Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Agradecemos a Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad y Aline G. Rangel por su asesoramiento y orientación para incorporar algunos de estos pasos en nuestro flujo de trabajo. También estamos agradecidos a Katherine Williams, Elisabeth Rebboah y Natasha Picciani por los comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación médica de la Fundación George E. Hewitt para A.M.M.

Este protocolo sigue las pautas de cuidado de animales de UC Irvine.
1. Preparación de la biblioteca de ARN-seq
<ol><li>Aísle el ARN usando los métodos siguientes.<ol>
<li>Recoger muestras. Si el ARN se va a extraer en un momento posterior, congele la muestra o colótese en la solución de almacenamiento de ARN15 (Tabla de Materiales).</li>
		<li>Eutanasiar y diseccionar el organismo para separar tejidos de interés.</li>
		<li>Extraer el ARN total...

El propósito de este protocolo es proporcionar un contorno de los pasos para caracterizar a una familia del gene usando datos del ARN-seq. Se ha demostrado que estos métodos funcionan para una variedad de especies y conjuntos de datos4,34,35. La tubería establecida aquí se ha simplificado y debería ser lo suficientemente fácil como para ser seguida por un novato en bioinformática. La importancia del protocolo es que descr...

Los avances en las tecnologías de secuenciación han facilitado la secuenciación de genomas y transcriptomas de organismos no modelo. Además de la mayor viabilidad de secuenciar adn y ARN de muchos organismos, una gran cantidad de datos está disponible públicamente para estudiar genes de interés. El propósito de este protocolo es proporcionar pasos bioinformáticos para investigar la evolución molecular y la expresión de genes que pueden desempeñar un papel importante en el organismo de interés.
Investigar la evolución de un gen o familia de genes puede proporcionar información sobre la evolución de los sistemas biológicos. Los miembros de una familia de genes se determinan típicamente mediante la identificación de motivos conservados o secuencias de genes homólogos. La evolución de la familia génica se investigó previamente utilizando genomas de organismos modelo distantemente relacionados1. Una limitación a este enfoque es que no está claro cómo evolucionan estas familias de genes en especies estrechamente relacionadas y el papel de las diferentes presiones selectivas ambientales. En este protocolo, incluimos una búsqueda de homólogos en especies estrechamente relacionadas. Al generar una filogenia a nivel de filo, podemos observar tendencias en la evolución de la familia de genes como la de genes conservados o duplicaciones específicas de linaje. En este nivel, también podemos investigar si los genes son ortólogos o parálogos. Si bien es probable que muchos homólogos funcionen de manera similar entre sí, ese no es necesariamente el caso2. La incorporación de árboles filogenéticos en estos estudios es importante para determinar si estos genes homólogos son ortólogos o no. En los eucariotas, muchos ortólogos conservan funciones similares dentro de la célula, como lo demuestra la capacidad de las proteínas de mamíferos para restaurar la función de los ortólogos de levadura3. Sin embargo, hay casos en los que un gen no ortólogo realiza una función caracterizada4.
Los árboles filogenéticos comienzan a delinear las relaciones entre los genes y las especies, sin embargo, la función no se puede asignar únicamente en función de las relaciones genéticas. Los estudios de expresión génica combinados con anotaciones funcionales y análisis de enriquecimiento proporcionan un fuerte apoyo para la función génica. Los casos en los que la expresión génica se puede cuantificar y comparar entre individuos o tipos de tejidos pueden ser más reveladores de la función potencial. El siguiente protocolo sigue los métodos utilizados en la investigación de los genes de opsina en Hydra vulgaris7,pero se pueden aplicar a cualquier especie y cualquier familia de genes. Los resultados de tales estudios proporcionan una base para la investigación adicional en la función del gen y las redes del gene en organismos no-modelo. A modo de ejemplo, la investigación de la filogenia de las opsinas, que son proteínas que inician la cascada de fototransducción, da contexto a la evolución de los ojos y la detección de la luz8,9,10,11. En este caso, los organismos no modelo, especialmente las especies animales basales como los cnidarios o los ctenophores, pueden dilucidar la conservación o los cambios en la cascada de fototransducción y la visión a través de los clados12,13,14. Del mismo modo, la determinación de la filogenia, expresión y redes de otras familias de genes nos informará sobre los mecanismos moleculares subyacentes a las adaptaciones.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Destilar y reportar grandes conjuntos de datos, como datos de genoma completo o transcriptoma, es a menudo una tarea desalentadora. Una forma de desglosar los resultados es centrarse en una o más familias de genes que son importantes para el organismo y el estudio. En este protocolo, se describen los pasos bioinformáticos para generar una filogenia y cuantificar la expresión de genes de interés. Los árboles filogenéticos pueden dar una idea de cómo los genes están evolucionando dentro y entre las especies, así como revelar la ortología. Estos resultados se pueden mejorar utilizando datos de ARN-seq para comparar la expresión de estos genes en diferentes individuos o tejidos. Los estudios de evolución molecular y expresión pueden revelar modos de evolución y conservación de la función génica entre especies. La caracterización de una familia de genes puede servir como trampolín para futuros estudios y puede destacar una familia de genes importante en un nuevo genoma o transcriptoma.

Los métodos anteriores se resumen en la Figura 1 y se aplicaron a un conjunto de datos de tejidos de Hydra vulgaris. H. vulgaris es un invertebrado de agua dulce que pertenece al filo Cnidaria que también incluye corales, medusas y anémonas de mar. H. vulgaris puede reproducirse asexualmente por gemación y pueden regenerar su cabeza y pie cuando están divididos en dos. En este estudio, el objetivo fue investigar la evolución y expresión de los genes...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

El propósito de este protocolo es investigar la evolución y expresión de genes candidatos utilizando datos de secuenciación de ARN.

Una Tubería Bioinformática Para La Investigación De La Evolución Molecular Y La Expresión Génica Usando RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Este protocolo describe los pasos bioinformáticos para investigar la evolución molecular y la expresión de genes candidatos. Aquí proporcionamos instrucciones exhaustivas para que cualquier persona con una experiencia bioinformática mínima pueda ejecutar este protocolo. Esta tubería se puede aplicar a cualquier organismo y a cualquier familia de genes.Un problema común al hacer bioinformática es el error de los scripts de shell. Al intentar este protocolo, asegúrese de tener el software más actualizado, lea los archivos de error y revise el manual cuidadosamente. Para empezar, inicie sesión en la cuenta de clúster de equipos en una ventana de aplicación de terminal o PuTTY.En el terminal, descargue SRA Toolkit versión 2.8.1 usando Wget, luego termine de instalar el programa. Busque ncbi para el número de acceso SRA para las muestras deseadas, después obtenga los datos de la secuencia del ARN en la ventana terminal. Obtener dos archivos FASTQ para el tipo de archivos de extremo emparejado.Encuentre el genoma de referencia en línea si existe uno. Para obtener un ensamblado de referencia, escriba wget en la ventana de terminal y pegue la dirección del vínculo. Si está disponible, copie también el archivo GTF y el archivo FASTA de proteínas para el genoma de referencia.Indexe el genoma, luego mapee las lecturas y calcule la expresión para cada muestra. Cambie el nombre del archivo de resultados a algo descriptivo y genere una matriz de todos los recuentos. Abra una ventana del navegador de Internet y vaya a NCBI GenBank.En la barra de búsqueda, escriba el nombre del gen de interés y el nombre de las especies estrechamente relacionadas que han sido secuenciadas. A la izquierda de la barra de búsqueda, seleccione Proteína y, a continuación, haga clic en Buscar. Extraiga las secuencias haciendo clic en Enviar a y, a continuación, seleccione Archivo.En Formato, seleccione FASTA y, a continuación, haga clic en Crear archivo. Mueva el archivo FASTA de homólogos al clúster de equipos mediante una ventana de terminal local o FileZilla. A continuación, busque genes candidatos usando BLAST+En el clúster de computadoras, haga una base de datos BLAST a partir del genoma o la proteína traducida por transcriptoma, FASTA.BLAST las secuencias de genes homólogos de NCBI a la base de datos de las especies de interés, a continuación, ver el archivo de salida utilizando el comando más. Copie los identificadores de genes únicos de las especies de interés en un nuevo archivo de texto. Extraiga las secuencias de genes candidatos.Para confirmar la anotación de genes mediante Reciprocal BLAST, vaya a la herramienta de búsqueda de alineación local BLAST, seleccione BLASTP, luego pegue las secuencias candidatas, seleccione la base de datos de secuencias de proteínas no redundantes y haga clic en BLAST. Abra MEGA, haga clic en Alinear, luego en Editar alineación de compilación, seleccione Crear una nueva alineación y haga clic en Aceptar. Seleccione Proteína. Cuando se abra la ventana Alineación, haga clic en Editar.Haga clic en Insertar secuencias desde archivo y seleccione el FASTA con secuencias de proteínas de genes candidatos y homólogos probables. Seleccione Todas las secuencias. Encuentra el símbolo del brazo y pasa el cursor sobre él.Debe decir alinear secuencias usando algoritmo muscular. Haga clic en el símbolo del brazo y, a continuación, haga clic en Alinear proteína para alinear las secuencias Editar parámetros o haga clic en Aceptar para utilizar los parámetros predeterminados. Este protocolo se aplicó a los tejidos de Hydra vulgaris que es un invertebrado de agua dulce que pertenece al filo Cnidaria.Los genes opsinos fueron investigados para obtener información sobre la evolución de los ojos y la detección de luz en animales. Las secuencias para los genes opsina-relacionados de H.vulgaris y de otras especies fueron extraídas en un archivo de FASTA del NCBI GenBank. Los genes de opsina se alinearon en MEGA, lo que permite identificar las opsinas de Hydra a las que les faltaba un aminoácido de lisina conservado necesario para unirse a una molécula sensible a la luz.Se generó un árbol de máxima verosimilitud utilizando secuencias de opsina de Hydra vulgaris y otras especies. La filogenia sugiere que los genes de opsina están evolucionando por duplicaciones específicas del linaje en cnidarios, y potencialmente por duplicación en tándem en H.vulgaris. A continuación, se realizó un análisis de expresión diferencial en edgeR para investigar la expresión absoluta de los genes de opsina.Para determinar si una o más opsinas están reguladas en el hipostoma, o la cabeza, se realizaron comparaciones en pares de hipostoma versus la columna corporal, la zona en ciernes, el pie y los tentáculos. Fue encontrado que 1, 774 transcripciones fueron expresadas diferenciado entre el hypostome y la columna del cuerpo. Se determinaron los genes que se regularon a través de comparaciones múltiples, y se realizó un enriquecimiento funcional en Blast2GO.Finalmente, se investigó la expresión absoluta de los genes de la opsina en diferentes tejidos durante diferentes etapas de la brotación, y durante diferentes puntos de tiempo de regeneración. La inspección visual de la alineación y el árbol confirmará si los genes candidatos pertenecen a la familia de interés. Los genes que son demasiado diferentes en secuencia o un grupo fuera de todo lo demás, son probablemente parte de una familia de genes diferente.Los resultados de este protocolo se pueden considerar generadores de hipótesis. Esta tubería puede destacar los genes candidatos para estudiar funcionalmente en estudios futuros. Después de explorar la expresión de la opsina de Hydra, ahora estamos utilizando técnicas similares para investigar genes relacionados entre especies con el fin de identificar similitudes y diferencias en la función.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Evolución molecular de la recombinasa Tre

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Un protocolo para la estructura de la proteína por computadora y la función de predicción

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

La medición de la tasa metabólica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Mediante respirometría

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Un Experimental y Protocolo Bioinformática para análisis de ARN-ss de fotoperiódica diapausa en el Mosquito Tigre Asiático,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...