Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Vi tackar Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad och Aline G. Rangel för råd och vägledning när vi införlivar några av dessa steg i vårt arbetsflöde. Vi är också tacksamma mot Katherine Williams, Elisabeth Rebboah och Natasha Picciani för kommentarerna till manuskriptet. Detta arbete stöddes delvis av ett George E. Hewitt Foundation for Medical research fellowship till A.M.M.

Detta protokoll följer UC Irvine riktlinjer för djurvård.
1. RNA-seq biblioteksförberedelse
<ol><li>Isolera RNA med följande metoder.<ol>
<li>Samla in prover. Om RNA ska extraheras vid ett senare tillfälle, frys provet eller placera provet eller placera i RNA-lagringslösning15 (Materialförteckning).</li>
		<li>Avliva och dissekera organismen för att separera vävnader av intresse.</li>
		<li>Extrahera totalt RNA med hjälp av ett extraktionsk...

Syftet med detta protokoll är att ge en översikt över stegen för att karakterisera en genfamilj med hjälp av RNA-seq-data. Dessa metoder har visat sig fungera för en mängd olika arter och datamängder4,34,35. Den pipeline som upprättats här har förenklats och bör vara tillräckligt enkel för att följas av en nybörjare inom bioinformatik. Protokollets betydelse är att det beskriver alla steg och nödvändiga progra...

Framsteg inom sekvenseringsteknik har underlättat sekvensering av genom och transkriptomer av icke-modellorganismer. Förutom den ökade genomförbarheten av sekvensering av DNA och RNA från många organismer, är ett överflöd av data offentligt tillgängligt för att studera gener av intresse. Syftet med detta protokoll är att tillhandahålla bioinformatiska steg för att undersöka den molekylära evolutionen och uttrycket av gener som kan spela en viktig roll i organismen av intresse.
Att undersöka utvecklingen av en gen- eller genfamilj kan ge insikt i utvecklingen av biologiska system. Medlemmar av en genfamilj bestäms vanligtvis genom att identifiera bevarade motiv eller homologa gensekvenser. Genfamiljens evolution undersöktes tidigare med hjälp av genom från avlägset besläktade modellorganismer1. En begränsning av detta tillvägagångssätt är att det inte är klart hur dessa genfamiljer utvecklas i närbesläktade arter och rollen för olika miljöselektiva tryck. I detta protokoll inkluderar vi en sökning efter homologer i närbesläktade arter. Genom att generera en fylogeni på fylumnivå kan vi notera trender i genfamiljens utveckling som konserverade gener eller härstamning-specifika dubbleringar. På denna nivå kan vi också undersöka om gener är ortologer eller paraloger. Medan många homologer sannolikt fungerar på samma sätt som varandra, är det inte nödvändigtvis fallet2. Att införliva fylogenetiska träd i dessa studier är viktigt för att avgöra om dessa homologa gener är ortoologer eller inte. I eukaryoter behåller många ortologer liknande funktioner i cellen, vilket framgår av däggdjursproteinernas förmåga att återställa funktionen hos jästortologer3. Det finns dock fall där en icke-ortologisk gen utför en karakteriserad funktion4.
Fylogenetiska träd börjar avgränsa relationer mellan gener och arter, men funktionen kan inte tilldelas enbart baserat på genetiska relationer. Genuttrycksstudier i kombination med funktionella anteckningar och anrikningsanalys ger starkt stöd för genfunktionen. Fall där genuttryck kan kvantifieras och jämföras mellan individer eller vävnadstyper kan vara mer talande för potentiell funktion. Följande protokoll följer metoder som används för att undersöka opsingener i Hydra vulgaris7, men de kan tillämpas på alla arter och alla genarter. Resultaten av sådana studier utgör en grund för ytterligare undersökning av genfunktion och gennätverk i icke-modellorganismer. Som ett exempel ger undersökningen av fylogeni av opsiner, som är proteiner som initierar fototransduktionskaskaden, sammanhang till utvecklingen av ögon och ljusdetektering8,9,10,11. I detta fall kan icke-modellorganismer, särskilt basala djurarter som cnidarians eller ctenophores, klargöra bevarande eller förändringar i fototransduktionskaskaden och synen överkladderna 12,13,14. På samma sätt kommer bestämning av fylogeni, uttryck och nätverk av andra genfamiljer att informera oss om de molekylära mekanismerna bakom anpassningar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Destillering och rapportering av stora datamängder, till exempel hela genom- eller transkriptomdata, är ofta en skrämmande uppgift. Ett sätt att bryta ner resultat är att fokusera på en eller flera genfamiljer som är viktiga för organismen och studien. I detta protokoll beskriver vi bioinformatiska steg för att generera en fylogeni och kvantifiera uttrycket av gener av intresse. Fylogenetiska träd kan ge insikt i hur gener utvecklas inom och mellan arter samt avslöja ortologi. Dessa resultat kan förbättras med hjälp av RNA-seq data för att jämföra uttrycket av dessa gener i olika individer eller vävnader. Studier av molekylär evolution och uttryck kan avslöja utvecklingssätt och bevarande av genfunktionen mellan arter. Karakteriseringen av en genfamilj kan fungera som en språngbräda för framtida studier och kan lyfta fram en viktig genfamilj i ett nytt genom eller transkriptompapper.

Metoderna ovan sammanfattas i figur 1 och tillämpades på en datauppsättning Hydra vulgaris vävnader. H. vulgaris är ett sötvatten ryggradslösa djur som tillhör fylum cnidaria som också innehåller koraller, maneter och havsanemoner. H. vulgaris kan reproducera asexuellt genom att spira och de kan regenerera huvudet och foten när de är tudelade. I denna studie syftade vi till att undersöka utvecklingen och uttrycket av opsingener i Hydra</em...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Syftet med detta protokoll är att undersöka utvecklingen och uttrycket av kandidatgener med hjälp av RNA-sekvenseringsdata.

En bioinformatikpipeline för att undersöka molekylär evolution och genuttryck med RNA-seq

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Detta protokoll beskriver bioinformatiska steg för att undersöka molekylär evolution och uttryck av kandidatgener. Här ger vi noggranna instruktioner så att alla med minimal bioinformatisk erfarenhet kan köra igenom detta protokoll. Denna rörledning kan appliceras på alla organismer och alla genfamiljer.Ett vanligt problem när du gör bioinformatik är skalskript som misslyckas. När du försöker med det här protokollet kontrollerar du att du har den senaste programvaran, läser felfilerna och kontrollerar handboken noggrant. Börja med att logga in på datorklusterkontot i ett terminal- eller PuTTY-programfönster.På terminalen laddar du ner SRA Toolkit version 2.8.1 med Wget och slutför sedan installationen av programmet. Sök NCBI efter SRA-anslutningsnumret efter önskade prover och få sedan RNA-sekvensdata i terminalfönstret. Hämta två FASTQ-filer för parkopplingsfiltypen.Hitta referensgenomet online om det finns ett. Om du vill hämta en referens sammansättning skriver du wget i terminal fönstret och klistrar in länk adressen. Om tillgängligt, kopiera också GTF-filen och protein FAST-filen för referensgenomet.Indexera genomet, mappa sedan läsningar och beräkna uttryck för varje prov. Byt namn på resultatfilen till något beskrivande och generera en matris med alla antal. Öppna ett webbläsarfönster och gå till NCBI GenBank.Skriv namnet på den intressebesläktade genen och namnet på närbesläktade arter som har sekvenserats i sökfältet. Till vänster om sökfältet väljer du Protein och klickar sedan på Sök. Extrahera sekvenserna genom att klicka på Skicka till och välj sedan Arkiv.Välj FASTA under Format och klicka sedan på Skapa fil. Flytta FASTA-fil med homologer till datorklustret med hjälp av ett lokalt terminalfönster eller FileZilla. Sök sedan efter kandidatgener med BLAST+På datorklustret gör du en BLAST-databas från genomet eller transkriptomöversatt protein, FASTA.SPRÄNG de homologa gensekvenserna från NCBI till databasen över de arter som är av intresse och visa sedan utdatafilen med kommandot mer. Kopiera unika gen-ID:t från den intresseart som finns till en ny textfil. Extrahera sekvenserna av kandidatgener.Om du vill bekräfta genanteckningen med Reciprocal BLAST går du till BLAST Local Alignment Search Tool, väljer BLASTP och klistrar sedan in kandidatsekvenserna, markerar databasen för icke-redundant proteinsekvens och klickar på BLAST. Öppna MEGA, klicka på Justera, redigera sedan Byggjustering, välj Skapa en ny justering och klicka på OK. Välj Protein. När justeringsfönstret öppnas klickar du på Redigera.Klicka på Infoga sekvenser från fil och välj FASTA med proteinsekvenser av kandidatgener och troliga homologer. Välj Alla sekvenser. Hitta armsymbolen och hovra över den.Det borde stå justera sekvenser med hjälp av muskelalgoritm. Klicka på armsymbolen och klicka sedan på Justera protein för att justera sekvenserna Redigera parametrar eller klicka på OK för att använda standardparametrar. Detta protokoll tillämpades på vävnader av Hydra vulgaris som är ett sötvatten ryggradslösa djur som tillhör fylum Cnidaria.Opsin gener undersöktes för att få insikt i utvecklingen av ögon och ljusdetektering hos djur. Sekvenser för opsin-relaterade gener av H.vulgaris och andra arter extraherades i en FASTA fil från NCBI GenBank. Opsingenerna var inriktade i MEGA, vilket gjorde det möjligt att identifiera Hydra opsiner som saknade en bevarad lysin aminosyra som var nödvändig för att binda en ljuskänslig molekyl.Ett träd med maximal sannolikhet genererades med opsinsekvenser från Hydra vulgaris och andra arter. Fylogeni tyder på att opsin gener utvecklas av härstamning-specifika dupliceringar i cnidarians, och potentiellt genom tandem duplicering i H.vulgaris. Därefter utfördes en differentialuttryck analys i edgeR för att undersöka absolut uttryck av opsin gener.För att avgöra om en eller flera opsiner är uppreglerade i hypostom, eller huvud, par-wise jämförelser av hypostome kontra kroppen kolumn, spirande zon, fot och tentakler utfördes. Det konstaterades att 1 774 transkriptioner uttrycktes differentiellt mellan hypostom och kroppskolonnen. Generna som var uppreglerade över flera jämförelser fastställdes och en funktionell berikning i Blast2GO utfördes.Slutligen undersöktes det absoluta uttrycket av opsin gener i olika vävnader under olika stadier av spirande, och under olika tidpunkter för regenerering. Visuell inspektion av justeringen och trädet kommer att bekräfta om kandidatgener tillhör intressefamiljen. Gener som är för olika i följd eller en grupp utanför allt annat är förmodligen en del av en annan genfamilj.Resultat från detta protokoll kan betraktas som hypotesgenererande. Denna pipeline kan lyfta fram kandidatgener för att studera funktionellt i framtida studier. Efter att ha utforskat Hydra opsin-uttryck använder vi nu liknande tekniker för att undersöka relaterade gener över arter för att identifiera likheter och skillnader i funktion.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Molekylär evolution av Tre Recombinase

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Ett protokoll för datorbaserad proteiners struktur och funktion förutsägelse

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Mätning av ämnesomsättning i<em&gt; Drosophila</em&gt; Med respiration

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En experimentell och bioinformatik Protokoll för RNA-seq Analyser av fotoperiodisk diapaus i den asiatiska tigern Mosquito,<em&gt; Asiatisk tigermygga</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...