Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Nous remercions Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad et Aline G. Rangel pour leurs conseils et leurs conseils dans l’intégration de certaines de ces étapes dans notre flux de travail. Nous sommes également reconnaissants à Katherine Williams, Elisabeth Rebboah et Natasha Picciani pour leurs commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été soutenu en partie par une bourse de recherche médicale de la Fondation George E. Hewitt à A.M.M.

Ce protocole suit les directives de soins aux animaux de l’UC Irvine.
1. Préparation de la bibliothèque RNA-seq
<ol><li>Isolez l’ARN à l’aide des méthodes suivantes.<ol>
<li>Prélever des échantillons. Si l’ARN doit être extrait ultérieurement, congeler instantanément l’échantillon ou le placer dans une solution de stockage d’ARN15 (Table des matériaux).</li>
		<li>Euthanasier et disséquer l’organisme pour séparer les tissus ...

Le but de ce protocole est de fournir un aperçu des étapes pour caractériser une famille de gènes en utilisant des données RNA-seq. Il a été prouvé que ces méthodes fonctionnent pour une variété d’espèces et d’ensembles de données4,34,35. Le pipeline établi ici a été simplifié et devrait être assez facile à suivre par un novice en bioinformatique. L’importance du protocole est qu’il décrit toutes les ...

Les progrès des technologies de séquençage ont facilité le séquençage des génomes et des transcriptomes d’organismes non modèles. En plus de la faisabilité accrue du séquençage de l’ADN et de l’ARN de nombreux organismes, une abondance de données est accessible au public pour étudier les gènes d’intérêt. Le but de ce protocole est de fournir des étapes bioinformatiques pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression des gènes qui peuvent jouer un rôle important dans l’organisme d’intérêt.
L’étude de l’évolution d’un gène ou d’une famille de gènes peut donner un aperçu de l’évolution des systèmes biologiques. Les membres d’une famille de gènes sont généralement déterminés en identifiant des motifs conservés ou des séquences de gènes homologues. L’évolution de la famille de gènes a été précédemment étudiée à l’aide de génomes provenant d’organismes modèles lointainement apparentés1. Une limite à cette approche est qu’il n’est pas clair comment ces familles de gènes évoluent chez des espèces étroitement apparentées et le rôle des différentes pressions sélectives environnementales. Dans ce protocole, nous incluons une recherche d’homologues chez des espèces étroitement apparentées. En générant une phylogénie au niveau de l’embranchement, nous pouvons noter des tendances dans l’évolution de la famille de gènes tels que celle des gènes conservés ou des duplications spécifiques à la lignée. À ce niveau, nous pouvons également étudier si les gènes sont des orthologues ou des paralogues. Bien que de nombreux homologues fonctionnent probablement de manière similaire les uns aux autres, ce n’est pas nécessairement le cas2. L’incorporation d’arbres phylogénétiques dans ces études est importante pour déterminer si ces gènes homologues sont des orthologues ou non. Chez les eucaryotes, de nombreux orthologues conservent des fonctions similaires au sein de la cellule, comme en témoigne la capacité des protéines de mammifères à restaurer la fonction des orthologues de levure3. Cependant, il existe des cas où un gène non orthologue effectue une fonction caractérisée4.
Les arbres phylogénétiques commencent à délimiter les relations entre les gènes et les espèces, mais la fonction ne peut pas être attribuée uniquement en fonction des relations génétiques. Les études d’expression génique combinées aux annotations fonctionnelles et à l’analyse de l’enrichissement fournissent un solide soutien à la fonction des gènes. Les cas où l’expression des gènes peut être quantifiée et comparée entre les individus ou les types de tissus peuvent être plus révélateurs de la fonction potentielle. Le protocole suivant suit les méthodes utilisées dans l’étude des gènes de l’opsine dans Hydra vulgaris7, mais ils peuvent être appliqués à n’importe quelle espèce et n’importe quelle famille de gènes. Les résultats de ces études fournissent une base pour une étude plus approfondie de la fonction des gènes et des réseaux de gènes dans les organismes non modèles. A titre d’exemple, l’étude de la phylogénie des opsines, qui sont des protéines qui initient la cascade de phototransduction, donne un contexte à l’évolution de la détection des yeux et de la lumière8,9,10,11. Dans ce cas, des organismes non modèles en particulier des espèces animales basales telles que les cnidaires ou les cténophores peuvent élucider la conservation ou les changements dans la cascade de phototransduction et la vision à travers les clades12,13,14. De même, la détermination de la phylogénie, de l’expression et des réseaux d’autres familles de gènes nous renseignera sur les mécanismes moléculaires sous-jacents aux adaptations.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Distiller et signaler de grands ensembles de données, tels que des données sur le génome entier ou le transcriptome, est souvent une tâche ardue. Une façon de décomposer les résultats est de se concentrer sur une ou plusieurs familles de gènes qui sont importantes pour l’organisme et l’étude. Dans ce protocole, nous décrivons les étapes bioinformatiques pour générer une phylogénie et quantifier l’expression des gènes d’intérêt. Les arbres phylogénétiques peuvent donner un aperçu de l’évolution des gènes au sein des espèces et entre elles, ainsi que révéler l’orthologie. Ces résultats peuvent être améliorés en utilisant des données RNA-seq pour comparer l’expression de ces gènes dans différents individus ou tissus. Les études de l’évolution et de l’expression moléculaires peuvent révéler des modes d’évolution et de conservation de la fonction des gènes entre les espèces. La caractérisation d’une famille de gènes peut servir de tremplin pour de futures études et peut mettre en évidence une famille de gènes importante dans un nouveau génome ou un nouvel article de transcriptome.

Les méthodes ci-dessus sont résumées à la figure 1 et ont été appliquées à un ensemble de données de tissus vulgaris Hydra. H. vulgaris est un invertébré d’eau douce qui appartient à l’embranchement Cnidaria qui comprend également des coraux, des méduses et des anémones de mer. H. vulgaris peut se reproduire de manière asexuée par bourgeonnement et ils peuvent régénérer leur tête et leur pied lorsqu’ils sont coupés en deux. Dans...

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A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Le but de ce protocole est d’étudier l’évolution et l’expression des gènes candidats à l’aide de données de séquençage de l’ARN.

Un pipeline bioinformatique pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression génique à l’aide de l’ARN-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Ce protocole décrit les étapes bioinformatiques pour étudier l’évolution moléculaire et l’expression des gènes candidats. Ici, nous fournissons des instructions détaillées afin que toute personne ayant une expérience bioinformatique minimale puisse passer par ce protocole. Ce pipeline peut être appliqué à n’importe quel organisme et à n’importe quelle famille de gènes.Un problème courant lors de la bioinformatique est l’échec des scripts shell. Lorsque vous tentez ce protocole, assurez-vous de disposer du logiciel le plus à jour, lisez les fichiers d’erreur et consultez attentivement le manuel. Pour commencer, connectez-vous au compte de cluster d’ordinateurs sur un terminal ou une fenêtre d’application PuTTY.Sur le terminal, téléchargez SRA Toolkit version 2.8.1 à l’aide de Wget, puis terminez l’installation du programme. Recherchez dans NCBI le numéro d’accession SRA pour les échantillons souhaités, puis obtenez les données de séquence d’ARN dans la fenêtre terminale. Obtenez deux fichiers FASTQ pour le type de fichiers d’extrémité appariée.Trouvez le génome de référence en ligne s’il en existe un. Pour obtenir un assembly de référence, tapez wget dans la fenêtre du terminal et collez l’adresse du lien. Si disponible, copiez également le fichier GTF et le fichier FASTA des protéines pour le génome de référence.Indexez le génome, puis cartographiez les lectures et calculez l’expression pour chaque échantillon. Renommez le fichier de résultats en quelque chose de descriptif et générez une matrice de tous les nombres. Ouvrez une fenêtre de navigateur Internet et accédez à NCBI GenBank.Dans la barre de recherche, tapez le nom du gène d’intérêt et le nom des espèces étroitement apparentées qui ont été séquencées. À gauche de la barre de recherche, sélectionnez Protéine, puis cliquez sur Rechercher. Extrayez les séquences en cliquant sur Envoyer à, puis sélectionnez Fichier.Sous Format, sélectionnez FASTA, puis cliquez sur Créer un fichier. Déplacez le fichier FASTA d’homologues vers le cluster d’ordinateurs à l’aide d’une fenêtre de terminal local ou de FileZilla. Ensuite, recherchez des gènes candidats à l’aide de BLAST+Sur le cluster informatique, faites une base de données BLAST à partir du génome ou de la protéine traduite par transcriptome, FASTA.BLAST les séquences de gènes homologues de NCBI à la base de données de l’espèce d’intérêt, puis afficher le fichier de sortie à l’aide de la commande plus. Copiez les ID de gènes uniques de l’espèce d’intérêt dans un nouveau fichier texte. Extraire les séquences des gènes candidats.Pour confirmer l’annotation des gènes à l’aide de BLAST réciproque, accédez à l’outil de recherche d’alignement local BLAST, sélectionnez BLASTP, puis collez les séquences candidates, sélectionnez la base de données des séquences de protéines non redondantes, puis cliquez sur BLAST. Ouvrez MEGA, cliquez sur Aligner, puis modifier l’alignement de la build, sélectionnez Créer un nouvel alignement, puis cliquez sur OK. Sélectionnez Protéine. Lorsque la fenêtre Alignement s’ouvre, cliquez sur Modifier.Cliquez sur Insérer des séquences à partir du fichier et sélectionnez le FASTA avec des séquences protéiques de gènes candidats et d’homologues probables. Sélectionnez Toutes les séquences. Trouvez le symbole du bras et survolez-le.Il devrait dire aligner les séquences en utilisant l’algorithme musculaire. Cliquez sur le symbole de bras, puis cliquez sur Aligner la protéine pour aligner les séquences Modifier les paramètres ou cliquez sur OK pour utiliser les paramètres par défaut. Ce protocole a été appliqué aux tissus d’Hydra vulgaris qui est un invertébré d’eau douce qui appartient à l’embranchement Cnidaria.Les gènes de l’opsine ont été étudiés pour mieux comprendre l’évolution de la détection des yeux et de la lumière chez les animaux. Des séquences pour des gènes liés à l’opsine de H.vulgaris et d’autres espèces ont été extraites dans un fichier FASTA de la GenBank NCBI. Les gènes de l’opsine ont été alignés dans MEGA, ce qui a permis d’identifier les opsines Hydra qui manquaient un acide aminé conservé de lysine nécessaire pour lier une molécule sensible à la lumière.Un arbre à maximum de vraisemblance a été généré à l’aide de séquences d’opsine d’Hydra vulgaris et d’autres espèces. La phylogénie suggère que les gènes de l’opsine évoluent par duplications spécifiques à la lignée chez les cnidaires, et potentiellement par duplication en tandem chez H.vulgaris. Ensuite, une analyse d’expression différentielle a été réalisée dans edgeR pour étudier l’expression absolue des gènes de l’opsine.Pour déterminer si un ou plusieurs opsines sont up-réglés dans l’hypostome, ou la tête, des comparaisons paire-sages de hypostome contre la colonne de corps, la zone bourgeonnante, le pied, et les tentacules ont été exécutées. On l’a constaté que 1, 774 transcriptions ont été différentiellement exprimées entre le hypostome et la colonne de corps. Les gènes qui ont été régulés à la hausse à travers de multiples comparaisons ont été déterminés, et un enrichissement fonctionnel dans Blast2GO a été effectué.Enfin, l’expression absolue des gènes de l’opsine a été étudiée dans différents tissus au cours de différentes étapes du bourgeonnement et de différents points de régénération. L’inspection visuelle de l’alignement et de l’arbre confirmera si les gènes candidats appartiennent à la famille d’intérêt. Les gènes qui sont trop différents dans l’ordre ou un groupe en dehors de tout le reste, font probablement partie d’une famille de gènes différente.Les résultats de ce protocole peuvent être considérés comme générateurs d’hypothèses. Ce pipeline peut mettre en évidence des gènes candidats à étudier fonctionnellement dans de futures études. Après avoir exploré l’expression de l’opsine Hydra, nous utilisons maintenant des techniques similaires pour étudier les gènes apparentés entre les espèces afin d’identifier les similitudes et les différences de fonction.

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