Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Ringraziamo Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad e Aline G. Rangel per i consigli e le indicazioni nell'incorporare alcuni di questi passaggi nel nostro flusso di lavoro. Siamo anche grati a Katherine Williams, Elisabeth Rebboah e Natasha Picciani per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una borsa di studio della George E. Hewitt Foundation for Medical research presso A.M.M.

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali uc irvine.
1. Preparazione della libreria RNA-seq
<ol><li>Isolare l'RNA utilizzando i seguenti metodi.<ol>
<li>Raccogliere campioni. Se l'RNA deve essere estratto in un secondo momento, flash congelare il campione o posizionare nella soluzione distoccaggio dell'RNA 15 (Tabella dei materiali).</li>
		<li>Eutanasia e sezionare l'organismo per separare i tessuti di interesse.</li>
		<li>Est...

Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire una descrizione dei passaggi per caratterizzare una famiglia genica utilizzando i dati RNA-seq. Questi metodi hanno dimostrato di funzionare per una varietà di specie e set di dati4,34,35. Il gasdotto qui stabilito è stato semplificato e dovrebbe essere abbastanza facile da essere seguito da un principiante della bioinformatica. Il significato del protocollo è che delinea tut...

I progressi nelle tecnologie di sequenziamento hanno facilitato il sequenziamento di genomi e trascrittimi di organismi non modello. Oltre alla maggiore fattibilità del sequenziamento di DNA e RNA da molti organismi, è disponibile al pubblico un'abbondanza di dati per studiare i geni di interesse. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire misure bioinformatiche per indagare l'evoluzione molecolare e l'espressione di geni che possono svolgere un ruolo importante nell'organismo di interesse.
Studiare l'evoluzione di un gene o di una famiglia genica può fornire informazioni sull'evoluzione dei sistemi biologici. I membri di una famiglia genica sono tipicamente determinati identificando motivi conservati o sequenze geniche omologhe. L'evoluzione della famiglia genica è stata precedentemente studiata utilizzando genomi di organismi modellolontanamente correlati 1. Una limitazione a questo approccio è che non è chiaro come queste famiglie geniche si evolvano in specie strettamente correlate e il ruolo delle diverse pressioni selettive ambientali. In questo protocollo, includiamo la ricerca di omologhi in specie strettamente correlate. Generando una filogenesi a livello di phylum, possiamo notare tendenze nell'evoluzione della famiglia genica come quella dei geni conservati o duplicazioni specifiche del lignaggio. A questo livello, possiamo anche indagare se i geni sono ortologi o paralogi. Mentre molti omologhi probabilmente funzionano in modo simile l'uno all'altro, questo non è necessariamente ilcaso 2. Incorporare alberi filogenetici in questi studi è importante per risolvere se questi geni omologhi sono ortologi o meno. Negli eucarioti, molti ortologi mantengono funzioni simili all'interno della cellula come evidenziato dalla capacità delle proteine dei mammiferi di ripristinare la funzione degli ortologi di lievito3. Tuttavia, ci sono casi in cui un gene non ortologo svolge una funzione caratterizzata4.
Gli alberi filogenetici iniziano a delineare le relazioni tra geni e specie, ma la funzione non può essere assegnata esclusivamente in base alle relazioni genetiche. Gli studi sull'espressione genica combinati con le annotazioni funzionali e l'analisi dell'arricchimento forniscono un forte supporto per la funzione genica. I casi in cui l'espressione genica può essere quantificata e confrontata tra individui o tipi di tessuto può essere più eloquente della funzione potenziale. Il seguente protocollo segue i metodi utilizzati per studiare i geni opsina in Hydra vulgaris7, ma possono essere applicati a qualsiasi specie e famiglia genica. I risultati di tali studi forniscono una base per ulteriori indagini sulla funzione genica e sulle reti geniche negli organismi non modello. Ad esempio, l'indagine sulla filogenesi delle opsine, che sono proteine che avviano la cascata di fototrasduzione, dà contesto all'evoluzione degli occhi e al rilevamento dellaluce 8,9,10,11. In questo caso, organismi non modello, in particolare specie animali basali come cnidari o ctenofori, possono chiarire la conservazione o i cambiamenti nella cascata di fototraduzione e nella visione attraverso i cladi12,13,14. Allo stesso modo, determinare la filogenesi, l'espressione e le reti di altre famiglie geniche ci informerà sui meccanismi molecolari alla base degli adattamenti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Distillare e segnalare set di dati di grandi dimensioni, come i dati sull'intero genoma o sul trascrittame, è spesso un compito scoraggiante. Un modo per abbattere i risultati è concentrarsi su una o più famiglie geniche che sono significative per l'organismo e lo studio. In questo protocollo, delineamo i passaggi bioinformatici per generare una filogenesi e quantificare l'espressione dei geni di interesse. Gli alberi filogenetici possono dare un'idea di come i geni si stanno evolvendo all'interno e tra le specie e rivelare l'ortografia. Questi risultati possono essere migliorati utilizzando i dati RNA-seq per confrontare l'espressione di questi geni in diversi individui o tessuti. Studi sull'evoluzione molecolare e sull'espressione possono rivelare modi di evoluzione e conservazione della funzione genica tra le specie. La caratterizzazione di una famiglia genica può servire come trampolino di lancio per studi futuri e può evidenziare un'importante famiglia genica in un nuovo genoma o carta del trascrittame.

I metodi di cui sopra sono riassunti nella figura 1 e sono stati applicati a un insieme di dati di tessuti Hydra vulgaris. H. vulgaris è un invertebrato di acqua dolce che appartiene al phylum Cnidaria che comprende anche coralli, meduse e anemoni di mare. H. vulgaris può riprodursi asessualmente germogliando e possono rigenerare la testa e il piede quando vengono bisessuali. In questo studio, abbiamo mirato a indagare l'evoluzione e l'espressione dei ge...

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A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Lo scopo di questo protocollo è quello di indagare l'evoluzione e l'espressione dei geni candidati utilizzando i dati di sequenziamento dell'RNA.

Una pipeline bioinformatica per lo studio dell'evoluzione molecolare e dell'espressione genica usando RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Questo protocollo delinea i passaggi bioinformatici per indagare l'evoluzione molecolare e l'espressione dei geni candidati. Qui forniamo istruzioni approfondite in modo che chiunque abbia un'esperienza bioinformatica minima possa eseguire questo protocollo. Questa pipeline può essere applicata a qualsiasi organismo e a qualsiasi famiglia genica.Un problema comune quando si fa bioinformatica è che gli script shell non riescono. Quando si tenta questo protocollo, assicurarsi di avere il software più aggiornato, leggere i file di errore e controllare attentamente il manuale. Per iniziare, accedere all'account cluster del computer in un terminale o in una finestra dell'applicazione PuTTY.Sul terminale, scaricare SRA Toolkit versione 2.8.1 utilizzando Wget, quindi completare l'installazione del programma. Cercare ncbi per il numero di adesione SRA per i campioni desiderati, quindi ottenere i dati della sequenza di RNA nella finestra terminale. Ottenere due file FASTQ per il tipo di file con estremità accoppiata.Trova il genoma di riferimento online se ne esiste uno. Per ottenere un assembly di riferimento, digitare wget nella finestra terminale e incollare l'indirizzo del collegamento. Se disponibile, copiare anche il file GTF e il file FASTA proteico per il genoma di riferimento.Indicizza il genoma, quindi mappa le letture e calcola l'espressione per ogni campione. Rinominare il file dei risultati in un valore descrittivo e generare una matrice di tutti i conteggi. Aprire una finestra del browser Internet e passare a NCBI GenBank.Nella barra di ricerca digitare il nome del gene di interesse e il nome delle specie strettamente correlate che sono state sequenziate. A sinistra della barra di ricerca selezionare Proteine e quindi fare clic su Cerca. Estrarre le sequenze facendo clic su Invia a e quindi selezionare File.In Formato selezionare FASTA e quindi fare clic su Crea file. Spostare il file FASTA degli omologhi nel cluster di computer utilizzando una finestra terminale locale o FileZilla. Successivamente, cerca i geni candidati usando BLAST+ Sull'ammasso del computer, crea un database BLAST dal genoma o dalla proteina tradotta con trascrimi, FASTA.BLAST le sequenze geniche omologhe da NCBI al database delle specie di interesse, quindi visualizza il file di output usando di più il comando. Copia ID gene univoci dalle specie di interesse in un nuovo file di testo. Estrarre le sequenze dei geni candidati.Per confermare l'annotazione genica utilizzando Reciprocal BLAST, passare allo strumento di ricerca dell'allineamento locale BLAST, selezionare BLASTP, quindi incollare le sequenze candidate, selezionare il database di sequenze proteiche non ridondanti e fare clic su BLAST. Aprire MEGA, fare clic su Allinea, quindi modificare l'allineamento della compilazione, selezionare Crea nuovo allineamento e quindi fare clic su OK. Selezionare Proteina. Quando viene visualizzata la finestra Allineamento, fare clic su Modifica.Fate clic su Inserisci sequenze da file (Insert Sequences From File) e selezionate fasta con sequenze proteiche di geni candidati e probabili omologhi. Selezionate Tutte le sequenze (All sequences). Trova il simbolo del braccio e passa il mouse su di esso.Dovrebbe dire allineare le sequenze usando l'algoritmo muscolare. Fare clic sul simbolo del braccio e quindi su Allinea proteine per allineare le sequenze Modifica parametri oppure su OK per utilizzare i parametri predefiniti. Questo protocollo è stato applicato ai tessuti di Hydra vulgaris che è un invertebrato d'acqua dolce che appartiene al phylum Cnidaria.I geni Opsin sono stati studiati per comprendere l'evoluzione degli occhi e il rilevamento della luce negli animali. Sequenze per geni correlati all'opsina di H.vulgaris e altre specie sono state estratte in un file FASTA dalla NCBI GenBank. I geni dell'opsina sono stati allineati in MEGA, rendendo possibile identificare le opsine hydra che mancavano di un amminoacido di lisina conservato necessario per legare una molecola sensibile alla luce.Un albero a massima verosimiglianza è stato generato usando sequenze di opsina da Hydra vulgaris e altre specie. La filogenesi suggerisce che i geni dell'opsina si stanno evolvendo per duplicazioni specifiche del lignaggio nei cnidari, e potenzialmente per duplicazione tandem in H.vulgaris. Successivamente, un'analisi dell'espressione differenziale è stata eseguita in edgeR per indagare l'espressione assoluta dei geni opsina.Per determinare se una o più opsine sono regolate in alto nell'ipostoma, o nella testa, sono stati eseguiti confronti a coppie tra ipotoma e colonna corporea, zona in erba, piede e tentacoli. Si scoprì che 1.774 trascrizioni erano espresse in modo differenziato tra l'ipostoma e la colonna corporea. Sono stati determinati i geni che erano regolati in più confronti, ed è stato eseguito un arricchimento funzionale in Blast2GO.Infine, l'espressione assoluta dei geni opsin è stata studiata in diversi tessuti durante diverse fasi di germogliatura e durante diversi punti di rigenerazione del tempo. L'ispezione visiva dell'allineamento e dell'albero confermerà se i geni candidati appartengono alla famiglia di interesse. I geni che sono troppo diversi in sequenza o un gruppo al di fuori di tutto il resto, fanno probabilmente parte di una famiglia genica diversa.I risultati di questo protocollo possono essere considerati generatori di ipotesi. Questa pipeline può evidenziare i geni candidati per studiare funzionalmente negli studi futuri. Dopo aver esplorato l'espressione dell'idra opsina, ora stiamo usando tecniche simili per indagare i geni correlati tra le specie al fine di identificare somiglianze e differenze di funzione.

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