Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

Opgedragen aan de nagedachtenis van Dr. Rainer Saffrich.
De auteurs zijn josé Manuel García-Verdugo en Vicente Herranz-Pérez bijzonder dankbaar voor het uitvoeren van EM-experimenten en -analyses in het Laboratorium voor Vergelijkende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, Universiteit van Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanje, dat werd ondersteund door onderzoeksfinanciering van de Prometeo Grant for Excellence Onderzoeksgroepen PROMETEO/2019/075. De rest van dit werk werd ondersteund door ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Duitsland.

Ethische goedkeuringen werden verkregen bij het uitvoeren van de experimenten.
1. Isolatie van menselijke perifere bloedmononucleaire cellen (PBMNCs)
<ol><li>Zorg ervoor dat alle donoren geïnformeerde toestemming hebben ondertekend voordat het bloed zich terugtrok in overeenstemming met de institutionele richtlijnen.</li>
	<li>Neem 30 ml bloed van gezonde donoren door opgeleid medisch personeel volgens het standaardprotocol.</li>
	<li>Isoleer PBMNCs op dichtheidsgradiëntmedia. Gebruik 10 m...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

De niet-GM-methode voor het herprogrammeren van menselijke cellen die in dit werk wordt beschreven, is gebaseerd op membraan-naar-kernactivering van signaleringsmachines achter het GPI-gebonden menselijke membraanglycoproteïne dat het proces van dedifferentiatie initieert dat leidt tot de ex vivo generatie en uitbreiding van zelfvernieuwende PSC's verkregen uit niet-gemanipuleerd menselijk perifeer bloed. Deze cellen kunnen, wanneer ze in geschikte media worden gekweekt, opnieuw differentiëren in cellen die to...

De ontwikkeling van basis- en preklinische stamcelonderzoeksmethoden stimuleert de klinische toepassing van stamcelgebaseerde therapieën voor neurologische ziekten. Een dergelijke potentiële therapie hangt kritisch af van de methode voor het genereren van menselijke neurale cellen die leidt tot functioneel herstel1.
Neurale stamcellen (NSC's) vernieuwen zichzelf en differentiëren zich gedurende het hele leven in nieuwe neuronen in een proces dat volwassen neurogenese wordt genoemd. Alleen zeer beperkte hersengebieden herbergen NSC's die bevoegd zijn om pasgeboren neuronen op volwassen leeftijd te genereren. Dergelijke NSC's kunnen aanleiding geven tot volwassen neuronen, die betrokken zijn bij leren en geheugen, waardoor verloren of beschadigde neuronen worden vervangen. Helaas zijn deze NSC's in beperkte hoeveelheden aanwezig en neemt deze beperkte neurogenese snel af tijdens de ontwikkeling van de juvenieleontwikkeling 2. Daarom moeten andere bronnen van neurale cellen worden overwogen in een celtherapiedoelstelling.
Degeneratieve neurologische ziekten zijn moeilijk te genezen met behulp van standaard farmacologische benaderingen. Nieuwe therapeutische strategieën voor het omarmen van veel immedicable neurologische aandoeningen zijn gebaseerd op celvervangende therapieën van ziek en gewond weefsel. NSC-transplantatie kan beschadigde cellen vervangen en gunstige effecten hebben. Andere bronnen voor neurale celvervanging zijn menselijke embryonale stamcellen (ESC), die zijn afgeleid van de binnencelmassa van zoogdierblastocysten3, evenals iPSC's4, die een uitgebreid zelfvernieuwingsvermogen hebben zoals ESC's en in staat zijn om zich te onderscheiden in verschillende cellijnen. NSC's kunnen ook worden gegenereerd door directe herprogrammering van menselijke fibroblasten die pluripotente toestand vermijden5.
Celvervangingstherapie is nog steeds een uitdagend probleem. Hoewel ESC, foetale of iPS een bron kan zijn voor het genereren van neuronale cellen voor de behandeling van veel ongeneeslijke neurologische ziekten, is autologe volwassen SCs-celvervanging van beschadigde weefsels een beter alternatief dat immunologische, ethische en veiligheidsproblemen omzeilt.
Activering van humaan GPI-gebonden eiwit door antilichaam-crosslinking via fosforylering van PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initieert een dedifferentiatie van bloedvoorlopercellen en degeneratie van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's)6. Deze cellen onderscheiden in vitro naar neuronale cellen zoals bevestigd door middel van brightfield, immunofluorescentie en transmissie elektronenmicroscopie (TEM) analyse.
In dit werk beschrijven we de GM-vrije generatie van BD-PSC's en hun succesvolle herdifferentiatie in cellen met neuronaal fenotype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

Veel menselijke neurologische aandoeningen worden veroorzaakt door degeneratie van neuronen en gliacellen in de hersenen. Vanwege beperkingen in farmacologische en andere therapeutische strategieën is er momenteel geen remedie beschikbaar voor de gewonde of zieke hersenen. Celvervanging verschijnt als een veelbelovende therapeutische strategie voor neurodegeneratieve aandoeningen. Tot op de dag van vandaag zijn neurale stamcellen (NSC's) met succes gegenereerd uit foetale weefsels, menselijke embryonale cellen (ES) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC). Een proces van dedifferentiatie werd geïnitieerd door activering van het nieuwe menselijke GPI-gebonden glycoproteïne, wat leidt tot de generatie van pluripotente stamcellen. Deze van bloed afgeleide pluripotente stamcellen (BD-PSC's) onderscheiden in vitro in cellen met een neuraal fenotype, zoals blijkt uit brightfield- en immunofluorescentiemicroscopie. Ultrastructurele analyse van deze cellen door middel van elektronenmicroscopie bevestigt hun primitieve structuur, neuronale morfologie en subcellulaire kenmerken.

De resultaten leveren bewijs dat deze nieuwe GM-vrije methode in staat is om bloed voorlopercellen terug te brengen naar hun meest primitieve toestand zonder direct in te werken op het menselijk genoom.
We hebben eerder aangetoond dat GPI-gebonden eiwitspecifieke antilichaam crosslinking initieert via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulatie van sterk geconserveerde ontwikkelingsrelevante genen zoals WNT, NOTCH en C-Kit, waardoor een proces van dedifferentiatie wordt gestart dat leidt tot...

Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

We presenteren een genetisch gemodificeerde vrije (GM-vrije) methode om cellen met een neuronaal fenotype te verkrijgen uit geherprogrammeerde perifere bloedcellen. Activering van een signaleringsroute gekoppeld aan nieuwe menselijke GPI-gebonden eiwitten onthult een efficiënte GM-vrije methode voor het verkrijgen van menselijke pluripotente stamcellen.

GM-vrije generatie van bloed-afgeleide neuronale cellen

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

De betekenis van het protocol is afhankelijk van membraan-naar-kernsignalering en heeft geen directe invloed op het genoom, zoals het geval is bij geïnduceerde pluripotente stamcellen. Het niet-teratogene karakter van van bloed afgeleide pluripotente stamcellen is het belangrijkste voordeel van de techniek, waardoor het geschikt is voor veilige klinische toepassing op verschillende gebied van regeneratieve geneeskunde. Dr.Anne-Kathrin Schott, projectleider, en Oksana Greenacre, een laboratoriumassistent in mijn laboratorium, demonstreren de procedure.Om PBMNC's te isoleren, voegt u 25 milliliter een-op-een bloed verdund met PBS toe aan 10 milliliter dichtheidsgradiëntmedia en centrifugeert u het mengsel gedurende 30 minuten op 300 maal G. Isoleer de interfacelaag tussen het plasma en de dichtheidsgradiëntmedia door pipetten. Was de geïsoleerde cellen gedurende 10 minuten met vijf milliliter steriel PBS en centrifugeer op 300 maal G.Nadat u de procedure twee keer hebt herhaald, telt u het aantal cellen met behulp van een telkamer. Voeg 6 bij 10 toe aan de 6e mononucleaire cellen aan een buis van 15 milliliter en voer vervolgens antilichaam cross-linking uit door menselijk GPI-gebonden membraaneiwitspecifiek antilichaam toe te voegen aan de cellen in PBS met 1%BSA en gedurende 30 minuten te broeden bij 37 graden Celsius. Vervang na de cross-linking incubatiemedium door Iscove's Modified Dulbecco's Medium aangevuld met 10%FBS.Kweek de cellen in 15 milliliter polystyreen buizen door ze 8 tot 10 dagen zonder schudden in een incubator op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide te plaatsen. Voeg op de vijfde dag nog eens één tot twee milliliter Iscove's Medium aangevuld met 10% FBS toe aan elke tube van 15 milliliter. Tel de gekweekte cellen met een telkamer.Centrifugeer vervolgens de celsuspensie van ongeveer 5 bij 10 naar de 6e cellen bij 300 keer G gedurende 10 minuten en aspireer het resulterende supernatant met een steriele Pasteur pipet. Resuspend de celkorrel in 90 microliter voorgekoeld PBS van pH 7,2 met 0,5% BSA en twee millimolar EDTA. Voeg vervolgens 80 microliters CD-45 positieve nano-formaat magnetische kralen toe aan de celsuspensie en incubeer gedurende 15 minuten op ijs.Om de cellen te wassen, voegt u twee milliliter PBS-buffer toe en centrifugeert u gedurende 10 minuten op 300 maal G. Resuspend de cellen in 500 microliters PBS buffer. Was de kolom met 500 microliters voorgekoelde PBS-buffer en plaats deze in het magnetisch veld.Plaats de celsuspensie op de kolom en was deze twee keer met 500 microliters PBS-buffer. Verzamel de cellen in Iscove's Medium aangevuld met 1%BSA en tel de cellen in de telkamer. Leg glasdeksels in vier-put platen en bedek ze met één tot vijf verdunde poly-L-ornithine en dubbel gedestilleerd water.Na het incuberen van de deklips op 37 graden Celsius gedurende een uur, was ze met dubbel gedestilleerd water. Ontdooi langzaam 0,5 tot twee milligram per milliliter lag en voeg het toe aan de bovenkant van de coverslips. Incubeer ze twee uur lang op 37 graden Celsius, verwijder vervolgens overtollige lag door pipetten en voeg neuronaal medium N2 toe aan de kweekgerechten.Kweek BD-afgeleide CD-45 negatieve cellen in N2 medium op laminine ornithine-gecoate glas coverslips gedurende twee dagen in een incubator met 5% kooldioxide bij 37 graden Celsius om een neuronale differentiatie van nieuw BD gegenereerde cellen te initiëren. Vervolgens, kweekcellen in neuronale differentiatie medium en plaats de platen in een incubator op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide gedurende 16 dagen. Bereid een fixatief met 75 milliliter steriel water en vier gram paraformaldehyde.Voeg indien nodig 10 normale natriumhydroxide toe met roeren tot de oplossing op is. Voeg sacharosemengsel toe aan de oplossing en titreer het tot pH 7,4 met zes normaal zoutzuur. Breng het volume met steriel water op 100 milliliter.Nadat u media uit de celkweek hebt verwijderd, incubeert u deze gedurende 15 minuten met prewarm fixatief, gooit u het fixatief weg en wast u de cellen elk drie keer gedurende vijf minuten. Voeg onmiddellijk een vers gemaakte 0,3%Triton-X oplossing toe en doorleef de cellen gedurende vijf minuten. Was drie keer met PBS en voeg een blokkeeroplossing van PBS en 5%BSA toe.Blokkeer de cellen bij kamertemperatuur op een tuimelplaat gedurende een uur. Bereid een geschikte verdunning van antilichamen in 1%BSA PBS en incubeer de cellen met de antilichamen op een tuimelplaat gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur. Was de cellen driemaal met PBS gedurende vijf minuten per wasbeurt.Incubeer de cellen met DAPI en monteer de coverslips met montagemedia voor visualisatie in een microscoop. Het morfologische aspect van BD-gedifferentieerde cellen werd bestudeerd op dag één, vijf en 10, wat een trend van geleidelijke verdwijning van niet-geactiveerde cellen en een gestaag groeiende nieuwe populatie cellen in geactiveerde cultuur aantoont. BD-gedifferentieerde cellen waren klein en vertoonden de kenmerken van onrijpe agranulaire cellen met minder organellen en grote kernen met gecondenseerde chromatine vergelijkbaar met ESC's.Cellen werden bestudeerd voor neuro-redifferentiatie na cultivering in laminine-gecoate kweekgerechten gedurende 30 dagen. Al na vier dagen konden de eerste neuronaal-achtige cellen met lange vertakkende structuren worden gedetecteerd. De meeste kleine bolvormige cellen ontwikkelden zich tot vertakte cellen met grotere langwerpige vormen, wat een actief proces naar differentiatie naar neuronale afstamming impliceert.Het cellichaam en de processen van de cellen vertoonden een hogere complexiteit dan ongedifferentieerde cellen, met een hoge dichtheid van ruw endoplasmatisch reticulum en bundels actinefilamenten. Cellen die in differentiatiemedia groeien, vestigden vaak cel-tot-celcontacten waarbij het cellulaire lichaam betrokken was, terwijl andere cellulaire processen op neurite-achtige wijze betrokken waren. Immunochemieanalyse uitgevoerd met behulp van specifieke antilichamen bevestigde dat BD-gededifferentieerde cellen in staat zijn om opnieuw te differentiëren naar verschillende neuronale afstammingen, waaronder GFAP-astrocyten.Deze techniek maakt het mogelijk om autologe niet-teratogene cellen te creëren die in staat zijn om opnieuw te differentiëren in cellen van alle drie de kiemlagen, wat nieuwe kansen opent in regeneratief geneeskundeonderzoek.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Cryopreservatie van Corticale Tissue Blocks voor de generatie van hoogverrijkt Neuronale culturen

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generatie van neurale stamcellen uit afgedankte menselijke foetale Cortical weefsel

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

De Neuroblast test: een test voor de generatie en de verrijking van Neuronale stamcellen uit Onderscheidende factor voor neurale stamcellen Nakomelingen met behulp van flowcytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Goud nanorod-bijgestaan ​​Optische Stimulatie van neuronale cellen

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transcraniële elektrische stimulatie en Intracortical opname in ratten

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronale differentiatie van embryonale stamcellen van muizen in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Voorbereiding voor het nabootsen van in Vivo Neuronal Circuit Connectiviteit

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...