Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
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献给雷纳·萨弗里希博士的记忆
作者特别感谢何塞·曼努埃尔·加西亚-韦尔杜戈和维森特·赫兰茨-佩雷斯在西班牙瓦伦西亚大学卡瓦尼耶生物多样性和进化生物学研究所比较神经生物学实验室进行EM实验和分析，该实验室得到了普罗梅蒂奥卓越研究团体PROMETEO/2019/075研究资助。这项工作的其余部分得到了德国海德堡ACA CELL生物技术有限公司的支持。

在进行实验时获得了伦理学的批准。
1. 分离人类外周血单核细胞（PBMNCs）
<ol><li>确保所有献血者在血液提取前签署知情同意书，以符合机构准则。</li>
	<li>根据标准协议，由训练有素的医务人员从健康献血者手中取出30兆L的血液。</li>
	<li>通过密度梯度介质隔离 PBMNC。使用 10 mL 的介质，25 mL 的 1：1 血液稀释磷酸盐缓冲盐水 （PBS），离心机在 300 x g 30 分钟。</li>
	<li>通...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

本工作中描述的非转基因人体细胞重新编程方法基于GPI链接的人类膜糖蛋白背后的信号机制的膜到细胞核活化，该机制启动分化过程，导致从非受操纵的人类外周血液中获取的自续PC 的体外 生成和扩展。这些细胞在适当的介质中培养时，能够重新分化成属于不同生殖层6的细胞。
本研究中提供的数据表明，在神经元分化介质中培养时，无转基因生成的...

基础和临床前干细胞研究方法的开发鼓励了基于干细胞的神经系统疾病疗法的临床应用。这种潜在的治疗关键取决于人类神经细胞的生成方法，导致功能恢复1。
神经干细胞（NSC）在称为成人神经生成的过程中，自更新并终生分化成新的神经元。只有非常有限的大脑区域才拥有 NSC，能够在成年后产生新生儿神经元。这种 NSC 可以产生成熟的神经元，这些神经元涉及学习和记忆，从而取代丢失或损坏的神经元。不幸的是，这些NSC存在数量有限，这种有限的神经发生在青少年发育过程中迅速减少2。因此，神经细胞的其他来源必须在细胞治疗目标中考虑。
退行性神经系统疾病难以使用标准药理学方法治愈。接受许多不动的神经系统疾病的新治疗策略基于疾病和受伤组织的细胞替代疗法。NSC移植可以取代受损的细胞，并提供有益的效果。神经细胞替代的其他来源包括人类胚胎干细胞（ESC），它来自哺乳动物胚泡3的内细胞质量，以及iPSC4，它们具有广泛的自我更新能力，如ESC，能够分化成不同的细胞谱系。NSC也可以通过直接重新编程从人类成纤维细胞产生，避免多能状态5。
细胞替代疗法仍然是一个具有挑战性的问题。虽然ESC、胎儿或iPS可以成为治疗许多不治之症的神经元细胞的来源，但自体成人SC细胞替代受损组织是规避免疫、伦理和安全问题的更好选择。
通过PLC+/PI3K/Akt/mTor/PTEN的磷酸化，通过抗体交叉链接激活人类GPI相关蛋白质，启动血液祖细胞的分化和血液衍生多能干细胞（BD-PSCs）6的生成。这些细胞通过亮场、免疫荧光和传输电子显微镜 （TEM） 分析确认，在体外向神经元细胞分化。
在这项研究中，我们描述了无转基因的BD-PSCs生成及其成功重新分化成具有神经元表型的细胞。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

许多人类神经系统疾病是由大脑中神经元和胶质细胞的退化引起的。由于药理学和其他治疗策略的限制，目前没有治疗受伤或患病的大脑的方法。细胞置换似乎是神经退行性疾病的有希望的治疗策略。时至今日，神经干细胞（NSC）已经成功地从胎儿组织、人类胚胎细胞（ES）或诱导多能干细胞（iPSC）中产生。通过激活新的人类GPI相关糖蛋白，导致多能干细胞的产生，启动了分化过程。这些血液衍生的多能干细胞（BD-PSCs） 在体外 分化成具有神经表型的细胞，亮场和免疫荧光显微镜就证明了这一点。通过电子显微镜对这些细胞进行超结构分析，证实了它们的原始结构以及神经元样形态和亚细胞特征。

研究结果证明，这种新型的无转基因方法能够将血液祖细胞恢复到最原始的状态，而无需直接作用于人类基因组。
我们之前已经表明，GPI链接蛋白特异性抗体交叉链接启动通过PLC+/IP3K/Akt/mTOR/PTEN对高度保存的发展相关基因，如WNT，NOTCH和C-Kit进行调节，从而启动分化过程，导致HSC的第一步，以及BD-PSc6，8的第二步和最后一代。<...

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GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

我们提出了一种无转基因（无转基因）的方法，从重新编程的周围血细胞中获取具有神经元表型的细胞。激活与新型人类GPI相关蛋白质相关的信号通路，揭示了获得人类多能干细胞的高效无转基因方法。

无转基因生成血液衍生神经元细胞

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

该协议的意义依赖于膜到核信号，并不直接影响基因组，就像诱导多能干细胞的情况一样。造血多能干细胞的非致畸性质是该技术的主要优势，适合在再生医学的各个领域进行安全的临床应用。项目负责人安妮-凯瑟琳·肖特博士和实验室实验室助理奥克萨娜·格林阿克演示了该程序。要分离 PBMNCs，将用 PBS 稀释的 25 毫升一对一血液添加到 10 毫升密度梯度介质中，并以 300 倍 G 离心 30 分钟。通过管道隔离等离子体和密度梯度介质之间的接口层。用5毫升无菌PBS和离心机用300倍G清洗分离的细胞10分钟。重复程序两次后，使用计数室计算细胞数。将6~10加入到15毫升管中的第6个单核细胞中，然后通过在PBS细胞中加入1%BSA的人类GPI连结膜蛋白特异性抗体，在37摄氏度下孵育30分钟，实现抗体交叉连接。交叉连接后，用伊斯科夫的改良杜尔贝科介质替换孵化介质，辅以 10% FBS。将细胞置于37摄氏度和5%的二氧化碳孵化器中，在8至10天内不摇晃，在15毫升聚苯乙烯管中生长。第五天，在每15毫升管中再加一到两毫升的Iscove介质，并补充10%的FBS。用计数室计算培养细胞。然后以300倍G为离心将大约5乘10的细胞悬浮到第6个细胞，10分钟，然后用无菌巴斯德移液器吸气产生的超高分子。将细胞颗粒重新沉浸在pH 7.2预冷却PBS的90微升中，使用0.5%BSA和2毫摩尔EDTA。然后在细胞悬浮物中加入80微升CD-45正纳米大小的磁珠，在冰上孵育15分钟。要清洗细胞，在 10 分钟内以 300 倍 G 的速度加入两毫升 PBS 缓冲器和离心机。将细胞重新悬浮在 PBS 缓冲器的 500 微升中。用500微升预冷却PBS缓冲器清洗柱子，并将其置于磁场中。将电池悬架放在柱子上，用 500 微升 PBS 缓冲器清洗两次。收集以 1%BSA 补充的 Iscove 中等单元中的细胞，并计算计数室中的细胞。将玻璃盖片放在四井板中，涂上一至五个稀释的多L-兽人及双蒸馏水。在37摄氏度下孵育盖片一小时后，用双蒸馏水清洗。每毫升层压素缓慢解冻0.5至2毫克，并将其添加到覆盖唇顶部。在37摄氏度下孵育它们两个小时，然后通过管道去除多余的层压素，并在培养皿中加入神经元介质N2。培养BD衍生的CD-45负细胞在N2介质层氨酸膜涂层玻璃盖片上两天，在37摄氏度的培养器中产生5%的二氧化碳，以启动新BD生成细胞的神经元分化。接下来，在神经元分化介质中培养细胞，并将板块放置在37摄氏度和5%二氧化碳的孵化器中16天。准备一个固定剂与75毫升的无菌水和4克副甲醛。根据需要加入10个正常的氢氧化钠搅拌，直到溶液清除。将蔗糖混合物加入溶液中，用六种普通盐酸将其酸分到pH 7.4。将体积达到 100 毫升，并配以无菌水。将介质从细胞培养物中去除后，用预热固定剂孵育15分钟，然后丢弃固定剂，每次洗3次细胞5分钟。立即添加新鲜制作的 0.3%Triton-X 溶液，使细胞渗透五分钟。用 PBS 洗三次，并添加 PBS 和 5%BSA 的阻塞解决方案。在室温下将细胞在摇摇盘上阻挡一小时。在 1%BSA PBS 中准备适当的抗体稀释，并在室温下用摇板上的抗体孵育细胞 1.5 小时。每次洗涤时用 PBS 清洗细胞三次，每次洗涤五分钟。用 DAPI 孵育细胞，并安装覆盖唇，在显微镜中安装安装介质进行可视化。BD分化细胞的形态方面在第一天、第五天和第十天进行了研究，显示出非活化细胞逐渐消失的趋势，活化培养中细胞的新种群稳步增长。BD分化细胞较小，显示出细胞细胞较少的不成熟原子核和与ESC相似的凝结色质大核的特征。细胞在层压涂层培养皿中培养30天后，被研究为神经再分化。早在四天之前，就可以检测到第一个具有长分支结构的神经元状细胞。大多数小球形细胞发育成具有较大拉长形状的分支细胞，这意味着一个向神经元血统分化的活跃过程。细胞体和细胞过程表现出比未分化的细胞更高的复杂性，呈现高密度的粗糙内质视网膜和成束的作用素丝。在分化介质中生长的细胞经常建立涉及细胞体的细胞对细胞接触，而其他细胞则以类似神经质的方式参与细胞过程。使用特定抗体进行的免疫化学分析证实，BD分化细胞能够重新分化各种神经元谱系，包括GFAP星形细胞。该技术使能够重新分化为所有三个生殖层细胞的自体非致病细胞成为可能，为再生医学研究开辟了新的机遇。

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