Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
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Dem Andenken an Dr. Rainer Saffrich gewidmet.
Die Autoren danken insbesondere José Manuel García-Verdugo und Vicente Herranz-Pérez für die Durchführung von EM-Experimenten und -Analysen am Labor für Vergleichende Neurobiologie, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, die durch Forschungsmittel aus dem Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 unterstützt wurden. Der Rest dieser Arbeit wurde von der ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Deutschland, unterstützt.

Bei der Durchführung der Experimente wurden ethische Genehmigungen eingeholt.
1. Isolierung von mononukleären Zellen des menschlichen peripheren Blutes (PBMNCs)
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle Spender eine Einwilligung nach Aufklärung unterzeichnet haben, bevor sie die Blutentzugskonformität in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien durchführen.</li>
	<li>Nehmen Sie 30 ml Blut von gesunden Spendern durch geschultes medizinisches Personal gemäß dem Standardprotokol...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

Die in dieser Arbeit beschriebene Nicht-GM-Methode zur Reprogrammierung menschlicher Zellen basiert auf der Membran-zu-Kern-Aktivierung der Signalmaschinerie hinter dem GPI-verknüpften menschlichen Membranglykoprotein, das den Prozess der Dedifferenzierung einleitet, der zur Ex-vivo-Erzeugung und -Expansion von sich selbst erneuernden PSCs führt, die aus nicht manipuliertem menschlichem peripherem Blut gewonnen werden. Diese Zellen sind, wenn sie in geeigneten Medien kultiviert werden, in Zellen umzudifferenzi...

Die Entwicklung grundlegender und präklinischer Stammzellforschungsmethoden fördert die klinische Anwendung stammzellbasierter Therapien bei neurologischen Erkrankungen. Eine solche mögliche Therapie hängt entscheidend von der Methode zur Erzeugung menschlicher Nervenzellen ab, die zur funktionellen Erholung führen1.
Neuronale Stammzellen (NSCs) erneuern sich selbst und differenzieren sich im Laufe des Lebens in einem Prozess, der als adulte Neurogenese bezeichnet wird. Nur sehr eingeschränkte Hirnareel beherbergen NSCs, die in der Lage sind, neugeborene Neuronen im Erwachsenenalter zu erzeugen. Solche NSCs können reife Neuronen hervorbringen, die am Lernen und Gedächtnis beteiligt sind und so verlorene oder beschädigte Neuronen ersetzen. Leider sind diese NSCs in begrenzten Mengen vorhanden und diese begrenzte Neurogenese nimmt während der juvenilen Entwicklung schnell ab2. Daher müssen andere Quellen von Nervenzellen in einem Zelltherapieziel berücksichtigt werden.
Degenerative neurologische Erkrankungen sind mit pharmakologischen Standardansätzen schwer zu heilen. Neue therapeutische Strategien zur Umarmung vieler nicht medikamentöser neurologischer Erkrankungen basieren auf Zellersatztherapien von erkranktem und verletztem Gewebe. Die NSC-Transplantation könnte beschädigte Zellen ersetzen und positive Wirkungen erzielen. Andere Quellen für den Neuronalen Zellersatz sind humane embryonale Stammzellen (ESC), die aus der inneren Zellmasse der Säugetier-Blastozysten3gewonnen werden, sowie iPSCs4,die wie ESCs über eine umfangreiche Selbsterneuerungsfähigkeit verfügen und in der Lage sind, sich in verschiedene Zelllinien zu differenzieren. NSCs können auch durch direkte Reprogrammierung von menschlichen Fibroblasten erzeugt werden, wodurch der pluripotente Zustand5vermieden wird.
Die Zellersatztherapie ist nach wie vor ein herausforderndes Thema. Obwohl ESC, fetal oder iPS eine Quelle für die Erzeugung neuronaler Zellen zur Behandlung vieler unheilbarer neurologischer Erkrankungen sein können, ist der autologe adulte SCs-Zellersatz von beschädigtem Gewebe eine bessere Alternative, die immunologische, ethische und Sicherheitsbedenken umgeht.
Die Aktivierung des humanen GPI-verknüpften Proteins durch Antikörpervernetzung durch Phosphorylierung von PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initiiert eine Dedifferenzierung von Blutvorläuferzellen und die Erzeugung von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs)6. Diese Zellen differenzieren sich in vitro gegenüber neuronalen Zellen, wie durch Hellfeld-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) bestätigt.
In dieser Arbeit beschreiben wir die GEN-freie Erzeugung von BD-PSCs und deren erfolgreiche Redifferenzierung in Zellen mit neuronalem Phänotyp.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

Viele neurologische Erkrankungen des Menschen werden durch die Degeneration von Neuronen und Gliazellen im Gehirn verursacht. Aufgrund von Einschränkungen in pharmakologischen und anderen therapeutischen Strategien gibt es derzeit keine Heilung für das verletzte oder erkrankte Gehirn. Zellersatz erscheint als vielversprechende therapeutische Strategie für neurodegenerative Erkrankungen. Bis heute werden neuronale Stammzellen (NSCs) erfolgreich aus fetalem Gewebe, menschlichen embryonalen Zellen (ES) oder induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) erzeugt. Ein Prozess der Dedifferenzierung wurde durch die Aktivierung des neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Glykoproteins eingeleitet, das zur Erzeugung pluripotenter Stammzellen führt. Diese aus dem Blut gewonnenen pluripotenten Stammzellen (BD-PSCs) differenzieren sich in vitro zu Zellen mit einem neuronalen Phänotyp, wie die Hellfeld- und Immunfluoreszenzmikroskopie zeigt. Die ultrastrukturelle Analyse dieser Zellen mittels Elektronenmikroskopie bestätigt ihre primitive Struktur sowie neuronale Morphologie und subzelluläre Eigenschaften.

Die Ergebnisse liefern Hinweise darauf, dass diese neuartige gentechnikfreie Methode in der Lage ist, Blutvorläuferzellen in ihren primitivsten Zustand zurückzusetzen, ohne direkt auf das menschliche Genom einzuwirken.
Wir haben bereits gezeigt, dass die GPI-verknüpfte proteinspezifische Antikörpervernetzung über PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN eine Hochregulierung hochkonservierender entwicklungsrelevanter Gene wie WNT, NOTCH und C-Kit initiiert und damit einen Prozess der Dedifferenzi...

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GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Wir stellen eine gentechnisch veränderte (GV-freie) Methode vor, um Zellen mit einem neuronalen Phänotyp aus reprogrammierten peripheren Blutzellen zu gewinnen. Die Aktivierung eines Signalwegs, der mit einem neuartigen menschlichen GPI-verknüpften Protein verbunden ist, zeigt eine effiziente GENV-freie Methode zur Gewinnung menschlicher pluripotenter Stammzellen.

GEN-freie Erzeugung von blutabgeleiteten neuronalen Zellen

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Die Bedeutung des Protokolls beruht auf der Signalübertragung von Membran zu Kern und wirkt sich nicht direkt auf das Genom aus, wie es bei induzierten pluripotenten Stammzellen der Fall ist. Die nicht-teratogene Natur von blutabgeleiteten pluripotenten Stammzellen ist der Hauptvorteil der Technik, wodurch sie für eine sichere klinische Anwendung in verschiedenen Bereichen der regenerativen Medizin geeignet ist. Demonstriert wird das Verfahren von Dr. Anne-Kathrin Schott, Projektleiterin, und Oksana Greenacre, Laborassistentin in meinem Labor.Um PBMNCs zu isolieren, fügen Sie 25 Milliliter eins zu eins Blut, verdünnt mit PBS, zu 10 Millilitern Dichtegradientenmedien hinzu und zentrifugieren Sie die Mischung bei 300 mal G für 30 Minuten. Isolieren Sie die Grenzschicht zwischen dem Plasma und dem Dichtegradientenmedium durch Pipettieren. Waschen Sie die isolierten Zellen mit fünf Millilitern sterilem PBS und Zentrifuge bei 300 mal G für 10 Minuten.Nachdem Sie den Vorgang zweimal wiederholt haben, zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einer Zählkammer. Fügen Sie 6 x 10 zu den 6. mononukleären Zellen zu einem 15-Milliliter-Röhrchen hinzu und führen Sie dann eine Antikörpervernetzung durch, indem Sie den Zellen in PBS mit 1% BSA einen humanen GPI-verknüpften Membranprotein-spezifischen Antikörper hinzufügen und 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren. Ersetzen Sie nach der Vernetzung das Inkubationsmedium durch Iscoves Modified Dulbecco's Medium, ergänzt durch 10% FBS.Züchten Sie die Zellen in 15 Milliliter Polystyrolröhrchen, indem Sie sie für 8 bis 10 Tage ohne Schütteln in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid legen. Fügen Sie am fünften Tag zusätzlich ein bis zwei Milliliter Iscove's Medium hinzu, ergänzt mit 10% FBS zu jeder 15-Milliliter-Tube. Zählen Sie die kultivierten Zellen mit einer Zählkammer.Dann zentrifugieren Sie die Zellsuspension von ca. 5 x 10 auf die 6. Zelle bei 300 mal G für 10 Minuten und saugen den resultierenden Überstand mit einer sterilen Pasteur-Pipette an. Resuspend das Zellpellet in 90 Mikroliter vorgekühltem PBS von pH 7,2 mit 0,5% BSA und zwei Millimolar EDTA. Dann 80 Mikroliter CD-45 positive nanogroße magnetische Perlen in die Zellsuspension geben und 15 Minuten lang auf Eis inkubieren.Um die Zellen zu waschen, fügen Sie zwei Milliliter PBS-Puffer hinzu und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten. Resuspendieren Sie die Zellen in 500 Mikroliter PBS-Puffer. Waschen Sie die Säule mit 500 Mikrolitern vorgekühltem PBS-Puffer und legen Sie sie in das Magnetfeld.Legen Sie die Zellsuspension auf die Säule und waschen Sie sie zweimal mit 500 Mikrolitern PBS-Puffer. Sammeln Sie die Zellen in Iscove's Medium, ergänzt mit 1%BSA, und zählen Sie die Zellen in der Zählkammer. Glasdeckschichten in Vier-Brunnen-Platten legen und mit ein bis fünf verdünnten Poly-L-Ornithin und doppelt destilliertem Wasser beschichten.Nachdem Sie die Abdeckungsrutsche eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, waschen Sie sie mit doppelt destilliertem Wasser. Langsam 0,5 bis zwei Milligramm pro Milliliter Laminin auftauen und oben auf den Abdecklippen hinzufügen. Inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius, entfernen Sie dann überschüssiges Laminin durch Pipettieren und fügen Sie den Kulturschalen neuronales Medium N2 hinzu.Kultur BD-abgeleitete CD-45-negative Zellen in N2-Medium auf Laminin-Ornithin-beschichteten Glasabdeckungen für zwei Tage in einem Inkubator mit 5% Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius, um eine neuronale Differenzierung neu erzeugter BD-Zellen einzuleiten. Als nächstes kulturieren Sie Zellen in neuronalem Differenzierungsmedium und legen die Platten für 16 Tage in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Bereiten Sie ein Fixiermittel mit 75 Millilitern sterilem Wasser und vier Gramm Paraformaldehyd vor.Fügen Sie 10 normales Natriumhydroxid nach Bedarf unter Rühren hinzu, bis die Lösung klar ist. Saccharosemischung in die Lösung geben und mit sechs normalen Salzsäuren auf pH 7,4 titrieren. Bringen Sie das Volumen mit sterilem Wasser auf 100 Milliliter.Nachdem Sie Medien aus der Zellkultur entfernt haben, inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit vorwarmem Fixiermittel, entsorgen Sie dann das Fixiermittel und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils fünf Minuten. Fügen Sie sofort eine frisch hergestellte 0,3% Triton-X-Lösung hinzu und permeabilisieren Sie die Zellen für fünf Minuten. Dreimal mit PBS waschen und eine Blockierungslösung aus PBS und 5%BSA hinzufügen.Blockieren Sie die Zellen bei Raumtemperatur auf einer Wippplatte für eine Stunde. Bereiten Sie eine geeignete Verdünnung der Antikörper in 1% BSA PBS vor und inkubieren Sie die Zellen mit den Antikörpern auf einer Wippplatte für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS für fünf Minuten pro Waschgang.Inkubieren Sie die Zellen mit DAPI und montieren Sie die Abdecklippen mit Montagemedien zur Visualisierung im Mikroskop. Der morphologische Aspekt von BD-dedifferenzierten Zellen wurde an den Tagen eins, fünf und 10 untersucht und zeigte einen Trend des allmählichen Verschwindens nicht aktivierter Zellen und einer stetig wachsenden neuen Population von Zellen in aktivierter Kultur. BD-dedifferenzierte Zellen waren klein und zeigten die Eigenschaften unreifer agranularer Zellen mit weniger Organellen und großen Kernen mit kondensiertem Chromatin ähnlich wie ESCs.Die Zellen wurden auf Neuro-Redifferenzierung untersucht, nachdem sie 30 Tage lang in lamininbeschichteten Kulturschalen kultiviert wurden. Bereits in vier Tagen konnten die ersten neuronalen Zellen mit langen verzweigten Strukturen nachgewiesen werden. Die meisten kleinen kugelförmigen Zellen entwickelten sich zu verzweigten Zellen mit größeren länglichen Formen, was einen aktiven Prozess zur Differenzierung zu neuronalen Linien impliziert.Der Zellkörper und die Prozesse der Zellen zeigten eine höhere Komplexität als undifferenzierte Zellen und wiesen eine hohe Dichte an rauem endoplasmatischem Retikulum und Bündeln von Aktinfilamenten auf. Zellen, die in Differenzierungsmedien wachsen, stellten häufig Zell-zu-Zell-Kontakte her, an denen der Zellkörper beteiligt war, während andere zelluläre Prozesse in neuritischer Weise beteiligten. Immunchemische Analysen, die mit spezifischen Antikörpern durchgeführt wurden, bestätigten, dass BD-dedifferenzierte Zellen in der Lage sind, sich in Richtung verschiedener neuronaler Linien, einschließlich GFAP-Astrozyten, neu zu differenzieren.Diese Technik ermöglicht es, autologe nicht-teratogene Zellen zu erzeugen, die in der Lage sind, sich in Zellen aller drei Keimschichten umzudifferenzieren, was neue Möglichkeiten in der Regenerativen Medizin eröffnet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine ​​für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Forschung

Neurowissenschaften

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generierung von neuralen Stammzellen aus menschlichen Föten Ausrangierte Rindengewebe

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Die Neuroblast Assay: Ein Test für die Erzeugung und Anreicherung von neuronalen Vorläuferzellen aus neuralen Stammzellen differenzieren Progeny mittels Durchflusszytometrie

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Schnelle Micro-Iontophorese von Glutamat und GABA: Ein nützliches Tool, um Synaptic Integration Untersuchen

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Gold-Nanostäbchenunterstützte optische Stimulation von Nervenzellen

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Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Chronische Transkraniellen Elektrostimulation und Intracortical Aufnahme bei Ratten

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Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronale Differenzierung von Maus embryonalen Stammzellen In vitro

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In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

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