Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

हम एड्रियाना ब्रिस्को, गिल स्मिथ, रबी मुराद और एलिन जी रंगेल को हमारे कार्यप्रवाह में इनमें से कुछ चरणों को शामिल करने में सलाह और मार्गदर्शन के लिए धन्यवाद देते हैं । हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए कैथरीन विलियम्स, एलिसाबेथ रिब्बोह और नताशा पिक्सियानी के भी आभारी हैं । इस काम को ए.M.M के लिए मेडिकल रिसर्च फेलोशिप के लिए जॉर्ज ई. हेविट फाउंडेशन द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

यह प्रोटोकॉल यूसी इरविन एनिमल केयर गाइडलाइंस का पालन करता है ।
1. आरएनए-एसईक्यू पुस्तकालय की तैयारी
<ol><li>निम्नलिखित तरीकों का उपयोग करके आरएनए को अलग करें।<ol>
<li>नमूने एकत्र करें। यदि आरएनए को ब?...

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएनए-एसईक्यू डेटा का उपयोग करके जीन परिवार की विशेषता के लिए चरणों की रूपरेखा प्रदान करना है। ये विधियां विभिन्न प्रजातियों और डेटासेट 4 ,34,35के लिए क?...

अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों में प्रगति ने जीनोम और गैर-मॉडल जीवों के ट्रांसक्रिप्टोम के अनुक्रमण को सुगम बनाया है । कई जीवों से अनुक्रमण डीएनए और आरएनए की बढ़ी हुई व्यवहार्यता के अलावा, ब्याज के जीन का अध्ययन करने के लिए डेटा की बहुतायत सार्वजनिक रूप से उपलब्ध है । इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आणविक विकास और जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए जैव सूचनाबद्ध कदम प्रदान करना है जो ब्याज के जीव में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है।
एक जीन या जीन परिवार के विकास की जांच जैविक प्रणालियों के विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । एक जीन परिवार के सदस्यों को आम तौर पर संरक्षित रूपांकनों या अनुरूप जीन दृश्यों की पहचान करके निर्धारित कर रहे हैं । जीन परिवार विकास पहले दूर से संबंधित मॉडल जीवों से जीनोम का उपयोग कर जांच की थी1। इस दृष्टिकोण की एक सीमा यह है कि यह स्पष्ट नहीं है कि कैसे इन जीन परिवारों को बारीकी से संबंधित प्रजातियों में विकसित और विभिंन पर्यावरण चयनात्मक दबावों की भूमिका । इस प्रोटोकॉल में, हम बारीकी से संबंधित प्रजातियों में समरूपता के लिए एक खोज शामिल हैं। एक फिलम स्तर पर एक फिलोजेनी पैदा करके, हम जीन परिवार के विकास में प्रवृत्तियों जैसे संरक्षित जीन या वंश-विशिष्ट दोहराव के रूप में नोट कर सकते हैं । इस स्तर पर हम यह भी जांच कर सकते हैं कि जीन ऑर्थोलोग हैं या पैरालॉग। जबकि कई समरूपता की संभावना एक दूसरे के समान कार्य करते हैं, यह जरूरी नहीं कि मामला2है । इन अध्ययनों में फिलोजेनेटिक पेड़ों को शामिल करना यह हल करना महत्वपूर्ण है कि ये समरूप जीन ऑर्थोलोग हैं या नहीं । यूकेरियोट्स में, कई ऑर्थोलोग कोशिका के भीतर समान कार्यों को बनाए रखते हैं जैसा कि स्तनधारी प्रोटीन की क्षमता से खमीर ऑर्थोलॉग3के कार्य को बहाल करने के लिए है। हालांकि, ऐसे उदाहरण हैं जहां एक गैर-ऑर्थोलोलॉगस जीन एक विशेषता कार्य4को अंजाम देता है।
फिलोजेनेटिक पेड़ जीन और प्रजातियों के बीच संबंधों को चित्रित करना शुरू करते हैं, फिर भी कार्य को पूरी तरह से आनुवंशिक संबंधों के आधार पर नहीं सौंपा जा सकता है। कार्यात्मक एनोटेशन और संवर्धन विश्लेषण के साथ संयुक्त जीन अभिव्यक्ति अध्ययन जीन समारोह के लिए मजबूत समर्थन प्रदान करते हैं। ऐसे मामले जहां जीन अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित की जा सकती है और व्यक्तियों या ऊतक प्रकारों की तुलना में संभावित कार्य के बारे में अधिक बता सकते हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल हाइड्रा वल्गैरिस7में ऑप्सिन जीन की जांच में उपयोग किए जाने वाले तरीकों का पालन करता है, लेकिन उन्हें किसी भी प्रजाति और किसी भी जीन परिवार पर लागू किया जा सकता है। इस तरह के अध्ययनों के परिणाम गैर-मॉडल जीवों में जीन समारोह और जीन नेटवर्क की आगे की जांच के लिए एक आधार प्रदान करते हैं । एक उदाहरण के रूप में, ऑप्सिन के फिलोजेनी की जांच, जो प्रोटीन हैं जो फोटोट्रांसडक्शन झरना शुरू करते हैं, आंखों के विकास और प्रकाश का पता लगाने8,9,10, 11के संदर्भ देता है। इस मामले में, गैर-मॉडल जीव विशेष रूप से बेसल पशु प्रजातियां जैसे कि सिनेडियन या सीटीनोफोरस12, 13,14में संरक्षण या फोटोट्रांसडक्शन झरना और दृष्टि में परिवर्तन को स्पष्ट करसकतेहैं। इसी तरह, अन्य जीन परिवारों के फिलोजेनी, अभिव्यक्ति और नेटवर्क का निर्धारण हमें आणविक तंत्र अंतर्निहित रूपांतरों के बारे में सूचित करेगा ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

पूरे जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम डेटा जैसे बड़े डेटासेट को डिस्टिल करना और रिपोर्ट करना अक्सर एक चुनौतीपूर्ण काम होता है। परिणामों को तोड़ने का एक तरीका यह है कि एक या एक से अधिक जीन परिवारों पर ध्यान केंद्रित किया जाए जो जीव और अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एक फिलोजेनी उत्पन्न करने और ब्याज के जीन की अभिव्यक्ति की मात्रा निर्धारित करने के लिए जैव सूचनात्मक कदमों की रूपरेखा तैयार करते हैं। फिलोजेनेटिक पेड़ इस बारे में जानकारी दे सकते हैं कि जीन प्रजातियों के भीतर और बीच कैसे विकसित हो रहे हैं और साथ ही ऑर्थोलॉजी का पता चलता है। इन परिणामों को विभिन्न व्यक्तियों या ऊतकों में इन जीनों की अभिव्यक्ति की तुलना करने के लिए आरएनए-एसईक्यू डेटा का उपयोग करके बढ़ाया जा सकता है। आणविक विकास और अभिव्यक्ति के अध्ययन प्रजातियों के बीच विकास और जीन समारोह के संरक्षण के तरीकों को प्रकट कर सकते हैं। एक जीन परिवार के लक्षण वर्णन भविष्य के अध्ययन के लिए एक स्प्रिंगबोर्ड के रूप में सेवा कर सकते है और एक नए जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम कागज में एक महत्वपूर्ण जीन परिवार को उजागर कर सकते हैं ।

उपरोक्त विधियों को चित्र 1 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है और हाइड्रा वल्गैरिस ऊतकों के डेटा सेट पर लागू किया गया था। एच वल्गरिस एक ताजा पानी अकशेरुकी है जो फिलम सेनिडारिया स?...

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A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य आरएनए अनुक्रमण डेटा का उपयोग करके उम्मीदवार जीन के विकास और अभिव्यक्ति की जांच करना है।

आरएनए-एसईक्यू का उपयोग करके आणविक विकास और जीन अभिव्यक्ति की जांच के लिए एक बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइन

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

यह प्रोटोकॉल उम्मीदवार जीन के आणविक विकास और अभिव्यक्ति की जांच के लिए जैव सूचना के कदमों को रेखांकित करता है। यहां हम पूरी तरह से निर्देश प्रदान करते हैं ताकि न्यूनतम जैव सूचना अनुभव वाला कोई भी व्यक्ति इस प्रोटोकॉल के माध्यम से चल सके। यह पाइपलाइन किसी भी जीव और किसी भी जीन परिवार पर लगाई जा सकती है।बायोइन्फॉर्मेटिक्स करते समय एक आम मुद्दा शेल स्क्रिप्ट्स में असफल होना है। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, सुनिश्चित करें कि आपके पास सबसे अद्यतित सॉफ़्टवेयर है, त्रुटि फ़ाइलों को पढ़ें, और मैन्युअल को ध्यान से देखें। शुरू करने के लिए, एक टर्मिनल या PuTTY आवेदन खिड़की पर कंप्यूटर क्लस्टर खाते में लॉग इन करें ।टर्मिनल पर, Wget का उपयोग करके SRA टूलकिट संस्करण 2.8.1 डाउनलोड करें, फिर प्रोग्राम इंस्टॉल करना समाप्त करें। वांछित नमूनों के लिए एसआरए परिग्रहण संख्या के लिए एनसीबीआई खोजें, फिर टर्मिनल विंडो में आरएनए अनुक्रम डेटा प्राप्त करें। युग्मित-अंत फ़ाइलों के प्रकार के लिए दो FASTQ फ़ाइलें प्राप्त करें।संदर्भ जीनोम ऑनलाइन खोजें यदि कोई मौजूद है। संदर्भ असेंबली प्राप्त करने के लिए, टर्मिनल विंडो में wget टाइप करें, और लिंक पता चिपकाएं। यदि उपलब्ध है, तो संदर्भ जीनोम के लिए जीटीएफ फ़ाइल और प्रोटीन फास्टा फ़ाइल को भी कॉपी करें।जीनोम सूचकांक, तो नक्शा पढ़ता है और प्रत्येक नमूने के लिए अभिव्यक्ति की गणना । परिणाम फ़ाइल को कुछ वर्णनात्मक में बदलें, और सभी मामलों का मैट्रिक्स उत्पन्न करें। एक इंटरनेट ब्राउज़र विंडो खोलें और एनसीबीआई जेनबैंक में जाएं।सर्च बार में ब्याज के जीन का नाम और बारीकी से संबंधित प्रजातियों का नाम टाइप करें, जिनका अनुक्रम किया गया है । खोज बार के बाईं ओर, प्रोटीन का चयन करें, फिर खोज पर क्लिक करें। सेंड टू पर क्लिक करके दृश्यों को निकालें, और फिर फ़ाइल का चयन करें।फॉर्मेट के तहत, FASTA का चयन करें, फिर फ़ाइल बनाएं पर क्लिक करें। स्थानीय टर्मिनल विंडो या FileZilla का उपयोग करके होमोलॉग की फास्टा फ़ाइल को कंप्यूटर क्लस्टर में ले जाएं। इसके बाद, कंप्यूटर क्लस्टर पर ब्लास्ट + का उपयोग करके उम्मीदवार जीन की खोज करें, जीनोम या ट्रांसक्रिप्टोम-अनुवादित प्रोटीन, फास्टा से ब्लास्ट डेटाबेस बनाएं।ब्लास्ट एनसीबीआई से ब्याज की प्रजातियों के डेटाबेस के मुताबिक़ जीन दृश्यों को विस्फोट करें, फिर कमांड का अधिक उपयोग करके आउटपुट फ़ाइल देखें। ब्याज की प्रजातियों से एक नई पाठ फ़ाइल के लिए अद्वितीय जीन आईडी की प्रतिलिपि। उम्मीदवार जीन के दृश्यों को निकालें।पारस्परिक ब्लास्ट का उपयोग करके जीन एनोटेशन की पुष्टि करने के लिए, ब्लास्ट लोकल अलाइनमेंट सर्च टूल पर जाएं, ब्लास्ट का चयन करें, फिर उम्मीदवार दृश्यों को चिपकाएं, गैर-अनावश्यक प्रोटीन अनुक्रम डेटाबेस का चयन करें, और ब्लास्ट पर क्लिक करें। मेगा खोलें, संरेखित करने पर क्लिक करें, फिर बिल्ड अलाइनमेंट को संपादित करें, एक नया अलाइनमेंट बनाएं, और ओके पर क्लिक करें। प्रोटीन का चयन करें। जब संरेखण विंडो खुलती है, तो एडिट पर क्लिक करें।फ़ाइल से दृश्यों डालें क्लिक करें, और उम्मीदवार जीन और संभावित होमोलॉग के प्रोटीन दृश्यों के साथ FASTA का चयन करें । सभी दृश्यों का चयन करें। हाथ प्रतीक का पता लगाएं और उस पर मंडराना।यह मांसपेशियों एल्गोरिथ्म का उपयोग कर दृश्यों संरेखित करना चाहिए। आर्म सिंबल पर क्लिक करें, और फिर दृश्यों को संपादित करने के मापदंडों को संरेखित करने के लिए प्रोटीन को संरेखित करने या डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग करने के लिए ओके पर क्लिक करें। यह प्रोटोकॉल हाइड्रा वल्गरिस के ऊतकों पर लागू किया गया था जो एक मीठे पानी के अकशेरुकी है जो फिलम Cnidaria से संबंधित है।ऑप्सिन जीन की जांच की गई ताकि जानवरों में आंखों के विकास और प्रकाश का पता लगाने में अंतर्दृष्टि हासिल की जा सके । एच वल्गरिस और अन्य प्रजातियों के ऑप्सिन से संबंधित जीन के लिए दृश्यों को एनसीबीआई जेनबैंक से एक FASTA फ़ाइल में निकाला गया था । ऑप्सिन जीन मेगा में गठबंधन किया गया था, जिससे हाइड्रा ऑप्सिन की पहचान करना संभव हो गया था जो प्रकाश-संवेदनशील अणु को बांधने के लिए आवश्यक संरक्षित-lysine अमीनो एसिड याद कर रहे थे।हाइड्रा वल्गैरिस और अन्य प्रजातियों से ऑप्सिन दृश्यों का उपयोग करके एक अधिकतम संभावना पेड़ उत्पन्न किया गया था। फिलोजेनी से पता चलता है ऑप्सिन जीन cnidarians में वंश विशिष्ट दोहराव द्वारा विकसित कर रहे हैं, और संभवतः एच वल्गैरिस में मिलकर दोहराव द्वारा । इसके बाद, ऑप्सिन जीन की पूर्ण अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए एजर में एक अंतर अभिव्यक्ति विश्लेषण किया गया था।यह निर्धारित करने के लिए कि क्या हाइपोस्टोम में एक या अधिक ऑप्सिन को विनियमित किया जाता है, या सिर, शरीर कॉलम, नवोदित क्षेत्र, पैर और मूंछ बनाम हाइपोस्टोम की जोड़ी-वार तुलना की जाती है। यह पाया गया कि 1, 774 टेप हाइपोस्टोम और शरीर के कॉलम के बीच अलग-अलग व्यक्त किए गए थे। जीन है कि ऊपर थे कई तुलना में विनियमित निर्धारित किया गया है, और Blast2GO में एक कार्यात्मक संवर्धन प्रदर्शन किया गया ।अंत में, नवोदित के विभिन्न चरणों के दौरान विभिन्न ऊतकों में ऑप्सिन जीन की पूर्ण अभिव्यक्ति की जांच की गई, और पुनर्जनन के विभिन्न समय बिंदुओं के दौरान। संरेखण और पेड़ के दृश्य निरीक्षण की पुष्टि करेगा कि उम्मीदवार जीन ब्याज के परिवार के हैं या नहीं । जीन है कि अनुक्रम में बहुत अलग है या बाकी सब के बाहर एक समूह, शायद एक अलग जीन परिवार का हिस्सा हैं ।इस प्रोटोकॉल के परिणामों को परिकल्पना पैदा करने पर विचार किया जा सकता है। यह पाइपलाइन भविष्य के अध्ययनों में कार्यात्मक रूप से अध्ययन करने के लिए उम्मीदवार जीन को उजागर कर सकती है । हाइड्रा ऑप्सिन अभिव्यक्ति की खोज के बाद, अब हम समान तकनीकों का उपयोग कर रहे हैं ताकि समारोह में समानताओं और मतभेदों की पहचान करने के लिए प्रजातियों में संबंधित जीन की जांच की जा सके।

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