Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Vi takker Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad og Aline G. Rangel for råd og veiledning i å innlemme noen av disse trinnene i arbeidsflyten vår. Vi er også takknemlige til Katherine Williams, Elisabeth Rebboah og Natasha Picciani for kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble delvis støttet av en George E. Hewitt Foundation for Medical research fellowship til A.M.M.

Denne protokollen følger UC Irvine dyrepleieretningslinjer.
1. RNA-seq bibliotek forberedelse
<ol><li>Isoler RNA ved hjelp av følgende metoder.<ol>
<li>Samle inn prøver. Hvis RNA skal trekkes ut på et senere tidspunkt, må du fryse prøven eller plassere den i RNA-lagringsløsningen15 (Materialliste).</li>
		<li>Avlive og dissekere organismen for å skille vev av interesse.</li>
		<li>Trekk ut total RNA ved hjelp av et ekstraksjonssett og rens RNA...

Formålet med denne protokollen er å gi en oversikt over trinnene for å karakterisere en genfamilie ved hjelp av RNA-seq-data. Disse metodene har vist seg å fungere for en rekke arter og datasett4,34,35. Rørledningen som er etablert her er forenklet og bør være enkel nok til å bli etterfulgt av en nybegynner innen bioinformatikk. Betydningen av protokollen er at den skisserer alle trinnene og nødvendige programmer for å...

Fremskritt innen sekvenseringsteknologier har lagt til rette for sekvensering av genomer og transkripsjoner av ikke-modellorganismer. I tillegg til den økte muligheten for sekvensering av DNA og RNA fra mange organismer, er en overflod av data offentlig tilgjengelig for å studere gener av interesse. Formålet med denne protokollen er å gi bioinformatiske trinn for å undersøke molekylær evolusjon og uttrykk for gener som kan spille en viktig rolle i interesseorganismen.
Å undersøke utviklingen av et gen eller en genfamilie kan gi innsikt i utviklingen av biologiske systemer. Medlemmer av en genfamilie bestemmes vanligvis ved å identifisere bevarte motiver eller homologe gensekvenser. Genfamilieutvikling ble tidligere undersøkt ved hjelp av genomer fra fjernt beslektede modellorganismer1. En begrensning i denne tilnærmingen er at det ikke er klart hvordan disse genfamiliene utvikler seg i nært beslektede arter og rollen til ulike miljøselektive press. I denne protokollen inkluderer vi et søk etter homologer i nært beslektede arter. Ved å generere en fylogeni på et fylumsnivå, kan vi merke oss trender i genfamilieutvikling som for konserverte gener eller avledningsspesifikke dupliseringer. På dette nivået kan vi også undersøke om gener er ortologer eller paraloger. Mens mange homologer sannsynligvis fungerer på samme måte som hverandre, er det ikke nødvendigvis tilfelle2. Å inkorporere fylogenetiske trær i disse studiene er viktig for å løse om disse homologe genene er ortologer eller ikke. I eukaryoter beholder mange ortologer lignende funksjoner i cellen som det fremgår av pattedyrproteiners evne til å gjenopprette funksjonen til gjær ortologer3. Det er imidlertid tilfeller der et ikke-ortopedisk gen utfører en karakterisert funksjon4.
Fylogenetiske trær begynner å avgrense sammenhenger mellom gener og arter, men funksjonen kan ikke tildeles utelukkende basert på genetiske relasjoner. Genuttrykksstudier kombinert med funksjonelle merknader og berikelsesanalyse gir sterk støtte til genfunksjon. Tilfeller der genuttrykk kan kvantifiseres og sammenlignes på tvers av individer eller vevstyper, kan være mer fortellende om potensiell funksjon. Følgende protokoll følger metoder som brukes til å undersøke opsingener i Hydra vulgaris7, men de kan brukes på alle arter og hvilken som helst genfamilie. Resultatene fra slike studier gir grunnlag for videre utredning av genfunksjon og gennettverk i ikke-modellorganismer. Som et eksempel gir undersøkelsen av fylogenien av opsiner, som er proteiner som initierer fototransduksjonskaskaden, kontekst til utviklingen av øyne og lysdeteksjon8,9,10,11. I dette tilfellet kan ikke-modellorganismer spesielt basale dyrearter som cnidarians eller ctenophores belyse bevaring eller endringer i fototransduksjonskaskaden og visjonen over clades12,13,14. På samme måte vil det å bestemme fylogeni, uttrykk og nettverk av andre genfamilier informere oss om de molekylære mekanismene som ligger til grunn for tilpasninger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Destillering og rapportering av store datasett, for eksempel hele genom- eller transkripsjonsdata, er ofte en skremmende oppgave. En måte å bryte ned resultatene på er å fokusere på en eller flere genfamilier som har betydning for organismen og studien. I denne protokollen skisserer vi bioinformatiske trinn for å generere en fylogeni og for å kvantifisere uttrykket av gener av interesse. Fylogenetiske trær kan gi innsikt i hvordan gener utvikler seg i og mellom arter, samt avdekke ortologi. Disse resultatene kan forbedres ved hjelp av RNA-seq data for å sammenligne uttrykket av disse genene i forskjellige individer eller vev. Studier av molekylær evolusjon og uttrykk kan avdekke former for evolusjon og bevaring av genfunksjon mellom arter. Karakteriseringen av en genfamilie kan fungere som et springbrett for fremtidige studier og kan fremheve en viktig genfamilie i et nytt genom eller transkripsjonspapir.

Metodene ovenfor er oppsummert i figur 1 og ble brukt på et datasett av Hydra vulgaris vev. H. vulgaris er en ferskvanns hvirvelløse dyr som tilhører phylum Cnidaria som også inkluderer koraller, maneter og sjømoner. H. vulgaris kan reprodusere aseksuelt ved spirende, og de kan regenerere hodet og foten når de blir bispedert. I denne studien hadde vi som mål å undersøke evolusjonen og uttrykket av opsingener i Hydra7</su...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Formålet med denne protokollen er å undersøke utviklingen og uttrykket av kandidatgener ved hjelp av RNA-sekvenseringsdata.

En bioinformatikkrørledning for undersøkelse av molekylær evolusjon og genuttrykk ved hjelp av RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Denne protokollen skisserer bioinformatiske trinn for å undersøke molekylær evolusjon og uttrykk for kandidatgener. Her gir vi grundige instruksjoner slik at alle med minimal bioinformatisk erfaring kan løpe gjennom denne protokollen. Denne rørledningen kan brukes på hvilken som helst organisme og hvilken som helst genfamilie.Et vanlig problem når du gjør bioinformatikk er at skallskript mislykkes. Når du prøver denne protokollen, må du sørge for at du har den mest oppdaterte programvaren, lese feilfilene og sjekke håndboken nøye. For å begynne, logg inn på datamaskinklyngekontoen i et terminal- eller PuTTY-programvindu.På terminalen laster du ned SRA Toolkit versjon 2.8.1 ved hjelp av Wget, og deretter fullfører du installasjonen av programmet. Søk i NCBI etter SRA-tiltredelsesnummeret for de ønskede prøvene, og hent deretter RNA-sekvensdataene i terminalvinduet. Skaff deg to FASTQ-filer for pardelte filer.Finn referansegenomet på nettet hvis det finnes et. Hvis du vil hente en referansesamling, skriver du inn wget i terminalvinduet og limer inn koblingsadressen. Hvis tilgjengelig, kopier også GTF-filen og protein FASTA-filen for referansegenomet.Indekser genomet, og kartles og beregn uttrykk for hvert utvalg. Endre navnet på resultatfilen til noe beskrivende, og generer en matrise med alle antall. Åpne et nettleservindu og gå til NCBI GenBank.I søkefeltet skriver du inn navnet på genet av interesse og navnet på nært beslektede arter som har blitt sekvensert. Velg Protein til venstre for søkefeltet, og klikk deretter Søk. Pakk ut sekvensene ved å klikke Send til, og velg deretter Fil.Velg FASTA under Format, og klikk deretter Opprett fil. Flytt FASTA-fil med homologer til dataklyngen ved hjelp av et lokalt terminalvindu eller FileZilla. Deretter søker du etter kandidatgener ved hjelp av BLAST+På dataklyngen lager du en BLAST-database fra genomet eller transkripsjonsoversatt protein, FASTA.BLAST de homologe gensekvensene fra NCBI til databasen av arten av interesse, og se deretter utdatafilen ved hjelp av kommandoen mer. Kopier unike gen-ID-er fra artene av interesse til en ny tekstfil. Trekk ut sekvensene av kandidatgener.Hvis du vil bekrefte genmerknad ved hjelp av Reciprocal BLAST, går du til BLAST Local Alignment Search Tool, velger BLASTP og limer inn kandidatsekvensene, velger den ikke-overflødige proteinsekvensdatabasen og klikker BLAST. Åpne MEGA, klikk Juster, rediger byggejustering, velg Opprett en ny justering, og klikk OK. Velg Protein. Når justeringsvinduet åpnes, klikker du på Rediger.Klikk Sett inn sekvenser fra fil, og velg FASTA med proteinsekvenser av kandidatgener og sannsynlige homologer. Velg Alle sekvenser. Finn armsymbolet og hold markøren over det.Det skal stå juster sekvenser ved hjelp av muskelalgoritme. Klikk på armsymbolet, og klikk deretter Juster protein for å justere sekvensene Rediger parametere eller klikk OK for å bruke standardparametere. Denne protokollen ble brukt på vev av Hydra vulgaris som er en ferskvanns hvirvelløse dyr som tilhører phylum Cnidaria.Opsingener ble undersøkt for å få innsikt i utviklingen av øyne og lysdeteksjon hos dyr. Sekvenser for opsinrelaterte gener av H.vulgaris og andre arter ble hentet ut i en FASTA-fil fra NCBI GenBank. Opsingenene ble justert i MEGA, noe som gjorde det mulig å identifisere Hydra-opsiner som manglet en konservert lysinaminosyre som var nødvendig for å binde et lysfølsomt molekyl.Et tre med maksimal sannsynlighet ble generert ved hjelp av opsinsekvenser fra Hydra vulgaris og andre arter. Fylogenien antyder at opsingener utvikler seg ved avgrensningsspesifikke dupliseringer hos cnidarians, og potensielt ved tandemduplisering i H.vulgaris. Deretter ble det utført en differensialuttrykksanalyse i edgeR for å undersøke absolutt uttrykk for opsingener.For å avgjøre om en eller flere opsiner er oppregulert i hypostomet, eller hodet, ble det utført parvise sammenligninger av hypostom kontra kroppskolonnen, spirende sone, fot og tentakler. Det ble funnet at 1774 transkripsjoner ble differensialt uttrykt mellom hypostomet og kroppskolonnen. Genene som var oppregulert på tvers av flere sammenligninger ble bestemt, og en funksjonell berikelse i Blast2GO ble utført.Til slutt ble det absolutte uttrykket av opsingener undersøkt i forskjellige vev i ulike stadier av spirende, og under forskjellige tidspunkter for regenerering. Visuell inspeksjon av justeringen og treet vil bekrefte om kandidatgener tilhører familien av interesse. Gener som er for forskjellige i rekkefølge eller en gruppe utenfor alt annet, er sannsynligvis en del av en annen genfamilie.Resultater fra denne protokollen kan betraktes som hypotesegenererende. Denne rørledningen kan fremheve kandidatgener for å studere funksjonelt i fremtidige studier. Etter å ha utforsket Hydra opsinuttrykk, bruker vi nå lignende teknikker for å undersøke relaterte gener på tvers av arter for å identifisere likheter og funksjonsforskjeller.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

En protokoll for Computer-Based Protein struktur og funksjon Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Måling av Metabolic Rate i<em&gt; Drosophila</em&gt; Hjelp respirometri

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentell og bioinformatikk protokoll for RNA-seq Analyser av Photoperiodic Diapause i den asiatiske tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...