Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

مكرسة لذكرى الدكتور راينر سافريش.
يشعر المؤلفون بالامتنان بشكل خاص لخوسيه مانويل غارسيا فيردوغو وفيسنتي هيرانز بيريز على إجراء تجارب EM وتحليلها في مختبر البيولوجيا العصبية المقارنة، معهد كافانيليس للتنوع البيولوجي والبيولوجيا التطورية، جامعة فالنسيا، CIBERNED، فالنسيا، إسبانيا، والذي تم دعمه بتمويل بحثي من منحة بروميتيو لمجموعات أبحاث التميز PROMETEO/2019/075. بقية هذا العمل كان مدعوما من قبل ACA CELL التكنولوجيا الحيوية GmbH هايدلبرغ، ألمانيا.

تم الحصول على الموافقات الأخلاقية عند إجراء التجارب.
1. عزل خلايا الدم المحيطي البشري أحادية النوى (PBMNCs)
<ol><li>التأكد من أن جميع المتبرعين وقعوا على موافقة مستنيرة قبل سحب الدم وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.</li>
	<li>خذ 30 مل من الدم من المتبرعين الأصحاء من قبل الموظفين الطبيين...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

تعتمد طريقة إعادة برمجة الخلايا البشرية غير المعدلة وراثيا الموصوفة في هذا العمل على تنشيط الغشاء إلى النواة لآلات الإشارات (الآلات) وراء بروتين الغشاء البشري المرتبط ب GPI الذي يبدأ عملية التمايز مما يؤدي إلى توليد الجسم الحي السابق وتوسيع PSCs ذاتية التجديد التي يتم الحصول عليها من ال...

تطوير طرق أبحاث الخلايا الجذعية الأساسية وقبل السريرية يشجع التطبيق السريري للعلاجات القائمة على الخلايا الجذعية للأمراض العصبية. يعتمد هذا العلاج المحتمل بشكل حاسم على طريقة توليد الخلايا العصبية البشرية مما يؤدي إلى الانتعاش الوظيفي1.
الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) تجديد الذات وتفرق إلى خلايا عصبية جديدة طوال الحياة في عملية تسمى تكوين الأعصاب الكبار. فقط مناطق الدماغ المقيدة جدا تؤوي NSCs المختصة لتوليد الخلايا العصبية حديثي الولادة في مرحلة البلوغ. يمكن أن تؤدي هذه NSCs إلى خلايا عصبية ناضجة ، والتي تشارك في التعلم والذاكرة ، وبالتالي استبدال الخلايا العصبية المفقودة أو التالفة. لسوء الحظ، هذه NSCs موجودة بكميات محدودة وهذا التكوين العصبي المحدود ينخفض بسرعة خلال نمو الأحداث2. لذلك ، يجب النظر في مصادر أخرى للخلايا العصبية في هدف العلاج الخلوي.
من الصعب علاج الأمراض العصبية التنكسية باستخدام النهج الدوائية القياسية. وتستند استراتيجيات علاجية جديدة لاحتضان العديد من الاضطرابات العصبية التي لا يمكن عصبها على علاجات استبدال الخلايا من الأنسجة المريضة والمصابة. زرع NSC يمكن أن تحل محل الخلايا التالفة وتوفير آثار مفيدة. وتشمل المصادر الأخرى لاستبدال الخلايا العصبية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESC)، والتي تستمد من كتلة الخلية الداخلية من الكيسات الأريمية الثديية3، وكذلك iPSCs4، والتي لديها قدرة واسعة على التجديد الذاتي مثل ESCs وقادرة على التفريق إلى أنساب الخلايا المختلفة. ويمكن أيضا أن تنشأ NSCs عن طريق إعادة برمجة مباشرة من الخلايا الليفية البشرية تجنب الدولة متعددة القدرات5.
العلاج ببدائل الخلايا لا يزال يمثل مشكلة صعبة. على الرغم من أن ESC أو الجنين أو iPS يمكن أن يكون مصدرا لتوليد الخلايا العصبية لعلاج العديد من الأمراض العصبية غير القابلة للشفاء ، فإن استبدال خلايا SCs البالغة الذاتية للأنسجة التالفة هو بديل أفضل يتحايل على المخاوف المناعية والأخلاقية والسلامة.
تفعيل البروتين البشري المرتبط ب GPI عن طريق ربط الأجسام المضادة عبر الفوسفور من PLCа/PI3K/Akt/mTor/PTEN يبدأ متمايزة خلايا سلف الدم وتوليد الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs)6. هذه الخلايا تفرق في المختبر نحو الخلايا العصبية كما أكد عن طريق التحليل المجهري للإلكترون برايتفيلد والمناعة وانتقال الإلكترون (TEM).
في هذا العمل نقوم بوصف الجيل الخالي من المعدلات وراثيا من BD-PSCs وإعادة تمايزها بنجاح إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

تحدث العديد من الاضطرابات العصبية البشرية بسبب انحطاط الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ. بسبب القيود المفروضة في الاستراتيجيات الدوائية وغيرها من الاستراتيجيات العلاجية، لا يوجد حاليا علاج متاح للدماغ المصاب أو المريض. استبدال الخلايا يظهر كاستراتيجية علاجية واعدة للظروف العصبية. حتى يومنا هذا، تم إنشاء الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) بنجاح من أنسجة الجنين أو الخلايا الجنينية البشرية (ES) أو الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC). بدأت عملية التمايز عن طريق تفعيل البروتين الجليكوبروتين البشري المرتبط ب GPI ، والذي يؤدي إلى توليد خلايا جذعية متعددة القدرات. هذه الخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم (BD-PSCs) تفرق في المختبر إلى خلايا ذات النمط الظاهري العصبي كما هو مبين في المجهر الساطع والمناعة. يؤكد التحليل الهيكلي الفائق لهذه الخلايا عن طريق المجهر الإلكتروني بنيتها البدائية وكذلك مورفولوجيا تشبه الخلايا العصبية وخصائص دون الخلوية.

تقدم النتائج أدلة على أن هذه الطريقة الجديدة الخالية من جنرال موتورز قادرة على إعادة خلايا سلف الدم إلى حالتها الأكثر بدائية دون العمل مباشرة على الجينوم البشري.
لقد أظهرنا سابقا أن البروتين المرتبط ب GPI يبدأ الربط المتبادل بين الأجسام المضادة المحددة عبر PLCа/IP3K/Akt/mTOR/PTE...

Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

نحن نقدم طريقة خالية من المعدلة وراثيا (المعدلة وراثيا خالية) للحصول على الخلايا مع النمط الظاهري العصبية من خلايا الدم الطرفية المبرمجة. تنشيط مسار الإشارات المرتبطة بروتين الإنسان الجديد المرتبطة GPI يكشف عن طريقة فعالة خالية من المعدلة وراثيا للحصول على الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات.

الجيل الخالي من المعدلة وراثيا من الخلايا العصبية المشتقة من الدم

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

تعتمد أهمية البروتوكول على الغشاء إلى إشارات النواة ولا تؤثر بشكل مباشر على الجينوم ، كما هو الحال مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات. الطبيعة غير المسخية للخلايا الجذعية متعددة القدرات المشتقة من الدم هي الميزة الرئيسية لهذه التقنية ، مما يجعلها مناسبة للتطبيق السريري الآمن في مختلف مجالات الطب التجديدي. إثبات الإجراء هو الدكتور آن كاثرين شوت، رئيس المشروع، وأكسانا غريناكر، مساعد مختبر في مختبري.لعزل PBMNCs، أضف 25 ملليلتر من الدم الواحد إلى واحد المخفف مع PBS إلى 10 ملليلتر من وسائط التدرج الكثافة والطرد المركزي الخليط في 300 مرة G لمدة 30 دقيقة. عزل طبقة الواجهة بين البلازما ووسائط تدرج الكثافة عن طريق الأنابيب. اغسل الخلايا المعزولة بخمس ملليلترات من برنامج تلفزيوني معقم وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق.بعد تكرار الإجراء مرتين، عد عدد الخلايا باستخدام غرفة العد. إضافة 6 في 10 إلى الخلايا أحادية نووية 6 إلى أنبوب 15 ملليلتر، ثم أداء الأجسام المضادة عبر ربط عن طريق إضافة الأجسام المضادة البشرية المرتبطة GPI البروتين البروتين محددة إلى الخلايا في برنامج تلفزيوني مع 1٪ BSA واحتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد الربط المتبادل، استبدل وسيط الحضانة بمتوسط دولبيكو المعدل من إيسكوف المكمل بنسبة 10٪ FBS.تنمو الخلايا في 15 أنابيب البوليسترين ملليلتر عن طريق وضعها في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 8 إلى 10 أيام دون اهتزاز. في اليوم الخامس، أضف ملليلتر إضافي إلى ملليلترين من متوسط إيسكوف مع 10٪ FBS لكل أنبوب 15 ملليلتر. عد الخلايا المستزرعة مع غرفة العد.ثم الطرد المركزي تعليق الخلية من حوالي 5 في 10 إلى الخلايا 6 في 300 مرة G لمدة 10 دقائق ونسخ الناسخ الناتج مع ماصة باستور معقمة. Resuspend بيليه الخلية في 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني قبل تبريدها من pH 7.2 مع 0.5٪ BSA واثنين من EDTA ملليمولار. ثم أضف 80 ميكرولتر CD-45 حبات مغناطيسية إيجابية بحجم نانو إلى تعليق الخلية واحتضانها على الجليد لمدة 15 دقيقة.لغسل الخلايا، أضف ملليلترين من حاجز PBS وطارد مركزي بمعدل 300 مرة G لمدة 10 دقائق. إعادة إنفاق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS. غسل العمود مع 500 ميكرولتر من العازلة برنامج تلفزيوني المبردة مسبقا ووضعه في المجال المغناطيسي.ضع تعليق الخلية على العمود واغسله مرتين مع 500 ميكرولتر من مخزن PBS المؤقت. جمع الخلايا في المتوسطة إيسكوف تكملها مع 1٪ BSA وعد الخلايا في غرفة العد. وضع الأغطية الزجاجية في لوحات من أربعة آبار ومعطف لهم مع واحد إلى خمسة مخففة بولي-L-ornithine والمياه المقطرة مزدوجة.بعد احتضان الأغطية في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة، وغسلها بالماء المقطر مزدوجة. تذوب ببطء 0.5 إلى اثنين ملليغرام لكل ملليلتر من صفح وإضافته إلى الجزء العلوي من coverlips. احتضانها في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين، ثم إزالة صفح الزائدة عن طريق الأنابيب وإضافة N2 المتوسطة العصبية إلى أطباق الثقافة.الثقافة BD المستمدة CD-45 الخلايا السلبية في N2 المتوسطة على الأغطية الزجاجية المغلفة بالنعناع أورنيثين لمدة يومين في حاضنة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لبدء التمايز العصبي للخلايا التي ولدت BD حديثا. بعد ذلك ، تضع خلايا الثقافة في وسط التمايز العصبي ووضع اللوحات في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 16 يوما. إعداد مثبت مع 75 ملليلتر من الماء العقيم وأربعة غرامات من البارافورمالديهايد.أضف 10 هيدروكسيد الصوديوم الطبيعي حسب الحاجة مع التحريك حتى ينجلي الحل. إضافة خليط السكروز إلى الحل وitrate إلى درجة الحموضة 7.4 مع ستة حمض الهيدروكلوريك العادي. رفع مستوى الصوت إلى 100 ملليلتر مع الماء العقيم.بعد إزالة الوسائط من ثقافة الخلية ، احتضنها مثبتا قبل الحرب لمدة 15 دقيقة ، ثم تجاهل المثبت وغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. إضافة على الفور الطازجة 0.3٪ Triton-X الحل و permeabilize الخلايا لمدة خمس دقائق. غسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة حل حجب برنامج تلفزيوني و 5٪ BSA.منع الخلايا في درجة حرارة الغرفة على لوحة الروك لمدة ساعة واحدة. إعداد تخفيف مناسب للأجسام المضادة في 1٪ BSA PBS واحتضان الخلايا مع الأجسام المضادة على لوحة الروك لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لكل غسل.احتضان الخلايا مع DAPI وجبل coverlips مع وسائل الإعلام المتصاعدة للتصور في المجهر. تمت دراسة الجانب المورفولوجي للخلايا المتمايزة BD في الأيام الأولى والخامسة وال 10 ، مما يدل على اتجاه الاختفاء التدريجي للخلايا غير النشطة وتزايد عدد الخلايا الجديدة باطراد في الثقافة المنشطة. كانت الخلايا المتمايزة BD صغيرة وأظهرت خصائص الخلايا الأغرانية غير الناضجة ذات العضيات الأقل والنوى الكبيرة مع الكروماتين المكثف على غرار ESCs.تمت دراسة الخلايا لإعادة التمايز العصبي بعد زراعة الأطباق الثقافية المغلفة بالنعناع لمدة 30 يوما. في وقت مبكر من أربعة أيام، يمكن الكشف عن أول خلايا تشبه الخلايا العصبية مع هياكل متفرعة طويلة. تطورت معظم الخلايا الكروية الصغيرة إلى خلايا متفرعة ذات أشكال ممدودة أكبر ، مما يعني عملية نشطة نحو التمايز إلى أنساب الخلايا العصبية.أظهر جسم الخلية وعمليات الخلايا تعقيدا أعلى من الخلايا غير المتمايزة ، مما يمثل كثافة عالية من الشبكية الإنتوبلازمية الخام وحزم من خيوط أكتين. الخلايا المتنامية في وسائل الإعلام التمايز كثيرا ما أنشأت الاتصالات من خلية إلى خلية التي تنطوي على الجسم الخلوي، في حين أن البعض الآخر ينطوي على العمليات الخلوية بطريقة تشبه neurite. أكد تحليل الكيمياء المناعية الذي تم إجراؤه باستخدام أجسام مضادة محددة أن الخلايا المتمايزة BD قادرة على إعادة التمايز نحو أنساب الخلايا العصبية المختلفة ، بما في ذلك الخلايا الفلكية GFAP.هذه التقنية تجعل من الممكن إنشاء خلايا ذاتية غير مسخة قادرة على إعادة التمايز إلى خلايا الطبقة الجرثومية الثلاث ، مما يفتح فرصة جديدة في أبحاث الطب التجديدي.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية للجيل الثقافات متعلق بالخلايا العصبية التخصيب

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

جيل من الخلايا الجذعية العصبية من الأنسجة الجنينية البشرية المهملة القشرية

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

الفحص Neuroblast: والفحص للانشاء وإثراء خلايا متعلق بالخلايا العصبية السلف من التفريق العصبية الجذعية آله الخلية باستخدام التدفق الخلوي

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

الذهب Nanorod بمساعدة تحفيز البصري من الخلايا العصبية

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

التحفيز الكهربائي Transcranial المزمن وتسجيل إينتراكورتيكال في الفئران

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

التمايز العصبي من الخلايا الجذعية الجنينية الماوس في المختبر

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

في في المختبر إسفين شريحة التحضير لتقليد في اتصال الدائرة العصبية فيفو

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

إعداد الكبار Drosophila melanogaster لتصوير الدماغ كله أثناء السلوك والمحفزات الاستجابات

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...