interessegenen te kwantificeren. Fylogenetische bomen kunnen inzicht geven in hoe genen zich ontwikkelen binnen en tussen soorten en orthologie onthullen. Deze resultaten kunnen worden verbeterd met behulp van RNA-seq-gegevens om de expressie van deze genen in verschillende individuen of weefsels te vergelijken. Studies van moleculaire evolutie en expressie kunnen modi van evolutie en behoud van genfunctie tussen soorten onthullen. De karakterisering van een genfamilie kan dienen als springplank voor toekomstige studies en kan een belangrijke genfamilie benadrukken in een nieuw genoom of transcriptoompapier.

De bovenstaande methoden zijn samengevat in figuur 1 en werden toegepast op een dataset van Hydra vulgaris weefsels. H. vulgaris is een zoetwater ongewervelde die behoort tot de phylum Cnidaria die ook koralen, kwallen en zee-anemonen omvat. H. vulgaris kunnen zich aseksueel voortplanten door te ontluiken en ze kunnen hun hoofd en voet regenereren wanneer ze worden doorsneden. In deze studie wilden we de evolutie en expressie van opsinegenen in Hydra</...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Het doel van dit protocol is om de evolutie en expressie van kandidaatgenen te onderzoeken met behulp van RNA-sequencinggegevens.

Een bioinformaticapijplijn voor het onderzoeken van moleculaire evolutie en genexpressie met behulp van RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Dit protocol schetst bio-informatische stappen voor het onderzoeken van de moleculaire evolutie en expressie van kandidaatgenen. Hier geven we grondige instructies zodat iedereen met minimale bio-informatische ervaring dit protocol kan doorlopen. Deze pijpleiding kan worden toegepast op elk organisme en elke genfamilie.Een veelvoorkomend probleem bij het uitvoeren van bioinformatica is dat shellscripts mislukken. Wanneer u dit protocol probeert, moet u ervoor zorgen dat u de meest recente software hebt, lees de foutbestanden en controleer de handleiding zorgvuldig. Meld u om te beginnen aan bij het computerclusteraccount op een terminal of PuTTY-toepassingsvenster.Download op de terminal SRA Toolkit versie 2.8.1 met Wget en voltooi vervolgens de installatie van het programma. Zoek NCBI naar het SRA-toetredingsnummer voor de gewenste monsters en verkrijg vervolgens de RNA-sequentiegegevens in het terminalvenster. Verkrijg twee FASTQ-bestanden voor het type gekoppelde bestanden.Zoek het referentiegenoom online als er een bestaat. Als u een referentieassemblage wilt verkrijgen, typt u wget in het terminalvenster en plakt u het koppelingsadres. Kopieer indien beschikbaar ook het GTF-bestand en het proteïne FASTA-bestand voor het referentiegenoom.Indexeer het genoom, breng vervolgens de lees- en berekeningsexpressie voor elk monster in kaart. Wijzig de naam van het resultatenbestand in iets beschrijvend en genereer een matrix van alle tellingen. Open een internetbrowservenster en ga naar NCBI GenBank.Typ in de zoekbalk de naam van het interessegen en de naam van nauw verwante soorten die zijn gesequenced. Selecteer eiwit aan de linkerkant van de zoekbalk en klik vervolgens op Zoeken. Pak de reeksen uit door op Verzenden naar te klikken en selecteer Vervolgens Bestand.Selecteer FASTA onder Opmaak en klik vervolgens op Bestand maken. Verplaats FASTA-bestand met homologen naar het computercluster met behulp van een lokaal terminalvenster of FileZilla. Zoek vervolgens naar kandidaatgenen met BLAST+Maak op het computercluster een BLAST-database van het genoom of transcriptoomge translateeerde eiwit FASTA.BLAST de homologe gensequenties van NCBI naar de database van de soort van belang, bekijk vervolgens het uitvoerbestand met behulp van de opdracht meer. Kopieer unieke gen-ID's van de interessesoort naar een nieuw tekstbestand. Extraheer de sequenties van kandidaatgenen.Als u genannotatie wilt bevestigen met Behulp van Reciprocal BLAST, gaat u naar het BLAST Local Alignment Search Tool, selecteert u BLASTP, plakt u de kandidaatsequenties, selecteert u de niet-redundante eiwitsequentiedatabase en klikt u op BLAST. Open MEGA, klik op Uitlijnen, bewerk vervolgens Build Alignment, selecteer Een nieuwe uitlijning maken en klik op OK. Selecteer Eiwit. Wanneer het venster Uitlijning wordt geopend, klikt u op Bewerken.Klik op Sequenties invoegen uit bestand en selecteer de FASTA met eiwitsequenties van kandidaatgenen en waarschijnlijke homologen. Selecteer Alle reeksen. Zoek het armsymbool en beweeg er overheen.Het zou moeten zeggen uitlijnen sequenties met behulp van spieralgoritme. Klik op het armsymbool en klik vervolgens op Eiwit uitlijnen om de sequenties uit te lijnen Parameters bewerken of klik op OK om standaardparameters te gebruiken. Dit protocol werd toegepast op weefsels van Hydra vulgaris, een zoetwater ongewerveld die behoort tot de fylum Cnidaria.Opsin genen werden onderzocht om inzicht te krijgen in de evolutie van ogen en lichtdetectie bij dieren. Sequenties voor opsin-gerelateerde genen van H.vulgaris en andere soorten werden geëxtraheerd in een FASTA-bestand van de NCBI GenBank. De opsinegenen werden uitgelijnd in MEGA, waardoor het mogelijk was om Hydra-opsines te identificeren die een geconserveerd lysine-aminozuur misten dat nodig was om een lichtgevoelig molecuul te binden.Een boom met maximale waarschijnlijkheid werd gegenereerd met behulp van opsin-sequenties van Hydra vulgaris en andere soorten. De fylogenie suggereert dat opsinegenen evolueren door afstammingsspecifieke duplicaties bij cnidarianen, en mogelijk door tandemduplicatie in H.vulgaris. Vervolgens werd een differentiële expressieanalyse uitgevoerd in edgeR om de absolute expressie van opsinegenen te onderzoeken.Om te bepalen of een of meer opsinen up-gereguleerd zijn in het hypostoom, of hoofd, werden paarsgewijs vergelijkingen van hypostoom versus de lichaamskolom, ontluikende zone, voet en tentakels uitgevoerd. Er werd vastgesteld dat 1.774 transcripties verschillend werden uitgedrukt tussen het hypostoom en de lichaamskolom. De genen die in meerdere vergelijkingen up-gereguleerd waren, werden bepaald en er werd een functionele verrijking in Blast2GO uitgevoerd.Ten slotte werd de absolute expressie van opsingenen onderzocht in verschillende weefsels tijdens verschillende stadia van ontluiken en tijdens verschillende tijdspunten van regeneratie. Visuele inspectie van de uitlijning en boom zal bevestigen of kandidaatgenen tot de familie van belang behoren. Genen die te verschillend zijn in volgorde of een groep buiten al het andere, maken waarschijnlijk deel uit van een andere genenfamilie.Resultaten van dit protocol kunnen worden beschouwd als hypothesegenererend. Deze pijplijn kan kandidaatgenen markeren om functioneel te bestuderen in toekomstige studies. Na het verkennen van Hydra opsin expressie, gebruiken we nu vergelijkbare technieken om gerelateerde genen tussen soorten te onderzoeken om overeenkomsten en verschillen in functie te identificeren.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Moleculaire evolutie van de Tre recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Een protocol voor Computer-Based Protein Structure en functie Voorspelling

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Meting van Metabolic Rate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gebruik respirometrietest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Een experimentele en Bioinformatica Protocol voor RNA-seq Analyses van Fotoperiodische diapause in de Aziatische tijgermug,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...