Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

אנו מודים לאדריאנה בריסקו, גיל סמית', רבי מוראד ואלין ג' ריינג'ל על ייעוץ והדרכה בשילוב חלק מהשלבים הללו בזרימת העבודה שלנו. אנו מודים גם לקתרין ויליאמס, אליזבת רבואה ונטשה פיצ'יאני על הערות על כתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן ג'ורג' א. יואיט למלגת מחקר רפואי ל- A.M.M.

פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים UC אירווין.
1. הכנת ספריית רנ"א-סק
<ol><li>בודד את ה- RNA באמצעות השיטות הבאות.<ol>
<li>לאסוף דגימות. אם RNA הוא להיות מופק במועד מאוחר יותר, פלאש להקפיא את המדגם או מקום בתמיסת אחסון RNA15 (שולחן החומרים).</li>
		<li>המתת חסד...

מטרת פרוטוקול זה היא לספק מתווה של השלבים לאפיון משפחת גנים באמצעות נתוני RNA-seq. שיטות אלה הוכחו לעבוד עבור מגוון רחב של מינים datasets4,34,35. הצינור שהוקם כאן כבר מפושט צריך להיות קל מספיק כדי להיות מלווה טירון בביואינפורמטיקה. משמעות הפרוטוקול...

ההתקדמות בטכנולוגיות הרצף אפשרה רצף של גנומים ותעתיקים של אורגניזמים שאינם מודלים. בנוסף להיתכנות המוגברת של רצף DNA ו- RNA מאורגניזמים רבים, שפע של נתונים זמין לציבור כדי לחקור גנים מעניינים. מטרת פרוטוקול זה היא לספק צעדים ביואינפורמטיים כדי לחקור את האבולוציה המולקולרית ואת הביטוי של גנים שעשויים לשחק תפקיד חשוב באורגניזם של עניין.
חקירת האבולוציה של גן או משפחת גנים יכולה לספק תובנה על האבולוציה של מערכות ביולוגיות. בני משפחת גנים נקבעים בדרך כלל על ידי זיהוי מוטיבים שמורים או רצפי גנים הומולוגיים. האבולוציה של משפחת הגנים נחקרה בעבר באמצעות גנומים מאורגניזמים מודלים הקשורים מרחוק1. מגבלה לגישה זו היא שלא ברור כיצד משפחות גנים אלה מתפתחות במינים קרובים ותפקידם של לחצים סלקטיביים סביבתיים שונים. בפרוטוקול זה, אנו כוללים חיפוש אחר הומולוגים במינים קרובים. על ידי יצירת פילוגנית ברמת פילום, אנו יכולים לציין מגמות באבולוציה של משפחת גנים כגון זו של גנים שמורים או כפילויות ספציפיות לשושלת. ברמה זו, אנו יכולים גם לחקור אם גנים הם אורתולוגים או paralogs. בעוד homologs רבים סביר לתפקד באופן דומה זה לזה, זה לא בהכרח המקרה2. שילוב עצים פילוגנטיים במחקרים אלה חשוב לפתור אם גנים הומולוגיים אלה הם אורתולוגים או לא. באיקריוטים, אורתולוגים רבים שומרים על תפקודים דומים בתוך התא כפי שמעידים היכולת של חלבוני יונקים לשחזר את תפקודם של אורתולוגים שמרים3. עם זאת, ישנם מקרים שבהם גן לא אורתולוגי מבצע פונקציה מאופיינת4.
עצים פילוגנטיים מתחילים לתוות יחסים בין גנים ומינים, אך לא ניתן להקצות את הפונקציה אך ורק על סמך יחסים גנטיים. מחקרי ביטוי גנים בשילוב עם ביאורים תפקודיים וניתוח העשרה מספקים תמיכה חזקה לתפקוד הגנים. מקרים שבהם ביטוי גנים ניתן לכמת ולהשוות בין אנשים או סוגי רקמות יכול להיות יותר לספר על תפקוד פוטנציאלי. הפרוטוקול הבא עוקב אחר שיטות המשמשות בחקירת גנים opsin ב הידרה וולגריס7, אבל הם יכולים להיות מיושמים על כל מין וכל משפחת גנים. התוצאות של מחקרים כאלה מספקות בסיס להמשך חקירה של תפקוד גנים ורשתות גנים באורגניזמים שאינם מודלים. כדוגמה, החקירה של פילוגנטיה של opsins, שהם חלבונים היוזמים את מפל phototransduction, נותן הקשר האבולוציה של העיניים וזיהוי אור8,9,10,11. במקרה זה, אורגניזמים שאינם מודל במיוחד מיני בעלי חיים בסיסיים כגון cnidarians או ctenophores יכול להבהיר שימור או שינויים מפל phototransduction וראייה על פני clades12,13,14. באופן דומה, קביעת הפילוגניות, הביטוי והרשתות של משפחות גנים אחרות תודיע לנו על המנגנונים המולקולריים שבבסיס ההתאמות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

זיקוק ודיווח על ערכות נתונים גדולות, כגון נתוני גנום שלם או תעתיק, הוא לעתים קרובות משימה מרתיעה. אחת הדרכים לפרק את התוצאות היא להתמקד במשפחות גנים אחת או יותר שהן משמעותיות לאורגניזם ולחימוד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים צעדים ביואינפורמטיים כדי ליצור פילוגנית ולכמת את הביטוי של גנים מעניינים. עצים פילוגנטיים יכולים לתת תובנה כיצד גנים מתפתחים בתוך ובין מינים, כמו גם לחשוף אורתולוגיה. תוצאות אלה ניתן לשפר באמצעות נתוני RNA-seq כדי להשוות את הביטוי של גנים אלה אצל אנשים שונים או רקמות. מחקרים על אבולוציה מולקולרית וביטוי יכולים לחשוף דרכי אבולוציה ושימור של תפקוד גנים בין מינים. אפיון משפחת גנים יכול לשמש כקרש קפיצה למחקרים עתידיים ויכול להדגיש משפחת גנים חשובה בנייר גנום או שעתוק חדש.

השיטות לעיל מסוכמות באיור 1 והוחלו על ערכת נתונים של רקמות הידרה וולגריס. H. vulgaris הוא חסר חוליות מים מתוקים השייך לפירום Cnidaria הכולל גם אלמוגים, מדוזות ושאינות ים. H. וולגריס יכול להתרבות באופן א-מיני על ידי ניצנים והם יכולים לחדש את הראש והרגל שלהם כאשר חצו?...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

מטרת פרוטוקול זה היא לחקור את האבולוציה והביטוי של גנים מועמדים באמצעות נתוני רצף RNA.

צינור ביואינפורמטיקה לחקירת אבולוציה מולקולרית וביטוי גנים באמצעות RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

פרוטוקול זה מתאר צעדים ביואינפורמטיים לחקירת האבולוציה המולקולרית והביטוי של גנים מועמדים. כאן אנו מספקים הוראות יסודיות כך שכל מי שיש לו ניסיון ביואינפורמטי מינימלי יכול לרוץ דרך פרוטוקול זה. צינור זה יכול להיות מיושם על כל אורגניזם וכל משפחת גנים.בעיה נפוצה אחת בעת ביצוע ביואינפורמטיקה היא סקריפטים מעטפת נכשל. בעת ניסיון לבצע פרוטוקול זה, ודא שותקת את התוכנה העדכנית ביותר, קרא את קבצי השגיאה ועיין במדריך בקפידה. כדי להתחיל, היכנס לחשבון אשכול המחשב בחלון מסוף או יישום PuTTY.על המסוף, להוריד SRA Toolkit גירסה 2.8.1 באמצעות Wget, ולאחר מכן לסיים את התקנת התוכנית. חפש ב- NCBI את מספר ההצטרפות של SRA עבור הדגימות הרצויות ולאחר מכן השג את נתוני רצף ה- RNA בחלון המסוף. השג שני קבצי FASTQ עבור סוג קבצים עם קצה משויך.מצא את גנום הייחוס באינטרנט אם קיים. כדי להשיג הרכבה של הפניה, הקלד wget בחלון המסוף והדבק את כתובת הקישור. אם זמין, גם להעתיק את קובץ GTF וקובץ FASTA חלבון עבור הגנום הפניה.צור אינדקס של הגנום ולאחר מכן מפה קוראת ומחשבת ביטוי עבור כל דגימה. שנה את שם קובץ התוצאות למשהו תיאורי וצור מטריצה של כל הספירות. פתח חלון דפדפן אינטרנט עבור אל NCBI GenBank.בסרגל החיפוש, הקלד את שם גן העניין ואת השם של מינים קרובים אשר כבר רצף. מימין ל סרגל החיפוש, בחר חלבון ולאחר מכן לחץ על חיפוש. חלץ את הרצפים על-ידי לחיצה על שלח אל ולאחר מכן בחר קובץ.תחת עיצוב, בחר FASTA ולאחר מכן לחץ על צור קובץ. העבר קובץ FASTA של הומולוגים לאשכול המחשבים באמצעות חלון מסוף מקומי או FileZilla. לאחר מכן, חפשו גנים מועמדים באמצעות BLAST+על אשכול המחשבים, צרו מסד נתונים של BLAST מהגנום או חלבון מתורגם לתעתיק, FASTA.הפיצוץ רצפי הגנים homologous מ NCBI למסד הנתונים של המינים של עניין, ולאחר מכן להציג את קובץ הפלט באמצעות הפקודה יותר. העתק מזהי גנים ייחודיים ממין מעניין לקובץ טקסט חדש. לחלץ את הרצפים של גנים מועמדים.כדי לאשר ביאור גנים באמצעות REciprocal BLAST, עבור אל כלי החיפוש של היישור המקומי BLAST, בחר BLASTP ולאחר מכן הדבק את רצפי המועמדים, בחר את מסד הנתונים הלא מיותר של רצף החלבונים ולחץ על BLAST. פתח את מגה, לחץ על ישר ולאחר מכן ערוך יישור בניה, בחר צור יישור חדש ולחץ על אישור. בחר חלבון. כאשר חלון היישור נפתח, לחץ על ערוך.לחץ על הוסף רצפים מקובץ ובחר את FASTA עם רצפי חלבונים של גנים מועמדים והומולוגים סבירים. בחר את כל הרצפים. מצא את סמל הזרוע ורחף מעליו.זה צריך לומר ליישר רצפים באמצעות אלגוריתם שריר. לחץ על סמל הזרוע ולאחר מכן לחץ על ישר חלבון כדי ליישר את הרצפים ערוך פרמטרים או לחץ על אישור כדי להשתמש בפרמטרי ברירת המחדל. פרוטוקול זה הוחל על רקמות של הידרה וולגריס שהיא חסרת חוליות במים מתוקים השייכת לפילום קנידריה.גנים Opsin נחקרו כדי לקבל תובנה האבולוציה של עיניים וגילוי אור בבעלי חיים. רצפים עבור גנים הקשורים opsin של H.vulgaris ומינים אחרים חולצו לתוך קובץ FASTA מן GenBank NCBI. הגנים opsin היו מיושרים מגה, מה שמאפשר לזהות opsins הידרה שהיו חסרים חומצת אמינו שימורי ליצין הדרושים כדי לקשור מולקולה רגישה לאור.עץ בעל סבירות גבוהה נוצר באמצעות רצפי אופסין מהידרה וולגריס ומינים אחרים. הפילוגניה מרמזת על כך שגנים של אופסין מתפתחים על ידי כפילויות ספציפיות לשושלת אצל קנידרים, ופוטנציאל על ידי כפילויות טנדם ב- H.vulgaris. לאחר מכן, ניתוח ביטוי דיפרנציאלי בוצע ב- edgeR כדי לחקור ביטוי מוחלט של גנים opsin.כדי לקבוע אם אופסינים אחד או יותר מוסדרים בהיפוסטום, או בראש, בוצעו השוואות מבחינת זוג של היפוסטום לעומת עמוד הגוף, אזור ניצנים, רגל וצרועות. נמצא כי 1,774 תעתיקים באו לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי בין ההיפוסטום לטור הגוף. הגנים שהיו מוסדרים על פני השוואות מרובות נקבעו, והעשרה תפקודית Blast2GO בוצעה.לבסוף, הביטוי המוחלט של גנים opsin נחקר ברקמות שונות בשלבים שונים של ניצנים, ובמהלך נקודות זמן שונות של התחדשות. בדיקה ויזואלית של היישור והעץ תאשר אם הגנים המועמדים שייכים למשפחת העניין. גנים שונים מדי ברצף או קבוצה מחוץ לכל דבר אחר, הם כנראה חלק ממשפחת גנים אחרת.תוצאות מפרוטוקול זה יכולות להיחשב כמחוללות השערות. צינור זה יכול להדגיש גנים מועמדים ללמוד פונקציונלית במחקרים עתידיים. לאחר חקירת ביטוי הידרה opsin, אנו משתמשים כעת בטכניקות דומות כדי לחקור גנים קשורים על פני מינים על מנת לזהות קווי דמיון והבדלים בתפקוד.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

אבולוציה מולקולרית של recombinase Tre

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

פרוטוקול מבנה מחשב מבוסס חלבון חיזוי פונקציה

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...