Name: a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq
Uploaded: 2021-05-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

Adriana Briscoe, Gil Smith, Rabi Murad ve Aline G. Rangel'e bu adımlardan bazılarını iş akışımıza dahil etme konusunda tavsiye ve rehberlik için teşekkür ederiz. Katherine Williams, Elisabeth Rebboah ve Natasha Picciani'ye de el yazması hakkındaki yorumları için minnettarız. Bu çalışma kısmen George E. Hewitt Tıbbi araştırma vakfı tarafından A.M.M.'ye desteklendi.

Bu protokol UC Irvine hayvan bakım yönergelerini izler.
1. RNA-seq kütüphane hazırlığı
<ol><li>Aşağıdaki yöntemleri kullanarak RNA'yı yalıtın.<ol>
<li>Örnekleri toplayın. RNA daha sonra çıkarılacaksa, numuneyi flaşla dondurun veya RNA depolama çözeltisi15'e (Malzeme Tablosu) yerleştirin.</li>
		<li>İlgi çekici dokuları ayırmak için organizmayı ötenazi ve diseksiyon.</li>
		<li>Bir ekstraksiyon kiti kullanarak toplam RNA'...

Bu protokolün amacı, RNA-seq verilerini kullanarak bir gen ailesini karakterize etmek için adımların bir özetini sağlamaktır. Bu yöntemlerin çeşitli türler ve veri kümeleri4 , 34,35için çalıştığı kanıtlanmıştır. Burada kurulan boru hattı basitleştirildi ve biyoinformatikte bir acemi tarafından takip edilebilecek kadar kolay olmalıdır. Protokolün önemi, yayımlanabilir bir analizi tamamlamak için t...

Sıralama teknolojilerindeki gelişmeler, model olmayan organizmaların genomlarının ve transkriptomlarının dizilimini kolaylaştırdı. Dna ve RNA'yı birçok organizmadan sıralamanın artan fizibilitesine ek olarak, ilgi genlerini incelemek için çok sayıda veri kamuya açıktır. Bu protokolün amacı, ilgi çekici organizmada önemli bir rol oynayabilecek genlerin moleküler evrimini ve ekspresyonunun araştırılması için biyoinformatik adımlar sağlamaktır.
Bir gen veya gen ailesinin evrimini araştırmak, biyolojik sistemlerin evrimi hakkında fikir verebilir. Bir gen ailesinin üyeleri tipik olarak korunmuş motifler veya homolog gen dizileri tanımlanarak belirlenir. Gen ailesi evrimi daha önce uzaktan ilişkili model organizmaların genomları kullanılarak araştırılmıştır1. Bu yaklaşımın bir sınırlaması, bu gen ailelerinin yakından ilişkili türlerde nasıl evrimleştiğinin ve farklı çevresel seçici baskıların rolünün açık olmamasıdır. Bu protokolde, yakından ilişkili türlerde homologlar için bir arayışa yer verdik. Fitülm düzeyinde bir filogeny üreterek, korunmuş genler veya soyuna özgü çoğaltmalar gibi gen ailesi evrimi eğilimlerini not edebiliriz. Bu seviyede genlerin ortolog mu yoksa paralog mu olduğunu da araştırabiliriz. Birçok homolog muhtemelen birbirine benzer şekilde işlev görürken, bu mutlaka durum2. Filogenetik ağaçların bu çalışmalara dahil edilerek bu homolog genlerin ortolog olup olmadığının çözülmesi önemlidir. Ökaryotlarda, birçok ortez, memeli proteinlerinin maya ortezlerinin işlevini geri kazanma yeteneğinin kanıt ettiği gibi hücre içinde benzer işlevleri korur3. Bununla birlikte, ortezsiz bir genin karakterize bir işlev4gerçekleştirdiği durumlar vardır.
Filogenetik ağaçlar genler ve türler arasındaki ilişkileri tanımlamaya başlar, ancak işlev sadece genetik ilişkilere göre atanamaz. Gen ekspresyon çalışmaları fonksiyonel ek açıklamalar ve zenginleştirme analizi ile birlikte gen fonksiyonu için güçlü destek sağlar. Gen ekspresyonunun ölçülebildiği ve bireyler veya doku tipleri arasında karşılaştırılabildiği durumlar potansiyel işlevin daha fazla anlatılması olabilir. Aşağıdaki protokol Hydra vulgaris7'deopsin genlerinin araştırılmasında kullanılan yöntemleri izler, ancak herhangi bir türe ve herhangi bir gen ailesine uygulanabilirler. Bu tür çalışmaların sonuçları, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonu ve gen ağları hakkında daha fazla araştırma için bir temel sağlar. Örnek olarak, fototransdüksiyon basamaklanmasını başlatan proteinler olan opsinlerin filogenisinin araştırılması, gözlerin evrimine ve ışık algılamaya bağlam verir 8,9,10,11. Bu durumda, model olmayan organizmalar özellikle cnidarians veya ctenophores gibi bazal hayvan türlerinin korunması veya fototransdüksiyon kaskadındaki değişiklikler ve clades12 , 13,14. Benzer şekilde, diğer gen ailelerinin filogeni, ifade ve ağlarının belirlenmesi, adaptasyonların altında kalan moleküler mekanizmalar hakkında bizi bilgilendirecektir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer-RNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1513</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster* 
			https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blast2GO (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.blast2go.com/b2g-register-basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>boost v. 1.57.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie v. 1.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://sourceforge.net/projects/bowtie-bio/files/bowtie/1.3.0/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computing cluster (highly recommended)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>NOTE: Analyses of genomic data are best done on a high-performance computing cluster because files are very large.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cufflinks v. 2.2.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>edgeR v. 3.26.8 (in R)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>In Rstudio 
			https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gcc v. 6.4.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java v. 11.0.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGA7 (on your PC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEGAX v. 0.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://www.megasoftware.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoSpin RNA II kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740955.5</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>perl 5.30.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>python</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R v.4.0.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://cran.r-project.org/src/base/R-4/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RSEM v. 1.3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software 
			https://deweylab.github.io/RSEM/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio v. 1.2.1335</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On local computer 
			https://rstudio.com/products/rstudio/download/#download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Samtools v. 1.3</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SRA Toolkit v. 2.8.1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STAR v. 2.6.0c</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/alexdobin/STAR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StringTie v. 1.3.4d</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder v. 5.5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimmomatic v. 0.35</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trinity v.2.8.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>On computer cluster 
			https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/releases</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TruSeq RNA Library Prep Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TURBO DNA-free Kit</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>AM1907</td>
			<td>wet lab materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*Downloads and installation on the computer cluster may require root access. Contact your network administrator.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a bioinformatics pipeline for investigating molecular evolution and gene expression using rna-seq

Tüm genom veya transkriptom verileri gibi büyük veri kümelerini damıtmak ve raporlamak genellikle göz korkutucu bir iştir. Sonuçları parçalamanın bir yolu, organizma için önemli olan bir veya daha fazla gen ailesine odaklanmak ve çalışmaktır. Bu protokolde, bir filogeni oluşturmak ve ilgi genlerinin ekspresyonunun ölçülmesi için biyoinformatik adımları özetliriz. Filogenetik ağaçlar, genlerin türler içinde ve arasında nasıl geliştiğine dair fikir verebilir ve ortolojiyi ortaya getirebilir. Bu sonuçlar, farklı bireylerde veya dokularda bu genlerin ekspresyonunun karşılaştırılması için RNA-seq verileri kullanılarak geliştirilebilir. Moleküler evrim ve ifade çalışmaları, türler arasındaki evrim ve gen fonksiyonunun korunması modlarını ortaya çıkarabilir. Bir gen ailesinin karakterizasyonu gelecekteki çalışmalar için bir sıçrama tahtası görevi görebilirsiniz ve yeni bir genom veya transkriptom kağıdında önemli bir gen ailesini vurgulayabilir.

Yukarıdaki yöntemler Şekil 1'de özetlenmiş ve Hydra vulgaris dokularının bir veri kümesine uygulanmıştır. H. vulgaris, mercanlar, denizanaları ve deniz anemonlarını da içeren phylum Cnidaria'ya ait tatlı su omurgasızıdır. H. vulgaris tomurcuklanarak aseksüel olarak üreyebilir ve ikiye ayrıştıklarında başlarını ve ayaklarını yenileyebilirler. Bu çalışmada, Hydra7'deopsin genlerinin evrimini v...

Watch this Scientific Journal Video about A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq at JoVE.com

A Bioinformatics Pipeline for Investigating Molecular Evolution and Gene Expression using RNA-seq

Bu protokolün amacı, RNA dizileme verilerini kullanarak aday genlerin evrimini ve ekspresyonunun araştırılmasıdır.

RNA-seq Kullanarak Moleküler Evrimi ve Gen ekspresyonını Araştırmak için Biyoinformatik Boru Hattı

Distilling and reporting large datasets, such as whole genome or transcriptome data, is often a daunting task. One way to break down results is to focus ...

Bu protokol, aday genlerin moleküler evrimini ve ekspresyonunun araştırılması için biyoinformatik adımları özetlemektedir. Burada, en az biyoinformatik deneyime sahip herkesin bu protokolden geçebilmesi için kapsamlı talimatlar sunuyoruz. Bu boru hattı herhangi bir organizmaya ve herhangi bir gen ailesine uygulanabilir.Biyoinformatik yaparken sık karşılaşılan bir sorun kabuk komut dosyalarının başarısız olmasıdır. Bu protokolü denerken, en güncel yazılıma sahip olduğunuzdan emin olun, hata dosyalarını okuyun ve kılavuzu dikkatlice kontrol edin. Başlamak için, terminal veya PuTTY uygulama penceresinde bilgisayar kümesi hesabında oturum açın.Terminalde, Wget kullanarak SRA Toolkit sürüm 2.8.1'i indirin, ardından programı yüklemeyi bitirin. İstenen örnekler için SRA katılım numarasını NCBI'de arayın, ardından terminal penceresinde RNA sıra verilerini alın. Eşleştirilmiş uç dosya türü için iki FASTQ dosyası edinin.Varsa, referans genomun çevrimiçi olduğunu bulun. Başvuru derlemesi elde etmek için, terminal penceresine wget yazın ve bağlantı adresini yapıştırın. Varsa, referans genom için GTF dosyasını ve protein FASTA dosyasını da kopyalayın.Genom dizin, sonra harita okur ve her örnek için ifade hesaplamak. Sonuç dosyasını açıklayıcı bir şeyle yeniden adlandırın ve tüm sayımların matrisini oluşturun. Bir internet tarayıcısı penceresi açın ve NCBI GenBank'a gidin.Arama çubuğuna, ilgi geninin adını ve sıralanmış yakından ilişkili türlerin adını yazın. Arama çubuğunun solunda Protein'i seçin ve Ara'yı tıklatın. Gönder'i tıklatıp Dosya'yı seçerek sıraları ayıklayın.Biçim'in altında FASTA'yı seçin ve Dosya Oluştur'u tıklatın. Yerel bir terminal penceresi veya FileZilla kullanarak FASTA homologues dosyasını bilgisayar kümesine taşıyın. Daha sonra, BLAST +Bilgisayar kümesinde kullanarak aday genleri arayın, genomdan veya transkriptom çevrilmiş protein FASTA'dan bir BLAST veritabanı yapın.NCBI'den ilgi çekici türlerin veritabanına homolog gen dizilerini BLAST, ardından komutu daha fazla kullanarak çıktı dosyasını görüntüleyin. İlgi çekici türlerden benzersiz gen kimliklerini yeni bir metin dosyasına kopyalayın. Aday genlerin dizilerini çıkarın.Karşılıklı BLAST kullanarak gen ek açıklamalarını onaylamak için BLAST Yerel Hizalama Arama Aracı'na gidin, BLASTP'yi seçin, sonra aday dizilerini yapıştırın, yedekli olmayan protein dizisi veritabanını seçin ve BLAST'ı tıklatın. MEGA'yı açın, Hizala'ya tıklayın, sonra Yapı Hizalamasını Düzenle'ye tıklayın, Yeni hizalama oluştur'u seçin ve Tamam'ı tıklatın. Protein'i seçin. Hizalama penceresi açıldığında Düzenle'yi tıklatın.Dosyadan Dizi Ekle'ye tıklayın ve aday genlerin protein dizileri ve olası homologlarla FASTA'yı seçin. Tüm sıralar'ı seçin. Kol sembolünü bulun ve üzerine gelin.Kas algoritması kullanarak dizileri hizala demeli. Kol sembolüne tıklayın ve sonra dizileri hizalamak için Proteini Hizala'yı tıklatın Parametreleri düzenle veya varsayılan parametreleri kullanmak için Tamam'ı tıklatın. Bu protokol, phylum Cnidaria'ya ait bir tatlı su omurgasızı olan Hydra vulgaris dokularına uygulanmıştır.Opsin genleri, hayvanlarda gözlerin evrimi ve ışık tespiti hakkında fikir edinmek için araştırıldı. H.vulgaris ve diğer türlerin opsin ile ilgili genleri için diziler NCBI GenBank'tan bir FASTA dosyasına çıkarıldı. Opsin genleri MEGA'da hizalandı, bu da ışığa duyarlı bir molekülü bağlamak için gerekli korunmuş bir lizin amino asidi eksik olan Hydra opsinlerini tanımlamayı mümkün hale getirdi.Hydra vulgaris ve diğer türlerden opsin dizileri kullanılarak maksimum olasılıklı bir ağaç oluşturuldu. Filogeneni, opsin genlerinin cnidarians'ta soyuna özgü tekrarlarla ve potansiyel olarak H.vulgaris'te tandem çoğaltma ile geliştiğini göstermektedir. Daha sonra, opsin genlerinin mutlak ekspresyonunun araştırılması için edgeR'de diferansiyel ekspresyon analizi yapıldı.Hipostome veya kafada bir veya daha fazla opsin'in yukarı doğru düzenlenip düzenlenmediğini belirlemek için, hipostom ile vücut kolonu, tomurcuklanma bölgesi, ayak ve dokunaçların çift yönlü karşılaştırmaları yapıldı. 1.774 transkriptin hipostom ve vücut sütunu arasında farklı şekilde ifade edildiği bulunmuştur. Birden fazla karşılaştırmada yukarı yönlü olarak düzenlenen genler belirlendi ve Blast2GO'da fonksiyonel bir zenginleştirme yapıldı.Son olarak, opsin genlerinin mutlak ekspresyosu, tomurcuklanmanın farklı aşamalarında ve farklı rejenerasyon zaman noktalarında farklı dokularda araştırılmıştır. Hizalama ve ağacın görsel incelemesi, aday genlerin ilgi ailesine ait olup olmadığını doğrulayacaktır. Sırayla çok farklı olan genler veya her şeyin dışında bir grup, muhtemelen farklı bir gen ailesinin parçasıdır.Bu protokolden elde edilen sonuçlar hipotez üreten olarak kabul edilebilir. Bu boru hattı, gelecekteki çalışmalarda işlevsel olarak çalışmak için aday genleri vurgulayabilir. Hydra opsin ekspresyonunu keşfettikten sonra, şimdi benzer teknikleri kullanarak türler arasındaki ilgili genleri araştırıyoruz.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cells, Genomes, and Evolution

SCIENTISTS IN ACTION

Molecular Evolution of the Tre Recombinase

Tre Recombinase Moleküler Evrim

Here we report the generation of Tre recombinase through directed, molecular evolution. Tre recombinase recognizes a pre-defined target sequence within ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Hazırlık Elektroporasyon murin Kemik İliği itibaren İlköğretim Hematopoetik Hücre Kültürleri

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Yüksek Verimli Primer Hücre Transfect Gen Verici MXcell Elektroporasyon Sistemi

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Gen İfadesi Çalışmaları basitleştirin Otomatik Hücre Sayıcı kullanma: Namalwa Hücreler IL-4 Bağımlı Gen İfadesi siRNA demonte

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Parafin ve Dondurulmuş Bölüm Drosophila Yetişkin Kaslar

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Active T. in vitro Sulandırma castaneum Telomeraz

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Bilgisayar Tabanlı Protein Yapısı ve İşlevi Tahmin Protokolü

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Ününüz Aşağıdaki Tek Hücre Düzeyinde Küresel RNA Sentezi Analizi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolik Oranı Ölçümü<em&gt; Drosophila</em&gt; Respirometrik kullanarak

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...