Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

Dedikeret til mindet om Dr. Rainer Saffrich.
Forfatterne er især taknemmelige for José Manuel García-Verdugo og Vicente Herranz-Pérez for at udføre EM-eksperimenter og analyser på Laboratoriet for Komparativ Neurobiologi, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, som blev støttet af forskningsmidler fra Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Resten af dette arbejde blev støttet af ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.

Der blev opnået etiske godkendelser ved udførelsen af forsøgene.
1. Isolering af humane perifere mononukleare blodceller (PBMNCs)
<ol><li>Sikre, at alle donorer underskrev informeret samtykke, før blodet trækker sig tilbage i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer.</li>
	<li>Tag 30 mL blod fra raske donorer af uddannet medicinsk personale i henhold til standardprotokollen.</li>
	<li>Isoler PBMNCs efter tæthedsgradientmedier. Brug 10 mL medier med 25 mL 1:1 blod fortyndet m...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

Den ikke-GM-metode til omprogrammering af menneskelige celler, der er beskrevet i dette arbejde, er baseret på membran til kerneaktivering af signalmaskiner bag GPI-forbundet humanmembran glycoprotein, der indleder den dedifferentiationsproces, der fører til ex vivo-generering og udvidelse af selvfornyende PSC'er opnået fra ikke-manipuleret humant perifert blod. Disse celler, når de dyrkes i passende medier, er i stand til at re-differentiere sig i celler, der tilhører forskellige kimlag6<...

Udvikling af grundlæggende og prækliniske stamcelleforskningsmetoder tilskynder til klinisk anvendelse af stamcellebaserede terapier til neurologiske sygdomme. En sådan potentiel terapi afhænger kritisk af metoden til generering af menneskelige neurale celler, der fører til funktionel genopretning1.
Neurale stamceller (NSC'er) selvfornyer og differentierer sig til nye neuroner gennem hele livet i en proces kaldet voksen neurogenese. Kun meget begrænsede hjerneområder har NSC'er, der er kompetente til at generere nyfødte neuroner i voksenalderen. Sådanne NSC'er kan give anledning til modne neuroner, som er involveret i læring og hukommelse og dermed erstatte tabte eller beskadigede neuroner. Desværre er disse NSC'er til stede i begrænsede mængder, og denne begrænsede neurogenese falder hurtigt under ungdomsudvikling2. Derfor skal andre kilder til neurale celler overvejes i et celleterapimål.
Degenerative neurologiske sygdomme er vanskelige at helbrede ved hjælp af standard farmakologiske tilgange. Nye terapeutiske strategier for at omfavne mange uigennemsigelige neurologiske lidelser er baseret på celle udskiftning behandlinger af syge og sårede væv. NSC-transplantation kan erstatte beskadigede celler og give gavnlige virkninger. Andre kilder til neurale celle udskiftning omfatter menneskelige embryonale stamceller (ESC), som er afledt af den indre cellemasse af pattedyr blastocyster3, samt iPSCs4, som har omfattende selvfornyelse kapacitet som ESC'er og er i stand til at differentiere i forskellige celle afstamning. NSC'er kan også genereres ved direkte omprogrammering fra menneskelige fibroblaster, der undgår pluripotent tilstand5.
Celleerstatningsterapi er stadig et udfordrende problem. Selvom ESC, føtal, eller iPS kan være en kilde til generation af neuronale celler til behandling af mange uhelbredelige neurologiske sygdomme, autologe voksne SCS celle udskiftning af beskadigede væv er et bedre alternativ, der omgår immunologiske, etiske og sikkerhedsmæssige betænkeligheder.
Aktivering af humant GPI-forbundet protein ved antistofkrydsning via fosforylering af PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN indleder en dedifferentiering af blod stamceller og generering af blod-afledte pluripotente stamceller (BD-PSC)6. Disse celler differentierer in vitro mod neuronale celler som bekræftet ved hjælp af brightfield, immunfluorescens og transmission elektronmikroskopi (TEM) analyse.
I dette arbejde beskriver vi gm-fri generation af BD-PSCs og deres vellykkede re-differentiering i celler med neuronal fænotype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

Mange menneskelige neurologiske lidelser er forårsaget af degeneration af neuroner og gliaceller i hjernen. På grund af begrænsninger i farmakologiske og andre terapeutiske strategier, er der i øjeblikket ingen kur til rådighed for den sårede eller syge hjerne. Celle udskiftning fremstår som en lovende terapeutisk strategi for neurodegenerative tilstande. Den dag i dag er neurale stamceller (NSC'er) med succes blevet genereret fra fostervæv, menneskelige embryonale celler (ES) eller inducerede pluripotente stamceller (iPSC). En proces med dedifferentiering blev indledt ved aktivering af det nye menneskelige GPI-forbundet glycoprotein, som fører til generering af pluripotente stamceller. Disse blod-afledte pluripotente stamceller (BD-PSCs) differentiere in vitro i celler med en neural fænotype som vist ved brightfield og immunofluorescens mikroskopi. Ultrastrukturel analyse af disse celler ved hjælp af elektronmikroskopi bekræfter deres primitive struktur samt neuronal-lignende morfologi og subcellulære egenskaber.

Resultaterne giver bevis for, at denne nye GM-fri metode er i stand til at vende blod stamceller til deres mest primitive tilstand uden direkte at handle på det menneskelige genom.
Vi har tidligere vist, at GPI-forbundet proteinspecifikt antistofkrydslinking indledes via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN-opregulering af stærkt bevarede udviklingsrelevante gener som WNT, NOTCH og C-Kit, hvilket indleder en dedifferentiationsproces, der fører til det første skridt til gener af HSC'er og en a...

Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Vi præsenterer en genetisk modificeret-fri (GM-fri) metode til at opnå celler med en neuronal fænotype fra omprogrammerede perifere blodlegemer. Aktivering af en signalvej, der er knyttet til nyt humant GPI-forbundet protein, afslører en effektiv GM-fri metode til at opnå menneskelige pluripotente stamceller.

GM-fri generation af blod-afledte neuronale celler

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Betydningen af protokollen er afhængig af membran til kernen signalering og ikke direkte påvirker genomet, som det er tilfældet med induceret pluripotente stamceller. Den ikke-teratogene karakter af blod-afledte pluripotente stamceller er den største fordel ved teknikken, hvilket gør den velegnet til sikker klinisk anvendelse inden for forskellige områder af regenerativ medicin. Demonstration af proceduren er Dr.Anne-Kathrin Schott, projektleder, og Oksana Greenacre, en lab assistent i mit laboratorium.For at isolere PBMNCs tilsættes 25 milliliter en-til-en blod fortyndet med PBS til 10 milliliter tæthedsgradientmedier og centrifuge blandingen ved 300 gange G i 30 minutter. Isoler grænsefladelaget mellem plasmaet og massefyldegradientmediet ved pipettering. Vask de isolerede celler med fem milliliter steril PBS og centrifuge ved 300 gange G i 10 minutter.Når du har gentaget proceduren to gange, skal du tælle antallet af celler ved hjælp af et tællekammer. Tilsæt 6 x 10 til de 6. mononukleare celler til et 15 milliliter rør, udfør derefter antistofkrydskobling ved at tilføje humant GPI-forbundet membranproteinspecifikt antistof til cellerne i PBS med 1%BSA og inkubere i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Efter krydskoblingen skal inkubationsmediet erstattes med Iskoves modificerede Dulbeccos medium suppleret med 10% FBS.Vokse cellerne i 15 milliliter polystyren rør ved at placere dem i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 8 til 10 dage uden at ryste. På den femte dag tilsættes yderligere 1-2 milliliter Iscove's Medium suppleret med 10% FBS til hvert 15 milliliter rør. Tæl de kultiverede celler med et tællekammer.Derefter centrifugeres celleaffjedringen på ca. 5 x 10 til 6. celler ved 300 gange G i 10 minutter og aspirerer den resulterende supernatant med en steril Pasteur pipette. Genbrug cellepillen i 90 mikroliter af forkølet PBS af pH 7,2 med 0,5%BSA og to millimolar EDTA. Derefter tilsættes 80 mikroliter CD-45 positive nano-størrelse magnetiske perler til celle suspension og inkubere på is i 15 minutter.For at vaske cellerne tilsættes to milliliter PBS-buffer og centrifuge ved 300 gange G i 10 minutter. Genbrug cellerne i 500 mikroliter af PBS buffer. Vask kolonnen med 500 mikroliter af forkølet PBS buffer og læg den i magnetfeltet.Sæt celleaffjedringen på kolonnen og vask den to gange med 500 mikroliter PBS-buffer. Indsaml cellerne i Iskovves mellemmedie suppleret med 1%BSA, og tæl cellerne i tællekammeret. Placer glasovertræk i fire-brønds plader og pels dem med en til fem fortyndet poly-L-ornitin og dobbelt destilleret vand.Efter inkubation af coverslips ved 37 grader Celsius i en time, vask dem med dobbelt destilleret vand. Tø langsomt 0,5 til to milligram pr. milliliter laminin og tilsæt det til toppen af coverslips. Inkuber dem ved 37 grader Celsius i to timer, fjern derefter overskydende laminin ved pipetter og tilsæt neuronalt medium N2 til kulturretterne.Kultur BD-afledte CD-45 negative celler i N2 medium på laminin ornitin-belagt glas coverlips i to dage i en inkubator med 5% kuldioxid ved 37 grader Celsius for at indlede en neuronal differentiering af nyligt BD genererede celler. Dernæst kulturceller i neuronal differentiering medium og placere pladerne i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid i 16 dage. Forbered et fiksativ med 75 milliliter sterilt vand og fire gram paraformaldehyd.Der tilsættes 10 normale natriumhydroxid efter behov under omrøring, indtil opløsningen er ryddet. Der tilsættes saccharoseblanding til opløsningen, og den titreres til pH 7.4 med seks normale saltsyrer. Bring volumen til 100 milliliter med sterilt vand.Efter at have fjernet medier fra cellekulturen, inkuber det med prewarm fixative i 15 minutter, kassér derefter fikseringssættet og vask cellerne tre gange i fem minutter hver. Tilsæt straks en frisklavet 0,3%Triton-X-opløsning og gennemtræng cellerne i fem minutter. Vask tre gange med PBS og tilsæt en blokeringsopløsning af PBS og 5%BSA.Bloker cellerne ved stuetemperatur på en rockerplade i en time. Forbered en passende fortynding af antistoffer i 1%BSA PBS og inkuber cellerne med antistofferne på en vippeplade i 1,5 timer ved stuetemperatur. Vask cellerne tre gange med PBS i fem minutter pr. vask.Inkuber cellerne med DAPI, og monter coverlips med monteringsmedier til visualisering i et mikroskop. Det morfologiske aspekt af BD-dedifferentierede celler blev undersøgt på dag et, fem og 10, hvilket viser en tendens til gradvis forsvinden af ikke-aktiverede celler og en støt voksende ny population af celler i aktiveret kultur. BD-dedifferentierede celler var små og viste egenskaberne ved umodne agranylceller med mindre organeller og store kerner med kondenseret kromatin svarende til ESC'er.Celler blev undersøgt for neuro re-differentiering efter dyrkning i laminin-belagt kultur retter i 30 dage. Så tidligt som fire dage kunne de første neuronale-lignende celler med lange forgreningsstrukturer detekteres. De fleste små sfæriske celler udviklede sig til forgrenede celler med større aflange former, hvilket indebærer en aktiv proces mod differentiering til neuronale afstamninger.Cellernes cellekrop og processer viste en højere kompleksitet end udifferentierede celler, hvilket præsenterede en høj tæthed af ru endoplasmisk reticulum og bundter af actin filamenter. Celler vokser i differentiering medier ofte etableret celle-til-celle kontakter, der involverer den cellulære krop, mens andre involverede cellulære processer i neurite-lignende måde. Immunokemistry analyse udført ved hjælp af specifikke antistoffer bekræftet, at BD dedifferentiated celler er i stand til at re-differentiering mod forskellige neuronale afstamninger, herunder GFAP astrocytter.Denne teknik gør det muligt at skabe autologe ikke-teratogene celler, der er i stand til at re-differentiere sig i celler i alle tre kimlag, hvilket åbner nye muligheder i regenerativ medicinforskning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den neuroblast Assay: Et assay for generering og berigelse af neuronale progenitorceller fra Differentiering neural stamcelle Afkom anvendelse af flowcytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Hurtig Mikro-iontophoresis af glutamat og GABA: et nyttigt redskab til Undersøge Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Guld nanorod-assisteret Optisk Stimulation af neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk transkranial elektrisk Stimulation og Intracortical optagelse i rotter

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Forberedelse til efterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Forberedelse voksen Drosophila melanogaster til hele hjernen Imaging under adfærd og Stimuli Svar

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...