Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Agradecemos a Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad e Aline G. Rangel por conselhos e orientações na incorporação de algumas dessas etapas em nosso fluxo de trabalho. Também somos gratos a Katherine Williams, Elisabeth Rebboah e Natasha Picciani por comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi apoiado em parte por uma bolsa de pesquisa médica da Fundação George E. Hewitt para a A.M.M.

Este protocolo segue as diretrizes de cuidados com animais da UC Irvine.
1. Preparação da biblioteca RNA-seq
<ol><li>Isole o RNA usando os seguintes métodos.<ol>
<li>Coletar amostras. Se o RNA for extraído posteriormente, congele a amostra ou coloque na solução de armazenamentoRNA 15 (Tabela de Materiais).</li>
		<li>Eutanize e disseque o organismo para separar tecidos de interesse.</li>
		<li>Extrair RNA total usando um kit de extração e puri...

O objetivo deste protocolo é fornecer um esboço das etapas para caracterizar uma família genética usando dados RNA-seq. Estes métodos têm sido comprovados para funcionar para uma variedade de espécies e conjuntos de dados4,34,35. O gasoduto aqui estabelecido foi simplificado e deve ser fácil o suficiente para ser seguido por um novato em bioinformática. O significado do protocolo é que ele delineia todas as etapas e pr...

Os avanços nas tecnologias de sequenciamento facilitaram o sequenciamento de genomas e transcriptomes de organismos não-modelos. Além da maior viabilidade do sequenciamento do DNA e do RNA de muitos organismos, uma abundância de dados está disponível publicamente para estudar genes de interesse. O objetivo deste protocolo é fornecer passos bioinforáticos para investigar a evolução molecular e a expressão de genes que possam desempenhar um papel importante no organismo de interesse.
Investigar a evolução de um gene ou gene familiar pode fornecer uma visão da evolução dos sistemas biológicos. Membros de uma família genética são tipicamente determinados pela identificação de motivos conservados ou sequências genéticas homólogos. A evolução da família genética foi previamente investigada usando genomas de organismos modelos distantes1. Uma limitação para essa abordagem é que não está claro como essas famílias genéticas evoluem em espécies intimamente relacionadas e o papel de diferentes pressões seletivas ambientais. Neste protocolo, incluímos uma busca por homólogos em espécies intimamente relacionadas. Ao gerar uma filogenia a um nível de filogênio, podemos notar tendências na evolução da família genética, como a de genes conservados ou duplicações específicas de linhagem. Neste nível, também podemos investigar se genes são ortologs ou paralogs. Embora muitos homólogos provavelmente funcionem de forma semelhante entre si, isso não é necessariamente o caso2. A incorporação de árvores filogenéticas nesses estudos é importante para resolver se esses genes homólogos são ortologs ou não. Nos eucariotes, muitos ortologos mantêm funções semelhantes dentro da célula, como evidenciado pela capacidade das proteínas mamíferas de restaurar a função dos ortologs de levedura3. No entanto, há casos em que um gene não ortologos realiza uma função caracterizada4.
As árvores filogenéticas começam a delinear relações entre genes e espécies, mas a função não pode ser atribuída apenas com base nas relações genéticas. Estudos de expressão genética combinados com anotações funcionais e análise de enriquecimento fornecem forte suporte para a função genética. Casos em que a expressão genética pode ser quantificada e comparada entre indivíduos ou tipos de tecidos podem ser mais reveladores da função potencial. O protocolo a seguir segue métodos usados na investigação de genes de opsina em Hydra vulgaris7, mas eles podem ser aplicados a qualquer espécie e qualquer família genética. Os resultados desses estudos fornecem uma base para uma investigação mais aprofundada sobre a função genética e redes genéticas em organismos não-modelo. Como exemplo, a investigação da filogenia das opsinas, que são proteínas que iniciam a cascata de fototransdução, dá contexto à evolução dos olhos e da detecção de luz8,9,10,11. Neste caso, organismos não-modelos, especialmente espécies de animais basais, como cnidários ou ctenoforos, podem elucidar a conservação ou alterações na cascata de fototransdução e na visão através de claes12,13,14. Da mesma forma, determinar a filogenia, expressão e redes de outras famílias genéticas nos informará sobre os mecanismos moleculares subjacentes às adaptações.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Destilar e relatar grandes conjuntos de dados, como dados de genoma inteiro ou transcriptome, é muitas vezes uma tarefa assustadora. Uma maneira de quebrar resultados é focar em uma ou mais famílias genéticas que são significativas para o organismo e estudar. Neste protocolo, delineamos etapas bioinformáticas para gerar uma filogenia e quantificar a expressão de genes de interesse. As árvores filogenéticas podem dar uma visão de como os genes estão evoluindo dentro e entre espécies, bem como revelar ortologia. Esses resultados podem ser aprimorados usando dados de RNA-seq para comparar a expressão desses genes em diferentes indivíduos ou tecidos. Estudos de evolução molecular e expressão podem revelar modos de evolução e conservação da função genética entre espécies. A caracterização de uma família genética pode servir de trampolim para estudos futuros e pode destacar uma importante família genética em um novo genoma ou papel transcriptome.

Os métodos acima são resumidos na Figura 1 e foram aplicados a um conjunto de dados de tecidos hydra vulgaris. H. vulgaris é um invertebrado de água doce que pertence ao filo Cnidaria que também inclui corais, águas-vivas e anêmonas do mar. H. vulgaris pode se reproduzir assexualmente brotando e eles podem regenerar a cabeça e o pé quando bissecto. Neste estudo, buscou-se investigar a evolução e expressão dos genes opsin na Hydra<sup c...

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A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

O objetivo deste protocolo é investigar a evolução e expressão dos genes candidatos usando dados de sequenciamento de RNA.

Um Pipeline bioinforático para investigar a evolução molecular e a expressão genética usando RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Este protocolo descreve etapas bioinformáticas para investigar a evolução molecular e a expressão dos genes candidatos. Aqui fornecemos instruções minuciosas para que qualquer pessoa com experiência bioinformática mínima possa passar por este protocolo. Este oleoduto pode ser aplicado a qualquer organismo e qualquer família genética.Uma questão comum ao fazer bioinformática é que os scripts shell falham. Ao tentar este protocolo, certifique-se de ter o software mais atualizado, leia os arquivos de erro e verifique o manual cuidadosamente. Para começar, faça login na conta de cluster do computador em uma janela de aplicativo terminal ou PuTTY.No terminal, baixe a versão 2.8.1 do SR Toolkit usando o Wget e, em seguida, termine de instalar o programa. Pesquise NCBI para obter o número de adesão sra para as amostras desejadas e, em seguida, obtenha os dados de sequência de RNA na janela do terminal. Obtenha dois arquivos FASTQ para o tipo de arquivos de extremidade emparelhado.Encontre o genoma de referência on-line se existir. Para obter um conjunto de referência, digite wget na janela do terminal e cole o endereço de link. Se disponível, copie também o arquivo GTF e o arquivo FASTA de proteína para o genoma de referência.Indexe o genoma, então mapeia leituras e calcula a expressão para cada amostra. Renomeie o arquivo de resultados para algo descritivo e gere uma matriz de todas as contagens. Abra uma janela do navegador de internet e vá para o NCBI GenBank.Na barra de pesquisa, digite o nome do gene de interesse e o nome de espécies intimamente relacionadas que foram sequenciadas. À esquerda da barra de pesquisa, selecione Proteína e clique em Pesquisar. Extrair as sequências clicando em Enviar e, em seguida, selecione Arquivo.Em Formato, selecione FASTA e clique em Criar arquivo. Mova o arquivo FASTA de homologues para o cluster do computador usando uma janela de terminal local ou FileZilla. Em seguida, procure genes candidatos usando BLAST+No cluster do computador, faça um banco de dados BLAST a partir do genoma ou proteína traduzida por transcriptome, FASTA.BLAST as sequências genéticas homólogos do NCBI para o banco de dados da espécie de interesse, em seguida, visualize o arquivo de saída usando mais o comando. Copie iDs genéticos exclusivos da espécie de interesse para um novo arquivo de texto. Extrair as sequências de genes candidatos.Para confirmar a anotação genética usando o BLAST recíproco, vá para a Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local BLAST, selecione BLASTP e cole as sequências de candidatos, selecione o banco de dados de sequência de proteínas não redundante e clique em BLAST. Abra MEGA, clique em Alinhar, em seguida, Editar Alinhamento de compilação, selecionar Criar um novo alinhamento e clique em OK. Selecione Proteína. Quando a janela Alinhamento for aberta, clique em Editar.Clique em Inserir sequências do arquivo e selecione o FASTA com sequências proteicas de genes candidatos e possíveis homólogos. Selecione Todas as sequências. Encontre o símbolo do braço e passe o mouse sobre ele.Deve dizer alinhar sequências usando algoritmo muscular. Clique no símbolo do braço e clique em Alinhar Proteína para alinhar as sequências Editar parâmetros ou clicar em OK para usar parâmetros padrão. Este protocolo foi aplicado aos tecidos da Hydra vulgaris, que é um invertebrado de água doce que pertence ao filo Cnidaria.Genes de opsina foram investigados para obter uma visão sobre a evolução dos olhos e a detecção de luz em animais. Sequências para genes relacionados à opsina de H.vulgaris e outras espécies foram extraídas em um arquivo FASTA do NCBI GenBank. Os genes de opsina foram alinhados no MEGA, possibilitando identificar as opsinas hydra que estavam faltando um aminoácido conservado de lisina necessário para ligar uma molécula sensível à luz.Uma árvore de maior probabilidade foi gerada usando sequências de opsina da Hydra vulgaris e outras espécies. A filogenia sugere que os genes da opsina estão evoluindo por duplicações específicas de linhagem em cnidários, e potencialmente por duplicação em H.vulgaris. Em seguida, foi realizada uma análise de expressão diferencial no edgeR para investigar a expressão absoluta dos genes opsina.Para determinar se uma ou mais opsinas são reguladas no hipostome, ou cabeça, foram realizadas comparações par-wise de hipostome versus coluna corporal, zona de brotamento, pé e tentáculos foram realizadas. Verificou-se que 1.774 transcrições foram expressas diferencialmente entre o hipostome e a coluna corporal. Os genes que foram regulados em várias comparações foram determinados, e um enriquecimento funcional no Blast2GO foi realizado.Finalmente, a expressão absoluta dos genes opsin foi investigada em diferentes tecidos durante diferentes estágios de brotação, e durante diferentes pontos de tempo de regeneração. A inspeção visual do alinhamento e da árvore confirmará se os genes candidatos pertencem à família de interesse. Genes que são muito diferentes em sequência ou um grupo fora de tudo o resto, provavelmente fazem parte de uma família genética diferente.Os resultados deste protocolo podem ser considerados geradores de hipóteses. Este pipeline pode destacar genes candidatos para estudar funcionalmente em estudos futuros. Depois de explorar a expressão de hidra opsina, agora estamos usando técnicas semelhantes para investigar genes relacionados entre espécies, a fim de identificar semelhanças e diferenças de função.

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