Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
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Dédié à la mémoire du Dr Rainer Saffrich.
Les auteurs sont particulièrement reconnaissants à José Manuel García-Verdugo et Vicente Herranz-Pérez d’avoir effectué des expériences et des analyses em au Laboratoire de neurobiologie comparative, Institut de biodiversité et de biologie évolutive de Cavanilles, Université de Valence, CIBERNED, Valence, Espagne, qui a été soutenu par un financement de recherche de la subvention Prometeo pour les groupes de recherche d’excellence PROMETEO/2019/075. Le reste de ces travaux a été soutenu par ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Allemagne.

Des approbations éthiques ont été obtenues lors de la réalisation des expériences.
1. Isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMNCs)
<ol><li>S’assurer que tous les donneurs ont signé un consentement éclairé avant le prélèvement sanguin conformément aux lignes directrices de l’établissement.</li>
	<li>Prendre 30 ml de sang de donneurs sains par un personnel médical qualifié selon le protocole standard.</li>
	<li>Isolez les PBMNCs par support de...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

La méthode non-GM de reprogrammation des cellules humaines décrite dans ce travail est basée sur l’activation de membrane à noyau de la ou des machines de signalisation derrière la glycoprotéine de membrane humaine liée au GPI qui initie le processus de dédifférenciatation menant à la génération ex vivo et à l’expansion de PSCs autorenouvants obtenus à partir de sang périphérique humain non manipulé. Ces cellules, lorsqu’elles sont cultivées dans des milieux appropriés, sont capables de ...

Le développement de méthodes de recherche fondamentale et préclinique sur les cellules souches encourage l’application clinique de thérapies à base de cellules souches pour les maladies neurologiques. Une telle thérapie potentielle dépend de manière critique de la méthode de génération de cellules neurales humaines conduisant à la récupération fonctionnelle1.
Les cellules souches neurales (CNS) s’auto-renouvellent et se différencient en nouveaux neurones tout au long de la vie dans un processus appelé neurogenèse adulte. Seules les zones cérébrales très restreintes abritent des NSC compétents pour générer des neurones nouveau-nés à l’âge adulte. Ces NSCs peuvent donner naissance à des neurones matures, qui sont impliqués dans l’apprentissage et la mémoire, remplaçant ainsi les neurones perdus ou endommagés. Malheureusement, ces NSC sont présents en quantités restreintes et cette neurogenèse limitée diminue rapidement au cours du développement juvénile2. Par conséquent, d’autres sources de cellules neurales doivent être considérées dans un objectif de thérapie cellulaire.
Les maladies neurologiques dégénératives sont difficiles à guérir en utilisant des approches pharmacologiques standard. De nouvelles stratégies thérapeutiques pour embrasser de nombreux troubles neurologiques immédicables sont basées sur des thérapies de remplacement cellulaire de tissus malades et blessés. La transplantation de NSC pourrait remplacer les cellules endommagées et fournir des bienfaits. D’autres sources de remplacement des cellules neurales comprennent les cellules souches embryonnaires humaines (ESC), qui sont dérivées de la masse cellulaire interne des blastocystes mammifères3, ainsi que les cspi4, qui ont une grande capacité d’auto-renouvellement comme les CSE et sont capables de se différencier en diverses lignées cellulaires. Les NSC peuvent également être générés par reprogrammation directe à partir de fibroblastes humains évitant l’état pluripotent5.
La thérapie de remplacement cellulaire est toujours un problème difficile. Bien que l’ESC, le fœtus ou l’iPS puissent être une source de génération de cellules neuronales pour traiter de nombreuses maladies neurologiques incurables, le remplacement autologue des cellules de SC adultes des tissus endommagés est une meilleure alternative qui contourne les préoccupations immunologiques, éthiques et de sécurité.
L’activation de la protéine humaine liée au GPI par réticulation d’anticorps via la phosphorylation de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN déclenche une dédifférenciatation des cellules progénitrices sanguines et la génération de cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs)6. Ces cellules différencient in vitro vers les cellules neuronales comme confirmé au moyen de brightfield, d’immunofluorescence et d’analyse par microscopie électronique à transmission (TEM).
Dans ce travail nous décrivons la génération GM-libre de BD-PSCs et leur re-différenciation réussie en cellules avec le phénotype neuronal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

De nombreux troubles neurologiques humains sont causés par la dégénérescence des neurones et des cellules gliales dans le cerveau. En raison des limites des stratégies pharmacologiques et autres stratégies thérapeutiques, il n’y a actuellement aucun remède disponible pour le cerveau blessé ou malade. Le remplacement cellulaire apparaît comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour des conditions neurodegenerative. À ce jour, des cellules souches neurales (CSCN) ont été générées avec succès à partir de tissus fœtaux, de cellules embryonnaires humaines (SE) ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). Un processus de dédifférenciatation a été initié par l’activation de la glycoprotéine GPI-liée humaine nouvelle, qui mène à la génération des cellules souches pluripotentes. Ces cellules souches pluripotentes dérivées du sang (BD-PSCs) différencient in vitro en cellules avec un phénotype neural comme montré par brightfield et microscopie d’immunofluorescence. L’analyse d’ultrastructure de ces cellules au moyen de la microscopie électronique confirme leur structure primitive aussi bien que neuronal-comme la morphologie et les caractéristiques subcellulaires.

Les résultats fournissent la preuve que cette nouvelle méthode sans OGM est capable de rétablir les cellules progénitrices du sang à leur état le plus primitif sans agir directement sur le génome humain.
Nous avons précédemment montré que la réticulation des anticorps spécifiques aux protéines liées au GPI initie via la régulation à la hausse PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN de gènes hautement conservés pertinents pour le développement tels que WNT, NOTCH et C-Kit, initiant...

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GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Nous présentons une méthode (GM-free) génétiquement modifiée pour obtenir des cellules avec un phénotype neuronal des cellules sanguines périphériques reprogrammées. L’activation d’une voie de signalisation liée à une nouvelle protéine humaine liée au GPI révèle une méthode efficace sans OGM pour obtenir des cellules souches pluripotentes humaines.

Génération sans OGM de cellules neuronales dérivées du sang

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

L’importance du protocole repose sur la signalisation membrane à noyau et n’affecte pas directement le génome, comme c’est le cas avec les cellules souches pluripotentes induites. La nature non tératogène des cellules souches pluripotentes dérivées du sang est le principal avantage de la technique, ce qui la rend adaptée à une application clinique sûre dans divers domaines de la médecine régénérative. La Dre Anne-Kathrin Schott, chef de projet, et Oksana Greenacre, assistante de laboratoire dans mon laboratoire, démontrent la procédure.Pour isoler les PBMNCs, ajouter 25 millilitres de sang un-à-un dilué avec du PBS à 10 millilitres de milieu de gradient de densité et centrifuger le mélange à 300 fois G pendant 30 minutes. Isolez la couche d’interface entre le plasma et le gradient de densité par pipetage. Laver les cellules isolées avec cinq millilitres de PBS stérile et centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes.Après avoir répété la procédure deux fois, comptez le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de comptage. Ajouter 6 par 10 aux 6èmes cellules mononucléaires à un tube de 15 millilitres, puis effectuer la réticulation des anticorps en ajoutant de l’anticorps spécifique à la protéine de membrane GPI-linked humain aux cellules dans pbs avec 1%BSA et en incubant pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après la réticulation, remplacez le milieu d’incubation par le milieu modifié de Dulbecco d’Iscove complété par 10 % de FBS.Cultivez les cellules dans des tubes de polystyrène de 15 millilitres en les plaçant dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 8 à 10 jours sans trembler. Le cinquième jour, ajoutez un à deux millilitres supplémentaires de Medium d’Iscove complétés par 10% FBS à chaque tube de 15 millilitres. Comptez les cellules cultivées avec une chambre de comptage.Centrifuger ensuite la suspension cellulaire d’environ 5 par 10 jusqu’aux 6ème cellules à 300 fois G pendant 10 minutes et aspirer le surnageant résultant avec une pipette Pasteur stérile. Ressusciter la pastille cellulaire dans 90 microlitres de PBS pré-refroidi de pH 7,2 avec 0,5% BSA et deux EDTA millimolaires. Ajoutez ensuite 80 microlitres CD-45 perles magnétiques nano-tailles positives à la suspension cellulaire et incuber sur de la glace pendant 15 minutes.Pour laver les cellules, ajouter deux millilitres de tampon PBS et centrifuger à 300 fois G pendant 10 minutes. Ressuscitez les cellules dans 500 microlitres de tampon PBS. Lavez la colonne avec 500 microlitres de tampon PBS pré-refroidi et placez-la dans le champ magnétique.Placez la suspension cellulaire sur la colonne et lavez-la deux fois avec 500 microlitres de tampon PBS. Recueillir les cellules dans le milieu d’Iscove complété avec 1%BSA et compter les cellules dans la chambre de comptage. Placez les lamelles de verre dans des plaques de quatre puits et recouvrez-les d’une à cinq poly-L-ornithine diluée et d’eau doublement distillée.Après avoir incubé les lamphes à 37 degrés Celsius pendant une heure, lavez-les avec de l’eau double distillée. Décongeler lentement 0,5 à deux milligrammes par millilitre de laminine et l’ajouter au sommet des lamaux. Incuber à 37 degrés Celsius pendant deux heures, puis enlever l’excès de laminine par pipetage et ajouter le milieu neuronal N2 aux plats de culture.Culture bd-dérivés cd-45 cellules négatives dans le milieu N2 sur des laminines ornithine-enrobées de verre pendant deux jours dans un incubateur avec 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pour initier une différenciation neuronale des cellules nouvellement générées bd. Ensuite, culturez les cellules dans un milieu de différenciation neuronale et placez les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant 16 jours. Préparez un fixateur avec 75 millilitres d’eau stérile et quatre grammes de paraformaldéhyde.Ajouter 10 hydroxyde de sodium normal au besoin en agitant jusqu’à ce que la solution se dégage. Ajouter le mélange de saccharose à la solution et le titrer à un pH de 7,4 avec six acides chlorhydriques normaux. Porter le volume à 100 millilitres avec de l’eau stérile.Après avoir retiré le milieu de la culture cellulaire, incuber avec un fixateur de prémède pendant 15 minutes, puis jeter le fixateur et laver les cellules trois fois pendant cinq minutes chacune. Ajoutez immédiatement une solution de Triton-X à 0,3% fraîchement fabriquée et perméabilisez les cellules pendant cinq minutes. Laver trois fois avec du PBS et ajouter une solution bloquante de PBS et de BSA à 5%.Bloquer les cellules à température ambiante sur une plaque à bascule pendant une heure. Préparer une dilution appropriée des anticorps dans du PBS BSA à 1 % et incuber les cellules avec les anticorps sur une plaque à bascule pendant 1,5 heure à température ambiante. Lavez les cellules trois fois avec du PBS pendant cinq minutes par lavage.Incuber les cellules avec DAPI et monter les lamèdes avec un support de montage pour la visualisation dans un microscope. L’aspect morphologique des cellules dedifferentiated de BD a été étudié les jours un, cinq, et 10, montrant une tendance de la disparition progressive des cellules non activées et une nouvelle population de croissance constante des cellules dans la culture activée. Les cellules dedifferentiated de BD étaient petites et ont montré les caractéristiques des cellules agranular non mûres avec moins d’organites et de grands noyaux avec la chromatine condensée semblable à ESCs.Des cellules ont été étudiées pour la re-différenciation de neuro après culture dans des plats de culture laminine-enrobés pendant 30 jours. Dès quatre jours, les premières cellules neuronales avec de longues structures ramifiées ont pu être détectées. La plupart des petites cellules sphériques se sont développées en cellules ramifiées avec des formes allongées plus grandes, ce qui implique un processus actif vers la différenciation des lignées neuronales.Le corps cellulaire et les processus des cellules ont montré une complexité plus élevée que les cellules indifférenciées, présentant une densité élevée de bonnet endoplasmique rugueux et de faisceaux de filaments d’actine. Les cellules se développant dans des milieux de différenciation ont fréquemment établi des contacts de cellule à cellule impliquant le corps cellulaire, tandis que d’autres ont impliqué des processus cellulaires de manière neurite-like. L’analyse d’Immunochimie exécutée utilisant les anticorps spécifiques a confirmé que les cellules dedifferentiated de BD sont capables de re-différenciation vers de diverses lignées neuronales, y compris des astrocytes de GFAP.Cette technique permet de créer des cellules autologues non tératogènes capables de se re-différencier en cellules des trois couches germinales, ouvrant ainsi de nouvelles opportunités dans la recherche en médecine régénérative.

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