Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

Dedikert til minnet om Dr. Rainer Saffrich.
Forfatterne er spesielt takknemlige for José Manuel García-Verdugo og Vicente Herranz-Pérez for å utføre EM-eksperimenter og analyse ved Laboratoriet for komparativ nevrobiologi, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spania, som ble støttet av forskningsmidler fra Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Resten av dette arbeidet ble støttet av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.

Etiske godkjenninger ble oppnådd ved gjennomføring av forsøkene.
1. Isolering av humane perifere mononukleære celler i blodet (PBMNCs)
<ol><li>Forsikre deg om at alle givere signerte informert samtykke før blodet trakk seg tilbake i samsvar med institusjonelle retningslinjer.</li>
	<li>Ta 30 ml blod fra friske donorer av opplært medisinsk personell i henhold til standardprotokollen.</li>
	<li>Isoler PBMNCer ved hjelp av tetthetsgraderingsmedier. Bruk 10 ml medier med 25 ml 1:1 blod for...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

Den ikke-GM-metoden for omprogrammering av menneskelige celler beskrevet i dette arbeidet er basert på membran-til-kjerneaktivering av signalmaskiner bak GPI-tilknyttede humane membranglykoprotein som initierer prosessen med dedifferensiasjon som fører til ex vivo-generasjonen og utvidelse av selvfornyende PSCer hentet fra ikke-manipulert menneskelig perifert blod. Disse cellene når de dyrkes i passende medier, er i stand til å differensiere seg til celler som tilhører forskjellige bakterielag<sup class="xr...

Utvikling av grunnleggende og prekliniske stamcelleforskningsmetoder oppmuntrer til klinisk anvendelse av stamcellebaserte terapier for nevrologiske sykdommer. Slik potensiell terapi avhenger kritisk av metoden for generering av menneskelige nevrale celler som fører til funksjonell utvinning1.
Nevrale stamceller (NSC) fornyer seg selv og differensierer seg til nye nevroner gjennom livet i en prosess som kalles voksen neurogenese. Bare svært begrensede hjerneområder har NSC-er som er kompetente til å generere nyfødte nevroner i voksen alder. Slike NSC-er kan gi opphav til modne nevroner, som er involvert i læring og hukommelse, og dermed erstatte tapte eller skadede nevroner. Dessverre er disse NSC-ene til stede i begrensede mengder, og denne begrensede nevrogenesen reduseres raskt under ungdomsutvikling2. Derfor må andre kilder til nevrale celler vurderes i et celleterapimål.
Degenerative nevrologiske sykdommer er vanskelige å kurere ved hjelp av standard farmakologiske tilnærminger. Nye terapeutiske strategier for å omfavne mange uforgjengelige nevrologiske lidelser er basert på celleerstatningsterapier av sykt og skadet vev. NSC-transplantasjon kan erstatte skadede celler og gi gunstige effekter. Andre kilder til nevral celleerstatning inkluderer humane embryonale stamceller (ESC), som er avledet fra den indre cellemassen til pattedyr blastocysts3, samt iPSCs4, som har omfattende selvfornyelseskapasitet som ESC og er i stand til å skille seg ut i ulike celleavstamninger. NSC-er kan også genereres ved direkte omprogrammering fra menneskelige fibroblaster som unngår pluripotent tilstand5.
Celleerstatningsterapi er fortsatt et utfordrende problem. Selv om ESC, foster eller iPS kan være en kilde for generering av nevronceller for behandling av mange uhelbredelige nevrologiske sykdommer, er autolog voksen SCs celleerstatning av skadet vev et bedre alternativ som omgår immunologiske, etiske og sikkerhetsmessige bekymringer.
Aktivering av humant GPI-koblet protein ved antistoff-krysskobling via fosforylering av PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initierer en dedifferensiasjon av blodforfederceller og generering av blodavledede pluripotente stamceller (BD-PSCer)6. Disse cellene skiller in vitro mot nevronceller som bekreftet ved hjelp av brightfield, immunfluorescens og transmisjonselektronmikroskopi (TEM) analyse.
I dette arbeidet beskriver vi den GM-frie generasjonen av BD-PSCer og deres vellykkede re-differensiering i celler med nevronal fenotype.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

Mange menneskelige nevrologiske lidelser er forårsaket av degenerasjon av nevroner og glialceller i hjernen. På grunn av begrensninger i farmakologiske og andre terapeutiske strategier, er det for tiden ingen kur tilgjengelig for den skadede eller syke hjernen. Celleerstatning fremstår som en lovende terapeutisk strategi for nevrodegenerative forhold. Til denne dag har nevrale stamceller (NSC) blitt vellykket generert fra fostervev, humane embryonale celler (ES) eller induserte pluripotente stamceller (iPSC). En prosess med dedifferensiering ble initiert ved aktivering av det nye menneskelige GPI-tilknyttede glykoproteinet, noe som fører til generering av pluripotente stamceller. Disse blodavledede pluripotente stamcellene (BD-PSCer) skiller in vitro inn i celler med en nevral fenotype som vist ved brightfield og immunfluorescence mikroskopi. Ultrastrukturell analyse av disse cellene ved hjelp av elektronmikroskopi bekrefter deres primitive struktur samt nevronallignende morfologi og subcellulære egenskaper.

Resultatene gir bevis på at denne nye GM-frie metoden er i stand til å reversere blodforfederceller til sin mest primitive tilstand uten å handle direkte på det menneskelige genom.
Vi har tidligere vist at GPI-koblet proteinspesifikk antistoff krysskobling initierer via PLCγ / IP3K / Akt / mTOR / PTEN-oppregulering av svært konserverte utviklingsrelevante gener som WNT, NOTCH og C-Kit, og dermed starter en prosess med dedifferensiering som fører til det første trinnet til gene...

Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Vi presenterer en genetisk modifisert-fri (GM-fri) metode for å skaffe celler med en nevronal fenotype fra omprogrammerte perifere blodlegemer. Aktivering av en signalvei knyttet til nytt humant GPI-tilknyttet protein avslører en effektiv GM-fri metode for å skaffe menneskelige pluripotente stamceller.

GM-fri generering av blodavledede nevronceller

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Betydningen av protokollen er avhengig av membran til kjernesignalering og påvirker ikke genomet direkte, som det er tilfelle med induserte pluripotente stamceller. Den ikke-teratogene naturen til blodavledede pluripotente stamceller er den største fordelen med teknikken, noe som gjør den egnet for sikker klinisk anvendelse innen ulike felt av regenerativ medisin. Dr. Anne-Kathrin Schott, prosjektleder og Oksana Greenacre, labassistent i laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren.For å isolere PBMNCs, tilsett 25 milliliter en-til-en blod fortynnet med PBS til 10 milliliter tetthet gradient media og sentrifuger blandingen på 300 ganger G i 30 minutter. Isoler grensesnittlaget mellom plasmaet og tetthetsgradientmediet ved pipettering. Vask de isolerte cellene med fem milliliter steril PBS og sentrifuger ved 300 ganger G i 10 minutter.Etter å ha gjentatt prosedyren to ganger, telle antall celler ved hjelp av et tellekammer. Tilsett 6 x 10 i sjette mononukleære celler til et 15 milliliterrør, utfør deretter antistoff krysskobling ved å legge til humant GPI-koblet membranproteinspesifikt antistoff til cellene i PBS med 1% BSA og inkubere i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Etter krysskoblingen erstatter du inkubasjonsmediet med Iscoves Modified Dulbecco's Medium supplert med 10% FBS.Vokse cellene i 15 milliliter polystyrenrør ved å plassere dem i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 8 til 10 dager uten risting. På den femte dagen, legg til ytterligere en til to milliliter av Iscoves Medium supplert med 10% FBS til hvert 15 milliliterrør. Tell de dyrkede cellene med et tellekammer.Sentrifuger deretter cellefjæringen på ca. 5 x 10 til de sjette cellene ved 300 ganger G i 10 minutter og aspirerer den resulterende supernatanten med en steril Pasteur pipette. Resuspend cellepellet i 90 mikroliter av pre-avkjølt PBS av pH 7.2 med 0,5% BSA og to millimolar EDTA. Tilsett deretter 80 mikroliter CD-45 positive magnetiske perler i nanostørrelse til celleopphenget og inkuber på is i 15 minutter.For å vaske cellene, legg til to milliliter PBS buffer og sentrifuge ved 300 ganger G i 10 minutter. Resuspend cellene i 500 mikroliter av PBS buffer. Vask kolonnen med 500 mikroliter forhåndskjølt PBS-buffer og plasser den i magnetfeltet.Plasser cellefjæringen på kolonnen og vask den to ganger med 500 mikroliter PBS-buffer. Samle cellene i Iscoves Medium supplert med 1%BSA og telle cellene i tellekammeret. Legg glassdeksler i firebrønnsplater og belegge dem med en til fem fortynnet poly-L-ornitin og dobbelt destillert vann.Etter å ha inkubert dekslene ved 37 grader Celsius i en time, vask dem med dobbelt destillert vann. Tin sakte 0,5 til to milligram per milliliter laminin og legg det til toppen av deksler. Inkuber dem ved 37 grader Celsius i to timer, fjern deretter overflødig laminin ved pipettering og legg til nevronal medium N2 til kulturrettene.Kultur BD-avledede CD-45 negative celler i N2 medium på laminin ornitinbelagte glassdeksler i to dager i en inkubator med 5% karbondioksid ved 37 grader Celsius for å initiere en nevronal differensiering av nylig BD-genererte celler. Deretter legger kulturceller i nevronal differensieringsmedium og platene i en inkubator ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid i 16 dager. Forbered et fikseringsmiddel med 75 milliliter sterilt vann og fire gram paraformaldehyd.Tilsett 10 normalt natriumhydroksid etter behov ved omrøring til oppløsningen er klar. Tilsett sukroseblanding til løsningen og titrer den til pH 7,4 med seks normale saltsyrer. Ta volumet til 100 milliliter med sterilt vann.Etter å ha fjernet medier fra cellekulturen, inkuber det med prewarm fixative i 15 minutter, kast deretter fikseringen og vask cellene tre ganger i fem minutter hver. Tilsett umiddelbart en nylaget 0,3% Triton-X-løsning og permeabiliser cellene i fem minutter. Vask tre ganger med PBS og legg til en blokkeringsløsning av PBS og 5%BSA.Blokker cellene ved romtemperatur på en vippeplate i en time. Forbered en passende fortynning av antistoffer i 1% BSA PBS og inkuber cellene med antistoffene på en vippeplate i 1,5 timer ved romtemperatur. Vask cellene tre ganger med PBS i fem minutter per vask.Inkuber cellene med DAPI og monter dekslene med monteringsmedier for visualisering i et mikroskop. Det morfologiske aspektet ved BD-dedifferensierte celler ble studert på dag én, fem og 10, og viste en trend med gradvis forsvinning av ikke-aktiverte celler og en stadig voksende ny populasjon av celler i aktivert kultur. BD-dedifferentierte celler var små og viste egenskapene til umodne agranulære celler med mindre organeller og store kjerner med kondensert kromatin som ligner på ESC.Celler ble studert for nevro-re-differensiering etter kulturing i lamininbelagte kulturretter i 30 dager. Så tidlig som fire dager kunne de første nevronallignende cellene med lange forgreningsstrukturer oppdages. De fleste små sfæriske celler utviklet seg til forgrenede celler med større langstrakte former, noe som innebærer en aktiv prosess mot differensiering til nevronale avstamninger.Cellelegemet og prosessene i cellene viste en høyere kompleksitet enn uavklarte celler, og presenterte en høy tetthet av grov endoplasmisk retikulum og bunter av aktinfilamenter. Celler som vokser i differensieringsmedier etablerte ofte celle-til-celle-kontakter som involverer cellulær kropp, mens andre involverte cellulære prosesser på nevrittlignende måte. Immunkjemianalyse utført ved hjelp av spesifikke antistoffer bekreftet at BD-dedifferentierte celler er i stand til re-differensiering mot ulike nevronale avstamninger, inkludert GFAP-astrocytter.Denne teknikken gjør det mulig å lage autologe ikke-teratogene celler som er i stand til re-differensiering i celler av alle tre bakterielag, og åpner ny mulighet i regenerativ medisinforskning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den Neuroblast analysen: en analyse for generering og berikelse av neuronal stamceller fra Skille Neural Stem Cell familie Bruke flowcytometrisystemer

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Gold Nanorod-assistert Optisk Stimulering av nerveceller

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk Transkraniell elektrisk stimulering og Intracortical opptak i rotter

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal Differensiering fra mus embryonale stamceller In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Kile skive Forberedelse for å etterligne In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Forbereder voksen drosophila melanogaster for hele hjerneavbildning under atferd og stimuli responser

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...