Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
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우리는 우리의 워크 플로우에 이러한 단계의 일부를 통합에 조언과 지침을 아드리아나 브리스코, 길 스미스, 라비 무라드와 Aline G. Rangel 감사합니다. 우리는 또한 원고에 대한 의견에 캐서린 윌리엄스, 엘리자베스 렙보아, 나타샤 Picciani에 감사드립니다. 이 작품은 A.M.M 의학 연구 펠로우십을 위한 조지 E. 휴이트 재단에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

이 프로토콜은 UC 어바인 동물 관리 지침을 따릅니다.
1. RNA-seq 라이브러리 준비
<ol><li>RNA를 다음과 같은 방법을 사용하여 분리한다.<ol>
<li>샘플을 수집합니다. RNA를 나중에 추출하는 경우, RNA 저장용액(15)에 시료 또는 배치를동결한다(재료의 표).</li>
		<li>관심 있는 조직을 분리하기 위해 유기체를 안락사시키고 해부한다.</li>
		<li>추출 키트를 사...

이 프로토콜의 목적은 RNA-seq 데이터를 사용하여 유전자 가족을 특성화하기 위한 단계의 개요를 제공하는 것이다. 이러한 방법은 다양한 종 및 데이터 집합4,34,35에대해 작동하는 것으로 입증되었습니다. 여기에 설립 된 파이프 라인은 단순화되었으며 생물 정보학의 초보자가 뒤따를 만큼 쉬워야합니다. 프로토콜의 중요성은 ?...

시퀀싱 기술의 발전은 비모델 유기체의 게놈 및 전사의 시퀀싱을 용이하게 했습니다. 많은 유기체에서 DNA와 RNA를 시퀀싱하는 것의 증가된 타당성 이외에, 관심 있는 유전자를 연구하기 위하여 데이터의 풍부가 공개적으로 유효합니다. 이 프로토콜의 목적은 관심있는 유기체에서 중요한 역할을 할 수있는 유전자의 분자 진화 와 발현을 조사하기 위한 생물 정보 학적 단계를 제공하는 것입니다.
유전자 또는 유전자 가족의 진화를 조사하는 것은 생물학 시스템의 진화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 유전자 가족의 구성원은 전형적으로 보존된 모티프 또는 동상적 유전자 서열을 식별하여 결정됩니다. 유전자 가족 진화는 이전에 먼 관련 모형 유기체1에서게놈을 사용하여 조사되었습니다. 이 접근에 제한은 이 유전자 가족이 밀접하게 관련된 종및 다른 환경 선택적인 압력의 역할에서 어떻게 발전하는지 명확하지 않다는 것입니다. 이 프로토콜에서는 밀접하게 관련된 종의 동종에 대한 검색이 포함됩니다. 필럼 수준에서 필로겐을 생성함으로써 보존 된 유전자 또는 혈통 별 복제와 같은 유전자 가족 진화의 동향을 주목할 수 있습니다. 이 수준에서, 우리는 또한 유전자가 정형 소또는 패러로그인지 여부를 조사할 수 있습니다. 많은 동형 모로그가 서로 유사하게 작동할 가능성이 있지만 반드시2는아닙니다. 이 연구 결과에 있는 phylogenetic 나무를 통합하는 것은 이 동종 유전자가 정형술인지 여부를 해결하는 것이 중요합니다. 진핵생물에서, 많은 정형술은 효모 정형술3의기능을 복원하는 포유류 단백질의 능력에 의해 입증된 바와 같이 세포 내에서 유사한 기능을 유지한다. 그러나, 비직교 유전자가 특징적인 기능4를수행하는 경우가 있다.
필로유전학 나무는 유전자와 종 사이의 관계를 묘사하기 시작하지만, 기능은 유전 적 관계에 따라 전적으로 할당 할 수 없습니다. 기능성 주석 및 농축 분석과 결합된 유전자 발현 연구는 유전자 기능에 대한 강력한 지원을 제공합니다. 유전자 발현이 개인 또는 조직 모형을 통해 정량화되고 비교될 수 있는 케이스는 잠재적인 기능의 더 많은 말하기일 수 있습니다. 다음 프로토콜은 히드라 저속가스7에서opsin 유전자를 조사하는 데 사용되는 방법을 따르지만 모든 종 및 유전자 패밀리에 적용 될 수 있습니다. 이러한 연구의 결과는 비 모델 유기체에서 유전자 기능 및 유전자 네트워크에 대한 추가 조사를위한 기초를 제공합니다. 예를 들어, 광유도 캐스케이드를 시작하는 단백질인 opsins의 물리학에 대한 조사는 눈과 광 검출8,9,10,11의진화에 대한맥락을제공한다. 이 경우, 비모델 유기체는 특히 cnidarians 또는 ctenophores와 같은 기저 동물 종은12,13,14에걸쳐 광반유도 캐스케이드 및 시력의 보존 또는 변화를 해명할 수 있다. 유사하 게, 다른 유전자 가족의 phylogeny, 발현 및 네트워크를 결정 하는 것은 분자 메커니즘 기본 적응에 대해 알려 줄 것 이다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

전체 게놈 또는 전사 데이터와 같은 대규모 데이터 집합을 증류하고 보고하는 것은 종종 어려운 작업입니다. 결과를 분해하는 한 가지 방법은 유기체와 연구에 중요한 하나 이상의 유전자 가족에 집중하는 것입니다. 이 프로토콜에서, 우리는 생물학적 단계를 설명하고 필로겐을 생성하고 관심있는 유전자의 표현을 정량화합니다. 필로유전학 나무는 유전자가 종 안팎에서 어떻게 진화하고 있는지, 그리고 종이학을 드러내는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이러한 결과는 RNA-seq 데이터를 사용하여 상이한 개인 또는 조직에서 이러한 유전자의 발현을 비교하는 것으로 향상될 수 있다. 분자 진화와 발현의 연구는 종 사이 유전자 기능의 진화 그리고 보존의 모드를 밝힐 수 있습니다. 유전자 가족의 특성화는 미래 연구를 위한 발판으로 봉사할 수 있고 새로운 게놈 또는 전사 종이에 있는 중요한 유전자 가족을 강조할 수 있습니다.

위의 메서드는 그림 1에 요약되어 있으며 히드라 저속조직의 데이터 집합에 적용되었습니다. H. 저속한 은 또한 산호, 해파리, 바다 말미잘을 포함하는 phylum Cnidaria에 속하는 담수 무척추 동물입니다. H. 저속한 신진에 의해 무성을 재현할 수 있으며 양분 시 머리와 발을 재생할 수 있습니다. 이 연구에서는 히드라7에서opsin ?...

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A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

이 프로토콜의 목적은 RNA 염기서열 분석 데이터를 사용하여 후보 유전자의 진화 와 발현을 조사하는 것이다.

RNA-seq를 사용하여 분자 진화 및 유전자 발현을 조사하기 위한 생물정보학 파이프라인

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

이 프로토콜은 후보 유전자의 분자 진화와 발현을 조사하기 위한 생물정보학적 단계를 간략하게 설명합니다. 여기서 우리는 최소한의 생물 정보 학적 경험을 가진 사람이이 프로토콜을 통해 실행할 수 있도록 철저한 지침을 제공합니다. 이 파이프라인은 모든 유기체 및 유전자 패밀리에 적용될 수 있습니다.생물 정보학을 할 때 한 가지 일반적인 문제는 쉘 스크립트가 실패하는 것입니다. 이 프로토콜을 시도할 때 최신 소프트웨어가 있는지 확인하고 오류 파일을 읽고 수동으로 주의 깊게 확인합니다. 시작하려면 터미널 또는 PuTTY 응용 프로그램 창에서 컴퓨터 클러스터 계정에 로그인합니다.터미널에서 Wget을 사용하여 SRA Toolkit 버전 2.8.1을 다운로드한 다음 프로그램 설치를 완료합니다. 원하는 샘플에 대한 SRA 가입 번호에 대한 NCBI를 검색한 다음 말단 창에서 RNA 서열 데이터를 얻습니다. 페어링 된 끝 파일 유형에 대한 두 개의 FASTQ 파일을 가져옵니다.참조 게놈이 존재하는 경우 온라인으로 참조 게놈을 찾으십시오. 참조 어셈블리를 얻으려면 터미널 창에 wget을 입력하고 링크 주소를 붙여 넣습니다. 사용 가능한 경우 참조 게놈에 대한 GTF 파일 및 단백질 FASTA 파일을 복사합니다.게놈을 색인한 다음 각 샘플에 대한 표현을 읽고 계산합니다. 결과 파일의 이름을 설명된 것으로 변경하고 모든 카운트의 행렬을 생성합니다. 인터넷 브라우저 창을 열고 NCBI GenBank로 이동합니다.검색 바에서관심 유전자의 이름과 시퀀스된 밀접한 관련이 있는 종의 이름을 입력합니다. 검색 모음 왼쪽에서 단백질을 선택한 다음 검색을 클릭합니다. 보내기를 클릭하여 시퀀스를 추출한 다음 파일을 선택합니다.형식 에서 FASTA를 선택한 다음 파일 만들기를 클릭합니다. 로컬 터미널 창 또는 FileZilla를 사용하여 FASTA 파일의 호모로그 파일을 컴퓨터 클러스터로 이동합니다. 다음으로, BLAST+컴퓨터 클러스터를 사용하여 후보 유전자를 검색하고, 게놈 또는 전사 번역 단백질인 FASTA로부터 BLAST 데이터베이스를 만든다.NCBI에서 관심 있는 종의 데이터베이스로 동종 유전자 서열을 폭발한 다음 명령을 사용하여 출력 파일을 더 봅니다. 관심 있는 종의 고유한 유전자 아이디를 새 텍스트 파일로 복사합니다. 후보 유전자의 서열을 추출합니다.상호 BLAST를 사용하여 유전자 음표를 확인하려면 BLAST 로컬 정렬 검색 도구로 이동하여 BLASTP를 선택한 다음 후보 서열을 붙여 넣고 비중복 단백질 서열 데이터베이스를 선택하고 BLAST를 클릭합니다. MEGA를 열고 정렬을 클릭한 다음 정렬 빌드를 편집하고 새 정렬 만들기를 선택하고 확인을 클릭합니다. 단백질을 선택합니다. 정렬 창이 열리면 편집을 클릭합니다.파일에서 서열을 삽입하고 후보 유전자및 가능한 동형 구형의 단백질 서열로 FASTA를 선택합니다. 모든 시퀀스를 선택합니다. 팔 기호를 찾아 그 위에 마우스를 가져가십시오.그것은 근육 알고리즘을 사용하여 정렬 순서를 말해야한다. 팔 기호를 클릭한 다음 단백질 정렬을 클릭하여 서열 편집 매개 변수를 정렬하거나 확인을 클릭하여 기본 매개 변수를 사용합니다. 이 프로토콜은 식물 성 Cnidaria에 속하는 담수 무척추 동물인 히드라 저속한 조직에 적용되었습니다.Opsin 유전자는 동물의 눈과 빛 발견의 진화에 대한 통찰력을 얻기 위해 조사되었다. H.vulgaris 및 기타 종의 opsin 관련 유전자에 대한 시퀀스는 NCBI GenBank에서 FASTA 파일로 추출되었다. opsin 유전자는 MEGA에 정렬되었다, 빛에 민감한 분자를 결합하는 데 필요한 보존 리신 아미노산을 누락 된 히드라 opsins을 식별 할 수 있도록.히드라 저속가리스 및 기타 종의 opsin 서열을 사용하여 최대 가능성 트리가 생성되었습니다. 필로겐은 opsin 유전자가 cnidarians에 있는 혈통 특정 중복에 의해, 그리고 H.vulgaris에 있는 탠덤 중복에 의해 잠재적으로 진화하고 있다는 것을 건의합니다. 다음으로, opsin 유전자의 절대발현을 조사하기 위해 edgeR에서 차동 발현 분석을 수행했다.하나 이상의 수술이 저포메에서 상류 조절되는지 여부를 결정하기 위해, 또는 머리, 몸 기둥대 가설의 쌍 현명한 비교, 신진 영역, 발 및 촉수가 수행되었다. 1, 774개의 녹취록이 가설과 신체 기둥 사이에 차별화된 것으로 나타났습니다. 다중 비교를 통해 위로 통제된 유전자는, Blast2GO에 있는 기능적인 농축이 수행되었습니다.마지막으로, opsin 유전자의 절대적인 발현은 신진의 다른 단계 도중 및 재생의 다른 시간 점 도중 다른 조직에서 조사되었습니다. 정렬 및 트리의 육안 검사는 후보 유전자가 관심의 가족에 속하는지 여부를 확인합니다. 서열또는 다른 모든 것의 외부 단에서 너무 다른 유전자는 아마 다른 유전자 가족의 일부입니다.이 프로토콜의 결과는 가설 생성으로 간주될 수 있습니다. 이 파이프라인은 향후 연구에서 기능적으로 공부할 후보 유전자를 강조할 수 있습니다. Hydra opsin 발현을 탐구한 후에, 우리는 지금 기능의 유사성 그리고 다름을 확인하기 위하여 종에 걸쳐 관련 유전자를 조사하기 위하여 유사한 기술을 사용하고 있습니다.

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