Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
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Dedicato alla memoria del Dr. Rainer Saffrich.
Gli autori sono particolarmente grati a José Manuel García-Verdugo e Vicente Herranz-Pérez per aver eseguito esperimenti e analisi dei mercati emergenti presso il Laboratorio di Neurobiologia Comparata, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, Università di Valencia, CIBERNED, Valencia, Spagna, che è stato supportato da finanziamenti per la ricerca del Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Il resto di questo lavoro è stato supportato da ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Germania.

Le approvazioni etico sono state ottenute durante l'esecuzione degli esperimenti.
1. Isolamento delle cellule mononucleari del sangue periferico umano (PBMNC)
<ol><li>Garantire che tutti i donatori hanno firmato il consenso informato prima del ritiro del sangue nel rispetto delle linee guida istituzionali.</li>
	<li>Prendi 30 mL di sangue da donatori sani da personale medico addestrato secondo il protocollo standard.</li>
	<li>Isolare i PBMIC in base ai supporti gradienti di densità. Utiliz...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

Il metodo non GM di riprogrammazione delle cellule umane descritto in questo lavoro si basa sull'attivazione da membrana a nucleo di macchinari di segnalazione dietro la glicoproteina a membrana umana legata alla GPI che avvia il processo di dedifferentiazione che porta alla generazione ex vivo e all'espansione di PSC autorenonti ottenuti da sangue periferico umano non manipolato. Queste cellule, se coltivate in mezzi appropriati, sono in grado di ri-differenziarsi in cellule appartenenti a diversi strati<sup cl...

Lo sviluppo di metodi di ricerca sulle cellule staminali di base e preclinali incoraggia l'applicazione clinica di terapie a base di cellule staminali per le malattie neurologiche. Tale potenziale terapia dipende in modo critico dal metodo per la generazione di cellule neurali umane che porta al recupero funzionale1.
Le cellule staminali neurali (NSC) si rinnovano e si differenziano in nuovi neuroni per tutta la vita in un processo chiamato neurogenesi adulta. Solo aree cerebrali molto ristrette ospitano NSC competenti a generare neuroni appena nati in età adulta. Tali NSC possono dare origine a neuroni maturi, che sono coinvolti nell'apprendimento e nella memoria, sostituendo così i neuroni persi o danneggiati. Sfortunatamente, questi NSC sono presenti in quantità limitate e questa neurogenesi limitata diminuisce rapidamente durante lo sviluppo giovanile2. Pertanto, altre fonti di cellule neurali devono essere considerate in un obiettivo di terapia cellulare.
Le malattie neurologiche degenerative sono difficili da curare utilizzando approcci farmacologici standard. Le nuove strategie terapeutiche per abbracciare molti disturbi neurologici imedicabili si basano su terapie di sostituzione cellulare del tessuto danneggiato e ferito. Il trapianto NSC potrebbe sostituire le cellule danneggiate e fornire effetti benefici. Altre fonti per la sostituzione delle cellule neurali includono le cellule staminali embrionali umane (ESC), che derivano dalla massa cellulare interna delle blastocsti dei mammiferi3, così come gli iPSC4, che hanno un'ampia capacità di autorinnovizzo come gli ESC e sono in grado di differenziarsi in vari lignaggi cellulari. Gli NSC possono anche essere generati dalla riprogrammazione diretta da fibroblasti umani evitando lo stato pluripotente5.
La terapia sostitutiva cellulare è ancora un problema impegnativo. Sebbene ESC, fetale o iPS possano essere una fonte per la generazione di cellule neuronali per il trattamento di molte malattie neurologiche incurabili, la sostituzione automatica delle cellule dei PC adulti adulti dei tessuti danneggiati è un'alternativa migliore che aggira i problemi immunologici, etici e di sicurezza.
L'attivazione di proteine umane legate alla GPI mediante collegamento incrociato anticorpale tramite fosforilazione di PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN avvia una dedifferentiazione delle cellule progenitrici del sangue e la generazione di cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PDC)6. Queste cellule si differenziano in vitro verso le cellule neuronali come confermato mediante analisi di radiologia, immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione (TEM).
In questo lavoro descriviamo la generazione senza OGM di BD-PSC e la loro riuscita ri-differenziazione in cellule con fenotipo neuronale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

Molti disturbi neurologici umani sono causati dalla degenerazione di neuroni e cellule gliali nel cervello. A causa delle limitazioni nelle strategie farmacologiche e in altre strategie terapeutiche, attualmente non è disponibile alcuna cura per il cervello ferito o mato. La sostituzione cellulare appare come una promettente strategia terapeutica per le condizioni neurodegenerative. Ad oggi, le cellule staminali neurali (NSC) sono state generate con successo da tessuti fetali, cellule embrionali umane (ES) o cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Un processo di dedifferenziazione è stato avviato dall'attivazione della nuova glicoproteina umana legata alla GPI, che porta alla generazione di cellule staminali pluripotenti. Queste cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue (BD-PSC) si differenziano in vitro in cellule con un fenotipo neurale come dimostrato dalla microscopia a campo luminoso e immunofluorescenza. L'analisi ultrastrutturale di queste cellule mediante microscopia elettronica conferma la loro struttura primitiva, nonché la morfologia neuronale e le caratteristiche subcellulari.

I risultati forniscono la prova che questo nuovo metodo privo di OGM è in grado di ripristinare le cellule progenitrici del sangue al loro stato più primitivo senza agire direttamente sul genoma umano.
Abbiamo precedentemente dimostrato che il crosslinking di anticorpi specifici della proteina legata alla GPI inizia tramite PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation di geni altamente conservati rilevanti per lo sviluppo come WNT, NOTCH e C-Kit, avviando così un processo di dedifferentia...

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GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Presentiamo un metodo privo di OGM per ottenere cellule con un fenotipo neuronale da cellule del sangue periferiche riprogrammate. L'attivazione di un percorso di segnalazione collegato a nuove proteine umane legate alla GPI rivela un metodo efficiente privo di OGM per ottenere cellule staminali pluripotenti umane.

Generazione priva di OGM di cellule neuronali derivate dal sangue

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Il significato del protocollo si basa sulla segnalazione da membrana a nucleo e non influisce direttamente sul genoma, come nel caso delle cellule staminali pluripotenti indotte. La natura non teratogena delle cellule staminali pluripotenti derivate dal sangue è il principale vantaggio della tecnica, rendendola adatta per un'applicazione clinica sicura in vari campi della medicina rigenerativa. A dimostrare la procedura sono la dott.ssa Anne-Kathrin Schott, responsabile del progetto, e Oksana Greenacre, assistente di laboratorio nel mio laboratorio.Per isolare i PBBC, aggiungere 25 millilitri di sangue uno a uno diluito con PBS a 10 millilitri di mezzi gradienti di densità e centrifugare la miscela a 300 volte G per 30 minuti. Isolare il livello dell'interfaccia tra il plasma e il supporto del gradiente di densità pipettando. Lavare le cellule isolate con cinque millilitri di PBS sterile e centrifuga a 300 volte G per 10 minuti.Dopo aver ripetuto la procedura due volte, contare il numero di celle utilizzando una camera di conteggio. Aggiungere 6 per 10 alla 6a cellule mononucleari a un tubo da 15 millilitri, quindi eseguire il cross-linking anticorpale aggiungendo anticorpi specifici della proteina della membrana legati alla GPI umana alle cellule in PBS con 1%BSA e incubando per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo il cross-linking, sostituire il mezzo di incubazione con il Mezzo di Dulbecco Modificato di Iscove integrato con 10%FBS.Far crescere le cellule in tubi di polistirolo da 15 millilitri posizionandole in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 8-10 giorni senza tremare. Il quinto giorno, aggiungere un ulteriore da uno a due millilitri del Mezzo di Iscove integrato con 10%FBS a ogni tubo da 15 millilitri. Contare le celle coltivate con una camera di conteggio.Quindi centrifugare la sospensione cellulare di circa 5 per 10 alla sesta cella a 300 volte G per 10 minuti e aspirare il supernatante risultante con una pipetta Pasteur sterile. Rimescolare il pellet cellulare in 90 microlitri di PBS prerimorfosi di pH 7,2 con 0,5%BSA e due EDTA millimolare. Quindi aggiungere 80 microlitri CD-45 perline magnetiche positive di dimensioni nanometriche alla sospensione cellulare e incubare sul ghiaccio per 15 minuti.Per lavare le cellule, aggiungere due millilitri di tampone PBS e centrifugare a 300 volte G per 10 minuti. Rimosi le cellule in 500 microlitri di tampone PBS. Lavare la colonna con 500 microlitri di tampone PBS pre-raffreddato e posizionarla nel campo magnetico.Posizionare la sospensione cellulare sulla colonna e lavarla due volte con 500 microlitri di tampone PBS. Raccogliere le cellule nel mezzo di Iscova integrato con 1%BSA e contare le celle nella camera di conteggio. Posizionare le copertine di vetro in piatti a quattro pozzi e rivestirle con una o cinque poli-L-ornitina diluita e acqua distillata doppia.Dopo aver incubato i coprispalla a 37 gradi Celsius per un'ora, lavarli con acqua distillata doppia. Scongelare lentamente da 0,5 a due milligrammi per millilitro di laminina e aggiungerlo alla parte superiore dei copripavimenti. Incubarli a 37 gradi Celsius per due ore, quindi rimuovere la laminina in eccesso pipettando e aggiungere il mezzo neuronale N2 ai piatti di coltura.Cellule negative CD-45 derivate da BD in N2 medium su coverlips in vetro rivestito di ornitina laminina per due giorni in un'incubatrice con anidride carbonica del 5% a 37 gradi Celsius per avviare una differenziazione neuronale delle cellule appena generate dal BD. Successivamente, le cellule di coltura nel mezzo di differenziazione neuronale e posizionare le piastre in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 16 giorni. Preparare un fissatore con 75 millilitri di acqua sterile e quattro grammi di paraformaldeide.Aggiungere 10 idrossido di sodio normale secondo necessità mescolando fino a quando la soluzione non si sgombrato. Aggiungere la miscela di saccarosio alla soluzione e titolarla a pH 7,4 con sei normali acidi cloridrati. Portare il volume a 100 millilitri con acqua sterile.Dopo aver rimosso il supporto dalla coltura cellulare, incubarlo con fissante prebellica per 15 minuti, quindi scartare il fissatore e lavare le cellule tre volte per cinque minuti ciascuna. Aggiungere immediatamente una soluzione tritone-X allo 0,3% appena fatta e permeabilizzare le cellule per cinque minuti. Lavare tre volte con PBS e aggiungere una soluzione di blocco di PBS e 5%BSA.Bloccare le celle a temperatura ambiente su una piastra rocker per un'ora. Preparare un'adeguata diluizione degli anticorpi in 1%BSA PBS e incubare le cellule con gli anticorpi su una piastra rocker per 1,5 ore a temperatura ambiente. Lavare le cellule tre volte con PBS per cinque minuti per lavaggio.Incubare le cellule con DAPI e montare i copripaspamenti con supporti di montaggio per la visualizzazione al microscopio. L'aspetto morfologico delle cellule didifferenziate BD è stato studiato nei giorni uno, cinque e 10, mostrando una tendenza alla graduale scomparsa delle cellule non attivate e una nuova popolazione in costante crescita di cellule in coltura attivata. Le cellule dedifenziate BD erano piccole e mostravano le caratteristiche delle cellule agranulari immature con meno organelli e grandi nuclei con cromatina condensata simile agli ESC.Le cellule sono state studiate per la neuro-differenziazione dopo aver coltivato in piatti di coltura rivestiti di laminina per 30 giorni. Già quattro giorni, le prime cellule neuronali con lunghe strutture ramificate potevano essere rilevate. La maggior parte delle piccole cellule sferiche si sviluppavano in cellule ramificate con forme allungate più grandi, il che implica un processo attivo verso la differenziazione ai lignaggi neuronali.Il corpo cellulare e i processi delle cellule hanno mostrato una complessità superiore rispetto alle cellule indifferenziate, presentando un'alta densità di reticolo endoplasmatico ruvido e fasci di filamenti di actina. Le cellule che crescono nei mezzi di differenziazione spesso stabilivano contatti cellula-cellula che coinvolgevano il corpo cellulare, mentre altre coinvolgevano processi cellulari in modo simile alla neurite. L'analisi immunochimica eseguita utilizzando anticorpi specifici ha confermato che le cellule dedifenziate BD sono in grado di ri-differenziarsi verso vari lignaggi neuronali, compresi gli astrociti GFAP.Questa tecnica consente di creare cellule autologhe non teratogene in grado di ri-differenziarsi in cellule di tutti e tre gli strati germinali, aprendo nuove opportunità nella ricerca sulla medicina rigenerativa.

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