Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

מוקדש לזכרו של ד"ר ריינר סאפריך.
המחברים אסירי תודה במיוחד לחוזה מנואל גרסיה-ורדוגו ווויסנטה הרנץ-פרז על ביצוע ניסויים וניתוח EM במעבדה לנוירוביולוגיה השוואתית, מכון קוואניל למגוון ביולוגי וביולוגיה אבולוציונית, אוניברסיטת ולנסיה, CIBERNED, ולנסיה, ספרד, שנתמכה על ידי מימון מחקר מענק פרומטאו לקבוצות מחקר מצוינות PROMETEO/2019/075. שאר העבודה נתמכה על ידי ACA CELL ביוטכנולוגיה GmbH היידלברג, גרמניה.

אישורים אתיים התקבלו בעת ביצוע הניסויים.
1. בידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי (PBMNCs)
<ol><li>ודא שכל התורמים חתמו על הסכמה מדעת לפני נסיגת דם בהתאם להנחיות המוסדיות.</li>
	<li>קח 30 מ"ל של דם מתורמים בריאים על ידי צוות רפואי מיומן על פי הפרוטוקול הסטנדרטי.</li>
	<li>בודד מחשבי PBMNCs לפ...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

שיטת התמנות מחדש של תאים אנושיים המתוארים בעבודה זו מבוססת על הפעלה ממברנה לגרעין של מכונות איתותים מאחורי גליקופרוטאין הממברנה האנושית הקשורה ל- GPI היוזמת את תהליך הדיפרנציאציה המובילה ליצירת ex vivo והרחבת מחשבים מתחדשים עצמית המתקבלים מדם היקפי אנושי שאינו מניפולציה. תאים אלה כאשר ?...

פיתוח שיטות מחקר בסיסיות ופרה-קליניות של תאי גזע מעודד יישום קליני של טיפולים מבוססי תאי גזע למחלות נוירולוגיות. טיפול פוטנציאלי כזה תלוי באופן קריטי בשיטה ליצירת תאים עצביים אנושיים המובילים להתאוששות תפקודית1.
תאי גזע עצביים (NSCs) מחדשים ומבדילים לנוירונים חדשים לאורך החיים בתהליך הנקרא נוירוגנזה בוגרת. רק אזורי מוח מוגבלים מאוד מכילים NSCs המוכשרים ליצור נוירונים שזה עתה נולדו בבגרות. NSCs כאלה יכולים להוליד נוירונים בוגרים, המעורבים בלמידה ובזיכרון, ובכך להחליף נוירונים אבודים או פגומים. למרבה הצער, NSCs אלה נמצאים בכמויות מוגבלות זה neurogenesis מוגבל פוחתת במהירות במהלך התפתחות לנוער2. לכן, מקורות אחרים של תאים עצביים חייבים להיחשב במטרה טיפול בתא.
מחלות נוירולוגיות ניווניות קשה לרפא באמצעות גישות פרמקולוגיות סטנדרטיות. אסטרטגיות טיפוליות חדשות לאימוץ הפרעות נוירולוגיות רבות שאינן ניתנות לחיסון מבוססות על טיפולים בתחליפי תאים של רקמה חולה ופצועה. השתלת המל"ל יכולה להחליף תאים פגומים ולספק השפעות מועילות. מקורות אחרים להחלפת תאים עצביים כוללים תאי גזע עובריים אנושיים (ESC), הנגזרים ממסת התא הפנימית של הבלסטוציסטות של היונקים3, כמו גם IPSCs4, אשר יש יכולת התחדשות עצמית נרחבת כמו ESCs ומסוגלים להבדיל לתוך שושלות תאים שונות. NSCs יכול גם להיווצר על ידי תכנות מחדש ישיר מפיברובלסטים אנושיים הימנעות מצב pluripotent5.
טיפול בתחליפי תאים הוא עדיין נושא מאתגר. למרות ש- ESC, עוברי או IPS יכולים להיות מקור ליצירת תאים עצביים לטיפול במחלות נוירולוגיות רבות חשוכות מרפא, החלפת תאי SCs למבוגרים אוטולוגיים של רקמות פגומות היא חלופה טובה יותר שעוקפת חששות אימונולוגיים, אתיים ובטיחותיים.
הפעלה של חלבון הקשור ל- GPI אנושי על ידי קישור נוגדנים באמצעות זרחן של PLCγ / PI3K / Akt / mTor / PTEN יוזמת דיפרנציאציה של תאי צאצא דם ויצירת תאי גזע פלוריפוטנטים שמקורם בדם (BD-PSCs)6. תאים אלה מבדילים במבחנה כלפי תאים עצביים כפי שאושרו באמצעות ניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים בהירה, אימונופלואורסצנטיות ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM).
בעבודה זו אנו מתארים את הדור ללא GM של מחשבי BD-PSCs ואת ההבחנה מחדש המוצלחת שלהם לתאים עם פנוטיפ עצבי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

הפרעות נוירולוגיות אנושיות רבות נגרמות על ידי ניוון של נוירונים ותאי גליה במוח. בשל מגבלות באסטרטגיות פרמקולוגיות וטיפוליות אחרות, אין כיום תרופה זמינה למוח הפגוע או החולה. החלפת תאים מופיעה כאסטרטגיה טיפולית מבטיחה לתנאים ניווניות. עד היום, תאי גזע עצביים (NSCs) נוצרו בהצלחה מרקמות עובריות, תאים עובריים אנושיים (ES) או תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSC). תהליך של דיפרנציה יזם על ידי הפעלה של גליקופרוטאין אנושי חדשני הקשור ל- GPI, המוביל ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטים. תאי גזע פלוריפוטנטים אלה שמקורם בדם (BD-PSCs) מבדילים במבחנה לתאים עם פנוטיפ עצבי כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופיה brightfield ו- immunofluorescence. ניתוח אולטרה-מבני של תאים אלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשר את המבנה הפרימיטיבי שלהם, כמו גם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומאפיינים תת-תאיים.

התוצאות מספקות ראיות לכך ששיטה חדשנית זו ללא GM מסוגלת להחזיר תאי אבות דם למצבם הפרימיטיבי ביותר מבלי לפעול ישירות על הגנום האנושי.
הוכחנו בעבר כי קישור נוגדנים ספציפי לחלבון הקשור ל- GPI יוזם באמצעות PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation של גנים רלוונטיים התפתחותית שמורים מאוד כגון WNT, NOT...

Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

אנו מציגים שיטה ללא הנדסה גנטית (ללא GM) כדי להשיג תאים עם פנוטיפ עצבי מתאי דם היקפיים מתוכנתים מחדש. הפעלה של מסלול איתות המקושר לחלבון חדשני הקשור ל- GPI אנושי חושפת שיטה יעילה ללא GM להשגת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

דור ללא GM של תאים עצביים שמקורם בדם

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

משמעות הפרוטוקול מסתמכת על איתות ממברנה לגרעין ואינה משפיעה ישירות על הגנום, כמו במקרה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים. האופי הלא טרטוגני של תאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בדם הוא היתרון העיקרי של הטכניקה, מה שהופך אותו מתאים ליישום קליני בטוח בתחום שונים של רפואה רגנרטיבית. מדגים את ההליך הוא ד"ר אן קתרין שוט, מוביל הפרויקט, ו Oksana Greenacre, עוזר מעבדה במעבדה שלי.כדי לבודד PBMNCs, להוסיף 25 מיליליטר של דם אחד על אחד מדולל עם PBS ל 10 מיליליטר של מדיה הדרגתית צפיפות צנטריפוגה את התערובת ב 300 פעמים G במשך 30 דקות. בודד את שכבת הממשק בין הפלזמה למדיה ההדרגתית של הצפיפות על-ידי צנרת. לשטוף את התאים המבודדים עם חמישה מיליליטר של PBS סטרילי וצנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות.לאחר חזרה על ההליך פעמיים, לספור את מספר התאים באמצעות תא ספירה. הוסף 6 על 10 לתאים המונונוקלאריים השישיים לצינור 15 מיליליטר, ולאחר מכן בצע חיבור צולב נוגדנים על ידי הוספת נוגדן ספציפי לחלבון ממברנה הקשור ל- GPI אנושי לתאים ב- PBS עם 1%BSA ודגרה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הקישור הצולב, החליפו את המדיום מדגירה במדיום Dulbecco של Iscove בתוספת 10% FBS.לגדל את התאים ב 15 מיליליטר צינורות פוליסטירן על ידי הצבתם באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 8 עד 10 ימים ללא רועד. ביום החמישי, להוסיף עוד אחד עד שני מיליליטר של מדיום Iscove בתוספת עם 10% FBS לכל צינור 15 מיליליטר. תספור את התאים בתרבית עם תא ספירה.לאחר מכן צנטריפוגה השעיית התא של כ 5 על 10 עד 6 תאים ב 300 פעמים G במשך 10 דקות ולשאף את supernatant וכתוצאה מכך עם פיפטה פסטר סטרילי. resuspend גלולה התא ב 90 microliters של PBS מקורר מראש של pH 7.2 עם 0.5% BSA ושני EDTA מילימטרי. לאחר מכן להוסיף 80 מיקרוליטרים CD-45 חרוזים מגנטיים בגודל ננו חיוביים השעיית התא ודגרה על קרח במשך 15 דקות.כדי לשטוף את התאים, להוסיף שני מיליליטר של חוצץ PBS צנטריפוגה ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. resuspend התאים ב 500 microliters של מאגר PBS. לשטוף את העמודה עם 500 microliters של חיץ PBS מקורר מראש ומניחים אותו בשדה המגנטי.הנח את מתלה התא על העמודה ושטוף אותו פעמיים עם 500 מיקרוליטרים של מאגר PBS. לאסוף את התאים במדיום של Iscove בתוספת 1%BSA ולספור את התאים בתא הספירה. מניחים כיסויי זכוכית בצלחות ארבע בארות ומכסים אותם בפולי-ל-אורניתין מדולל ומים מזוקקים כפולים.לאחר דגירה כיסויים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, לשטוף אותם עם מים מזוקקים כפולים. מפשירים לאט 0.5 עד 2 מיליגרם למיליליטר למינין ומוסיפים אותו לראש כיסויים. לדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, ולאחר מכן להסיר למינין עודף על ידי pipetting ולהוסיף N2 בינוני עצבי למנות התרבות.תרבית BD נגזר CD-45 תאים שליליים במדיום N2 על ציפוי זכוכית מצופה למינין במשך יומיים באינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס ליזום בידול עצבי של תאים חדשים שנוצרו BD. לאחר מכן, תאי תרבות בבידול עצבי בינוני ומניחים את הלוחות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך 16 ימים. הכן קיבוע עם 75 מיליליטר של מים סטריליים וארבעה גרם של paraformaldehyde.מוסיפים 10 נתרן הידרוקסיד רגיל לפי הצורך עם ערבוב עד הפתרון מתפנה. מוסיפים תערובת סוכרוז לתמיסה ומצפצף אותה ל- pH 7.4 עם שש חומצה הידרוכלורית רגילה. מביאים את הנפח ל-100 מיליליטר עם מים סטריליים.לאחר הסרת מדיה מתרבית התא, לדגור אותו עם קיבוע לפני המלחמה במשך 15 דקות, ולאחר מכן להשליך את הקיבוע לשטוף את התאים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד. הוסיפו מיד פתרון טרי של 0.3% טריטון-X וחדרו לתאים למשך חמש דקות. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף פתרון חסימה של PBS ו-5%BSA.לחסום את התאים בטמפרטורת החדר על צלחת רוקר במשך שעה אחת. הכן דילול מתאים של נוגדנים ב 1%BSA PBS ודגר את התאים עם הנוגדנים על צלחת רוקר במשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות לכל לשטוף.דגירה של התאים באמצעות DAPI והעלה את כיסויי השער עם מדיית הרכבה להדמיה במיקרוסקופ. ההיבט המורפולוגי של תאים D dederentiated נחקר בימים אחד, חמש, ו -10, מראה מגמה של היעלמות הדרגתית של תאים לא מופעלים ואוכלוסייה חדשה גדל בהתמדה של תאים בתרבית מופעלת. תאי BD מפוזרים היו קטנים והראו את המאפיינים של תאים אגרנוריים לא בוגרים עם פחות אברונים ונגרעינים גדולים עם כרומטין מרוכז הדומה ל- ESCs.תאים נחקרו עבור הבחנה מחדש נוירו לאחר culturing במנות תרבות מצופה למינין במשך 30 ימים. כבר ארבעה ימים, ניתן היה לזהות את התאים העצביים הראשונים עם מבנים ארוכים להסתעפות. רוב התאים הכדוריים הקטנים התפתחו לתאים מוסעפים עם צורות מוארכות גדולות יותר, מה שמרמז על תהליך פעיל לקראת בידול לשושלות עצביות.גוף התא ותהליכי התאים הראו מורכבות גבוהה יותר מאשר תאים לא מופרעים, והציג צפיפות גבוהה של רטיקולום אנדופלסמי מחוספס וחבילות של חוטי אקטין. תאים הגדלים במדיה בידול נוצרו לעתים קרובות קשרים בין תאים מעורבים בגוף התאי, בעוד שאחרים מעורבים בתהליכים תאיים בצורה דמוית נויריט. ניתוח אימונוכימיה שבוצע באמצעות נוגדנים ספציפיים אישר כי תאים dederentiated BD מסוגלים להבחין מחדש כלפי שושלות עצביות שונות, כולל אסטרוציטים GFAP.טכניקה זו מאפשרת ליצור תאים לא טרטוגניים אוטולוגיים המסוגלים להבדיל מחדש לתאים של כל שלושת שכבת הנבט, ופותחים הזדמנות חדשה במחקר רפואה רגנרטיבית.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Assay Neuroblast: Assay לדור והעשרה של ובתאים העצבית הבחנה בין צאצאיהם גזע עצביים Cell שימוש cytometry זרימה

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

מיקרו-Iontophoresis מהיר של גלוטמט וגאבא: כלי שימושי לחקירת האינטגרציה סינפטית

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

גירוי חשמלי טראנס כרונית והקלטה Intracortical בחולדות

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

התמיינות עצבית מתאי גזע עובריים של העכבר במבחנה

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...