Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
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Wir danken Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad und Aline G. Rangel für Rat und Anleitung bei der Integration einiger dieser Schritte in unseren Workflow. Wir danken auch Katherine Williams, Elisabeth Rebboah und Natasha Picciani für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde teilweise durch ein Forschungsstipendium der George E. Hewitt Foundation for Medical an A.M.M unterstützt.

Dieses Protokoll folgt den Tierpflegerichtlinien von UC Irvine.
1. RNA-seq-Bibliotheksvorbereitung
<ol><li>Isolieren Sie RNA mit den folgenden Methoden.<ol>
<li>Sammeln Sie Proben. Soll RNA zu einem späteren Zeitpunkt extrahiert werden, die Probe flash einfrieren oder in RNA-Speicherlösung15 ( Materialtabelle )legen.</li>
		<li>Euthanisieren und sezieren Sie den Organismus, um Gewebe von Interesse zu trennen.</li>
		<li>Extrahieren Sie die Gesamt-RN...

Der Zweck dieses Protokolls besteht darin, einen Überblick über die Schritte zur Charakterisierung einer Genfamilie unter Verwendung von RNA-seq-Daten zu geben. Diese Methoden haben sich für eine Vielzahl von Arten und Datensätzen4,34,35bewährt. Die hier etablierte Pipeline wurde vereinfacht und sollte einfach genug sein, um von einem Anfänger in der Bioinformatik verfolgt zu werden. Die Bedeutung des Protokolls besteht da...

Fortschritte in sequenzierenden Technologien haben die Sequenzierung von Genomen und Transkriptomen von Nicht-Modellorganismen erleichtert. Neben der erhöhten Machbarkeit der Sequenzierung von DNA und RNA aus vielen Organismen ist eine Fülle von Daten öffentlich verfügbar, um Gene von Interesse zu untersuchen. Der Zweck dieses Protokolls ist es, bioinformatische Schritte zur Untersuchung der molekularen Evolution und Expression von Genen bereitzustellen, die eine wichtige Rolle im interessierender Organismus spielen können.
Die Untersuchung der Evolution eines Gens oder einer Genfamilie kann Einblicke in die Evolution biologischer Systeme geben. Mitglieder einer Genfamilie werden typischerweise durch die Identifizierung konservatorischer Motive oder homologe Gensequenzen bestimmt. Die Evolution der Genfamilie wurde bisher mit Genomen von entfernt verwandten Modellorganismen untersucht1. Eine Einschränkung dieses Ansatzes besteht darin, dass nicht klar ist, wie sich diese Genfamilien in eng verwandten Arten entwickeln und welche Rolle unterschiedliche Umweltselektive Belastungen spielen. In dieses Protokoll schließen wir eine Suche nach Homologen in eng verwandten Arten ein. Durch die Erzeugung einer Phylogenie auf Stammebene können wir Trends in der Evolution der Genfamilie wie konservierte Gene oder linienspezifische Duplikationen feststellen. Auf dieser Ebene können wir auch untersuchen, ob Gene Orthologe oder Paraloge sind. Während viele Homologe wahrscheinlich ähnlich zueinander funktionieren, ist dies nicht unbedingt der Fall2. Die Einbeziehung phylogenetischer Bäume in diese Studien ist wichtig, um festzustellen, ob diese homologen Gene Orthologe sind oder nicht. In Eukaryoten behalten viele Orthologe ähnliche Funktionen innerhalb der Zelle, wie die Fähigkeit von Säugetierproteinen zeigt, die Funktion von Hefeorthologenwiederherzustellen 3. Es gibt jedoch Fälle, in denen ein nicht-orthologes Gen eine charakterisierte Funktion4ausführt.
Phylogenetische Bäume beginnen, Beziehungen zwischen Genen und Arten abzugrenzen, aber die Funktion kann nicht allein auf der Grundlage genetischer Beziehungen zugeordnet werden. Genexpressionsstudien in Kombination mit funktionellen Annotationen und Anreicherungsanalysen bieten eine starke Unterstützung für die Genfunktion. Fälle, in denen die Genexpression quantifiziert und über Individuen oder Gewebetypen hinweg verglichen werden kann, können mehr über die potenzielle Funktion aussagekräftig sein. Das folgende Protokoll folgt Methoden, die bei der Untersuchung von Opsin-Genen in Hydra vulgaris7verwendet werden, aber sie können auf jede Spezies und jede Genfamilie angewendet werden. Die Ergebnisse solcher Studien bilden die Grundlage für die weitere Untersuchung der Genfunktion und Gennetzwerke in Nicht-Modellorganismen. Als Beispiel gibt die Untersuchung der Phylogenie von Opsinen, die Proteine sind, die die Phototransduktionskaskade initiieren, Kontext zur Evolution der Augen und der Lichtdetektion8,9,10,11. In diesem Fall können Nicht-Modellorganismen, insbesondere basale Tierarten wie Nesseltiere oder Ctenophore, die Erhaltung oder Veränderungen der Phototransduktionskaskade und des Sehvermögens über die Kladen12,13,14aufklären. In ähnlicher Weise wird uns die Bestimmung der Phylogenie, Expression und Netzwerke anderer Genfamilien über die molekularen Mechanismen informieren, die Anpassungen zugrunde liegen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Das Destillieren und Melden großer Datensätze, wie z. B. das gesamte Genom oder Transkriptomdaten, ist oft eine entmutigende Aufgabe. Eine Möglichkeit, die Ergebnisse aufzuschlüsseln, besteht darin, sich auf eine oder mehrere Genfamilien zu konzentrieren, die für den Organismus und die Studie von Bedeutung sind. In diesem Protokoll skizzieren wir bioinformatische Schritte, um eine Phylogenie zu erzeugen und die Expression von Genen von Interesse zu quantifizieren. Phylogenetische Bäume können Aufschluss darüber geben, wie sich Gene innerhalb und zwischen Arten entwickeln, und die Orthologie offenbaren. Diese Ergebnisse können mit RNA-seq-Daten verbessert werden, um die Expression dieser Gene in verschiedenen Individuen oder Geweben zu vergleichen. Studien der molekularen Evolution und Expression können Modi der Evolution und Erhaltung der Genfunktion zwischen Arten aufdecken. Die Charakterisierung einer Genfamilie kann als Sprungbrett für zukünftige Studien dienen und eine wichtige Genfamilie in einem neuen Genom oder Transkriptom hervorheben.

Die oben genannten Methoden sind in Abbildung 1 zusammengefasst und wurden auf einen Datensatz von Hydra vulgaris Geweben angewendet. H. vulgaris ist ein wirbelloses Süßwasser, das zum Stamm Cnidaria gehört, zu dem auch Korallen, Quallen und Seeanämonen gehören. H. vulgaris kann sich asexuell vermehren, indem sie knospen und sie können ihren Kopf und Fuß regenerieren, wenn sie halbiert werden. In dieser Studie wollten wir die Evolution und Expressio...

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A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Der Zweck dieses Protokolls ist es, die Evolution und Expression von Kandidatengenen anhand von RNA-Sequenzierungsdaten zu untersuchen.

Eine Bioinformatik-Pipeline zur Untersuchung der molekularen Evolution und Genexpression mit RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Dieses Protokoll beschreibt bioinformatische Schritte zur Untersuchung der molekularen Evolution und Expression von Kandidatengenen. Hier bieten wir gründliche Anweisungen, damit jeder mit minimaler bioinformatischer Erfahrung dieses Protokoll durchlaufen kann. Diese Pipeline kann auf jeden Organismus und jede Genfamilie angewendet werden.Ein häufiges Problem bei der Bioinformatik ist das Versagen von Shell-Skripten. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, stellen Sie sicher, dass Sie über die aktuellste Software verfügen, lesen Sie die Fehlerdateien und lesen Sie das Handbuch sorgfältig. Melden Sie sich zunächst in einem Terminal oder PuTTY-Anwendungsfenster beim Computerclusterkonto an.Laden Sie auf dem Terminal SRA Toolkit Version 2.8.1 mit Wget herunter und beenden Sie dann die Installation des Programms. Durchsuchen Sie NCBI nach der SRA-Zugangsnummer für die gewünschten Proben und erhalten Sie dann die RNA-Sequenzdaten im Terminalfenster. Rufen Sie zwei FASTQ-Dateien für den Dateityp mit gepaartem Ende ab.Finden Sie das Referenzgenom online, falls vorhanden. Um eine Referenzassembly abzurufen, geben Sie wget in das Terminalfenster ein, und fügen Sie die Linkadresse ein. Falls verfügbar, kopieren Sie auch die GTF-Datei und die Protein-FASTA-Datei für das Referenzgenom.Indizieren Sie das Genom, dann kartenlesen und berechnen Sie die Expression für jede Probe. Benennen Sie die Ergebnisdatei in etwas Beschreibendes um und generieren Sie eine Matrix aller Zählungen. Öffnen Sie ein Internetbrowserfenster und gehen Sie zu NCBI GenBank.Geben Sie in der Suchleiste den Namen des interessierenden Gens und den Namen der eng verwandten Arten ein, die sequenziert wurden. Wählen Sie links neben der Suchleiste Protein aus, und klicken Sie dann auf Suchen. Extrahieren Sie die Sequenzen, indem Sie auf Senden an klicken, und wählen Sie dann Datei aus.Wählen Sie unter Format die Option FASTA aus, und klicken Sie dann auf Datei erstellen. Verschieben Sie die FASTA-Datei der Homologe über ein lokales Terminalfenster oder FileZilla in den Computercluster. Als nächstes suchen Sie mit BLAST+ nach Kandidatengenen Erstellen Sie auf dem Computercluster eine BLAST-Datenbank aus dem Genom oder dem transkriptomüberseten Protein FASTA.BLAST die homologen Gensequenzen von NCBI in die Datenbank der interessierenden Spezies und dann die Ausgabedatei mit dem Befehl mehr anzeigen. Kopieren Sie eindeutige Gen-IDs von der interessierenden Spezies in eine neue Textdatei. Extrahieren Sie die Sequenzen der Kandidatengene.Um die Genannotation mit Reciprocal BLAST zu bestätigen, gehen Sie zum BLAST Local Alignment Search Tool, wählen Sie BLASTP aus, fügen Sie dann die Kandidatensequenzen ein, wählen Sie die nicht redundante Proteinsequenzdatenbank aus und klicken Sie auf BLAST. Öffnen Sie MEGA, klicken Sie auf Ausrichten, dann auf Build-Ausrichtung bearbeiten, wählen Sie Neue Ausrichtung erstellen und klicken Sie auf OK. Wählen Sie Protein aus. Wenn das Fenster Ausrichtung geöffnet wird, klicken Sie auf Bearbeiten.Klicken Sie auf Sequenzen aus Datei einfügen und wählen Sie die FASTA mit Proteinsequenzen von Kandidatengenen und wahrscheinlichen Homologen aus. Wählen Sie Alle Sequenzen aus. Suchen Sie das Armsymbol und bewegen Sie den Mauszeiger darüber.Es sollte sagen, dass Sequenzen mit dem Muskelalgorithmus ausgerichtet werden. Klicken Sie auf das Armsymbol und dann auf Protein ausrichten, um die Sequenzen auszurichten Parameter bearbeiten, oder klicken Sie auf OK, um Standardparameter zu verwenden. Dieses Protokoll wurde auf Gewebe von Hydra vulgaris angewendet, einem wirbellosen Süßwassertiere, das zum Stamm Cnidaria gehört.Opsin-Gene wurden untersucht, um Einblicke in die Evolution der Augen und die Lichtdetektion bei Tieren zu erhalten. Sequenzen für Opsin-verwandte Gene von H.vulgaris und anderen Spezies wurden in eine FASTA-Datei aus der NCBI GenBank extrahiert. Die Opsin-Gene wurden in MEGA ausgerichtet, so dass es möglich war, Hydra-Opsine zu identifizieren, denen eine konservierte Lysin-Aminosäure fehlte, die notwendig war, um ein lichtempfindliches Molekül zu binden.Ein Maximum-Likelihood-Baum wurde mit Opsin-Sequenzen von Hydra vulgaris und anderen Arten generiert. Die Phylogenie legt nahe, dass sich Opsin-Gene durch linienspezifische Duplikationen bei Nesseltieren und möglicherweise durch Tandemduplikation bei H.vulgaris entwickeln. Als nächstes wurde eine differentielle Expressionsanalyse in edgeR durchgeführt, um die absolute Expression von Opsin-Genen zu untersuchen.Um festzustellen, ob ein oder mehrere Opsine im Hypostom oder Kopf hochreguliert sind, wurden paarweise Vergleiche von Hypostom mit der Körpersäule, der Knospenzone, dem Fuß und den Tentakeln durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass 1.774 Transkripte zwischen hypostom und Körpersäule unterschiedlich exprimiert wurden. Die Gene, die über mehrere Vergleiche hochreguliert wurden, wurden bestimmt und eine funktionelle Anreicherung in Blast2GO durchgeführt.Schließlich wurde die absolute Expression von Opsin-Genen in verschiedenen Geweben während verschiedener Stadien der Knospung und während verschiedener Zeitpunkte der Regeneration untersucht. Die visuelle Inspektion der Ausrichtung und des Baums wird bestätigen, ob kandidatengene zur interessierende Familie gehören. Gene, die in der Reihenfolge zu unterschiedlich sind oder eine Gruppe außerhalb von allem anderen, sind wahrscheinlich Teil einer anderen Genfamilie.Die Ergebnisse dieses Protokolls können als hypothesengenerierend angesehen werden. Diese Pipeline kann Kandidatengene hervorheben, die in zukünftigen Studien funktionell untersucht werden sollen. Nachdem wir die Hydra-Opsin-Expression untersucht haben, verwenden wir nun ähnliche Techniken, um verwandte Gene über Arten hinweg zu untersuchen, um Ähnlichkeiten und Funktionsunterschiede zu identifizieren.

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Biology

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