Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Мы благодарим Адриану Бриско, Гила Смита, Раби Мурада и Алин Г. Рангел за советы и рекомендации по включению некоторых из этих шагов в наш рабочий процесс. Мы также благодарны Кэтрин Уильямс, Элизабет Реббоа и Наташе Пиччиани за комментарии к рукописи. Эта работа была частично поддержана стипендией Фонда Джорджа Э. Хьюитта для медицинских исследований A.M.M.

Этот протокол следует рекомендациям по уходу за животными UC Irvine.
1. Подготовка библиотеки РНК-seq
<ol><li>Изолируйте РНК с помощью следующих методов.<ol>
<li>Соберите образцы. Если РНК должна быть извлечена в более позднее время, флэш-заморозьте образец или поместите в раствор дл...

Цель этого протокола состоит в том, чтобы дать краткое описание шагов для характеристики семейства генов с использованием данных RNA-seq. Было доказано, что эти методы работают для различных видов и наборов данных4,34,35. Созданный здесь кон?...

Достижения в области технологий секвенирования облегчили секвенирование геномов и транскриптомов немоделированных организмов. В дополнение к повышенной возможности секвенирования ДНК и РНК от многих организмов, обилие данных является общедоступным для изучения генов, представляющих интерес. Целью этого протокола является предоставление биоинформатических шагов для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов, которые могут играть важную роль в интересуемом организме.
Исследование эволюции гена или семейства генов может дать представление об эволюции биологических систем. Члены семейства генов обычно определяются путем идентификации сохраненных мотивов или гомологичных последовательностей генов. Эволюция семейства генов ранее исследовалась с использованием геномов отдаленно связанных модельных организмов1. Ограничением этого подхода является то, что неясно, как эти семейства генов развиваются у близкородственных видов и роль различных селективных давлений окружающей среды. В этот протокол мы включаем поиск гомологов у близкородственных видов. Генерируя филогенез на уровне типа, мы можем отметить тенденции в эволюции семейства генов, такие как сохранение генов или дупликации, специфичные для линии. На этом уровне мы также можем исследовать, являются ли гены ортологами или паралогами. Хотя многие гомологи, вероятно, функционируют аналогично друг другу, это не обязательно так2. Включение филогенетических деревьев в эти исследования важно для решения вопроса о том, являются ли эти гомологичные гены ортологами или нет. У эукариот многие ортологи сохраняют аналогичные функции внутри клетки, о чем свидетельствует способность белков млекопитающих восстанавливать функцию дрожжевых ортологов3. Однако есть случаи, когда неортологичный ген выполняет характерную функцию4.
Филогенетические деревья начинают очертивать отношения между генами и видами, но функция не может быть назначена исключительно на основе генетических связей. Исследования экспрессии генов в сочетании с функциональными аннотациями и анализом обогащения обеспечивают сильную поддержку функции генов. Случаи, когда экспрессия генов может быть количественно оценена и сравнена между людьми или типами тканей, могут быть более показательными для потенциальной функции. Следующий протокол следует методам, используемым при исследовании генов опсина в Hydra vulgaris7,но они могут быть применены к любому виду и любому семейству генов. Результаты таких исследований обеспечивают основу для дальнейшего изучения функции генов и генных сетей в немоделовых организмах. В качестве примера, исследование филогении опсинов, которые являются белками, которые инициируют каскад фототрансдукции, дает контекст эволюции глаз и обнаружения света8,9,10,11. В этом случае немодельные организмы, особенно базальные виды животных, такие как книдарии или гребневицы, могут прояснить сохранение или изменения в каскаде фототрансдукции и зрения черезклады 12,13,14. Точно так же определение филогении, экспрессии и сетей других семейств генов проинформирует нас о молекулярных механизмах, лежащих в основе адаптаций.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Дистилляция и представление больших наборов данных, таких как данные всего генома или транскриптома, часто является сложной задачей. Один из способов разбить результаты — сосредоточиться на одном или нескольких семействах генов, которые важны для организма и исследования. В этом протоколе мы описываем биоинформативные шаги для создания филогении и количественной оценки экспрессии генов, представляющих интерес. Филогенетические деревья могут дать представление о том, как гены развиваются внутри и между видами, а также выявить орфографию. Эти результаты могут быть улучшены с использованием данных RNA-seq для сравнения экспрессии этих генов у разных людей или тканей. Исследования молекулярной эволюции и экспрессии могут выявить способы эволюции и сохранения функции генов между видами. Характеристика семейства генов может служить трамплином для будущих исследований и может выделить важное семейство генов в новом геноме или транскриптоме.

Приведенные выше методы обобщены на рисунке 1 и были применены к набору данных тканей Hydra vulgaris. H. vulgaris является пресноводным беспозвоночным, которое принадлежит к типу Cnidaria, который также включает кораллы, медузы и морские анемоны. H. vulgaris может размнож...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Целью этого протокола является исследование эволюции и экспрессии генов-кандидатов с использованием данных секвенирования РНК.

Биоинформатический конвейер для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов с использованием RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Этот протокол описывает биоинформативные шаги для исследования молекулярной эволюции и экспрессии генов-кандидатов. Здесь мы предоставляем подробные инструкции, чтобы любой человек с минимальным биоинформатическим опытом мог пройти через этот протокол. Этот конвейер может быть применен к любому организму и любому семейству генов.Одной из распространенных проблем при выполнении биоинформатики является сбой сценариев оболочки. При попытке использования этого протокола убедитесь, что у вас есть самое современное программное обеспечение, прочитайте файлы ошибок и внимательно проверьте руководство. Для начала войдите в учетную запись кластера компьютеров в окне терминала или приложения PuTTY.На терминале загрузите SRA Toolkit версии 2.8.1 с помощью Wget, после чего завершите установку программы. Выполните поиск NCBI по номеру присоединения SRA для требуемых образцов, а затем получите данные последовательности РНК в окне терминала. Получите два файла FASTQ для парного типа файлов.Найдите эталонный геном онлайн, если он существует. Чтобы получить эталонную сборку, введите wget в окне терминала и вставьте адрес ссылки. Если доступно, также скопируйте файл GTF и файл белка FASTA для эталонного генома.Индексируйте геном, затем считывает карту и вычисляет экспрессию для каждого образца. Переименуйте файл результатов во что-то описательное и создайте матрицу всех счетчиков. Откройте окно интернет-браузера и перейдите в NCBI GenBank.В строке поиска введите название интересуемого гена и название близкородственных видов, которые были секвенированы. В левой части строки поиска выберите Белок, затем нажмите Кнопка Поиск. Извлеките последовательности, нажав кнопку Отправить, а затем выберите Файл.В разделе Формат выберите FASTA, затем нажмите Создать файл. Переместите файл гомологов FASTA в кластер компьютеров с помощью локального окна терминала или FileZilla. Затем найдите гены-кандидаты с помощью BLAST+ On компьютерного кластера, сделайте базу данных BLAST из генома или транскриптом-транскриптомного белка, FASTA.BLAST гомологичные последовательности генов из NCBI в базу данных интересующих видов, затем просмотрите выходной файл с помощью команды more. Скопируйте уникальные идентификаторы генов интересующих видов в новый текстовый файл. Извлеките последовательности генов-кандидатов.Чтобы подтвердить аннотацию гена с помощью Reciprocal BLAST, перейдите в инструмент поиска локального выравнивания BLAST, выберите BLASTP, затем вставьте последовательности-кандидаты, выберите базу данных неизбыточных белковых последовательностей и нажмите кнопку BLAST. Откройте MEGA, нажмите «Выровнять», затем «Изменить выравнивание сборки», выберите «Создать новое выравнивание» и нажмите «ОК». Выберите Белок. Когда откроется окно Выравнивание, нажмите кнопку Изменить.Нажмите Кнопку Вставить последовательности из файла и выберите FASTA с белковыми последовательностями генов-кандидатов и вероятными гомологами. Выберите Все последовательности. Найдите символ руки и наведите на него курсо.Следует сказать, выровнять последовательности с помощью мышечного алгоритма. Щелкните символ руки, а затем щелкните Выровнять белок, чтобы выровнять последовательности Изменить параметры, или нажмите кнопку ОК, чтобы использовать параметры по умолчанию. Этот протокол был применен к тканям Hydra vulgaris, которая является пресноводным беспозвоночным, принадлежащим к типу Cnidaria.Гены опсина были исследованы, чтобы получить представление об эволюции глаз и обнаружении света у животных. Последовательности для генов H.vulgaris и других видов, связанных с опсином, были извлечены в файл FASTA из NCBI GenBank. Гены опсина были выровнены в MEGA, что позволило идентифицировать опсины гидры, в которых отсутствовала аминокислота с сохраненным лизином, необходимая для связывания светочувствительной молекулы.Дерево максимальной вероятности было сгенерировано с использованием последовательностей опсина от Hydra vulgaris и других видов. Филогенез предполагает, что гены опсина развиваются путем специфических для линии дупликации у книдариев и, возможно, путем тандемной дупликации у H.vulgaris. Затем в edgeR был проведен дифференциальный экспрессионный анализ для исследования абсолютной экспрессии генов опсина.Чтобы определить, регулируется ли один или несколько опсинов в гипостоме или голове, были проведены парные сравнения гипостома с колонкой тела, зоной почкония, стопой и щупальцами. Было обнаружено, что 1 774 транскрипта были дифференциально выражены между гипостомой и колонкой тела. Были определены гены, которые регулировались в ходе нескольких сравнений, и было выполнено функциональное обогащение в Blast2GO.Наконец, абсолютная экспрессия генов опсина исследовалась в разных тканях на разных стадиях бутонации и в разные временные точки регенерации. Визуальный осмотр выравнивания и дерева подтвердит, принадлежат ли гены-кандидаты к интересующее семейство. Гены, которые слишком отличаются по последовательности или группе вне всего остального, вероятно, являются частью другого семейства генов.Результаты этого протокола можно считать гипотезообразующими. Этот конвейер может выделить гены-кандидаты для функционального изучения в будущих исследованиях. После изучения экспрессии опсина гидры мы теперь используем аналогичные методы для исследования родственных генов у разных видов, чтобы определить сходства и различия в функциях.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Молекулярная эволюция Tre рекомбиназы

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Подготовка первичных гемопоэтических клеточных культур из костного мозга мышей для Электропорация

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Использование генной Pulser MXcell Электропорация системы для трансфекции первичных элементов с высоким КПД

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Использование автоматизированных счетчиков сотовый для упрощения исследования экспрессии генов: миРНК Нокдаун ИЛ-4 зависимости экспрессии генов в клетках Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Парафин и замороженные Разделы Drosophila Мышцы взрослых

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

В пробирке восстановление активность Т. castaneum Теломераза

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Протокол для компьютерных Структура белка и функции прогнозирования

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Анализ глобальной РНК синтеза на уровне одной клетки следующем Гипоксия

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Измерение скорости обмена веществ в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; С помощью респирометрии

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Экспериментальные и биоинформатика Протокол Секвенирование РНК Анализы ФОТОПЕРИОДИЧЕСКИХ диапаузы в Азиатско тигровый комар,<em&gt; Кусака бело-пёстрый</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...