Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

Dedicado à memória do Dr. Rainer Saffrich.
Os autores são especialmente gratos a José Manuel García-Verdugo e Vicente Herranz-Pérez por realizarem experimentos e análises em EM no Laboratório de Neurobiologia Comparada, Instituto Cavanilles de Biodiversidade e Biologia Evolutiva, Universidade de Valência, CIBERNED, Valência, Espanha, que foi apoiado por financiamento de pesquisa do Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. O resto deste trabalho foi apoiado pela ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Alemanha.

As aprovações éticas foram obtidas na realização dos experimentos.
1. Isolamento das células mononucleares de sangue periféricos humanos (PBMNCs)
<ol><li>Certifique-se de que todos os doadores assinaram consentimento informado antes da retirada de sangue em conformidade com as diretrizes institucionais.</li>
	<li>Tome 30 mL de sangue de doadores saudáveis por pessoal médico treinado de acordo com o protocolo padrão.</li>
	<li>Isole pbmncs por mídia gradiente de densidade. Use 10 m...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

O método não-GM de reprogramação de células humanas descrito neste trabalho baseia-se na ativação da membrana ao núcleo de máquinas de sinalização por trás da glicoproteína de membrana humana ligada ao GPI que inicia o processo de desdiferenciação levando à geração ex vivo e à expansão de PSCs auto-renovados obtidos a partir de sangue periférico humano não manipulado. Essas células quando cultivadas em meios apropriados são capazes de se diferenciar em células pertencentes a diferentes c...

O desenvolvimento de métodos básicos e pré-clínicos de pesquisa de células-tronco incentiva a aplicação clínica de terapias baseadas em células-tronco para doenças neurológicas. Tal terapia potencial depende criticamente do método de geração de células neurais humanas que leve à recuperação funcional1.
As células-tronco neurais (NSCs) se auto-renovam e se diferenciam em novos neurônios ao longo da vida em um processo chamado neurogênese adulta. Apenas áreas cerebrais muito restritas abrigam NSCs competentes para gerar neurônios recém-nascidos na idade adulta. Tais NSCs podem dar origem a neurônios maduros, que estão envolvidos no aprendizado e na memória, substituindo assim neurônios perdidos ou danificados. Infelizmente, essas NSCs estão presentes em quantidades restritas e essa neurogênese limitada diminui rapidamente durante o desenvolvimento juvenil2. Portanto, outras fontes de células neurais devem ser consideradas em um objetivo de terapia celular.
Doenças neurológicas degenerativas são difíceis de curar usando abordagens farmacológicas padrão. Novas estratégias terapêuticas para abraçar muitas doenças neurológicas imensuráveis são baseadas em terapias de substituição celular de tecido doente e ferido. O transplante de NSC pode substituir células danificadas e fornecer efeitos benéficos. Outras fontes para a substituição de células neurais incluem células-tronco embrionárias humanas (ESC), que são derivadas da massa celular interna dos blastocistos3,bem como iPSCs4,que têm ampla capacidade de auto-renovação como eSCs e são capazes de se diferenciar em várias linhagens celulares. Os NSCs também podem ser gerados pela reprogramação direta de fibroblastos humanos evitando o estado pluripotente5.
A terapia de reposição celular ainda é uma questão desafiadora. Embora a ESC, fetal ou iPS possa ser uma fonte para a geração de células neuronais para o tratamento de muitas doenças neurológicas incuráveis, a substituição celular de SCs adultos autólogos de tecidos danificados é uma alternativa melhor que contorna preocupações imunológicas, éticas e de segurança.
Ativação da proteína ligada ao GPI humano por ligação de anticorpos via fosforilação de PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN inicia uma dediferenciação de células progenitoras sanguíneas e geração de células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs)6. Essas células se diferenciam in vitro em relação às células neuronais, como confirmado por meio de análise de campo brilhante, imunofluorescência e microscopia eletrônica de transmissão (TEM).
Neste trabalho descrevemos a geração livre de BD-PSCs e sua diferenciação bem sucedida em células com fenótipo neuronal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

Muitas doenças neurológicas humanas são causadas pela degeneração de neurônios e células gliais no cérebro. Devido a limitações em estratégias farmacológicas e outras terapêuticas, atualmente não há cura disponível para o cérebro ferido ou doente. A substituição celular aparece como uma estratégia terapêutica promissora para condições neurodegenerativas. Até hoje, as células-tronco neurais (NSCs) foram geradas com sucesso a partir de tecidos fetais, células embrionárias humanas (ES) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC). Um processo de desdiferente foi iniciado pela ativação da nova glicoproteína ligada ao GPI humano, que leva à geração de células-tronco pluripotentes. Essas células-tronco pluripotentes derivadas do sangue (BD-PSCs) diferenciam in vitro em células com um fenótipo neural, como mostrado por microscopia de campo brilhante e imunofluorescência. A análise ultraestrutural dessas células por meio da microscopia eletrônica confirma sua estrutura primitiva, bem como morfologia neuronal e características subcelulares.

Os resultados fornecem evidências de que este novo método livre de GM é capaz de reverter células progenitoras de sangue para seu estado mais primitivo sem agir diretamente sobre o genoma humano.
Já mostramos anteriormente que o crosslinking de anticorpos específicos ligados ao GPI inicia-se via PLCγ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN upregulation de genes altamente conservados de desenvolvimento relevantes como WNT, NOTCH e C-Kit, iniciando assim um processo de desdiferenteização que leva a...

Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Apresentamos um método geneticamente livre de modificações (livre de GM) para obter células com um fenótipo neuronal de células sanguíneas periféricas reprogramadas. A ativação de uma via de sinalização ligada à nova proteína ligada ao GPI humano revela um método eficiente livre de GM para a obtenção de células-tronco pluripotentes humanas.

Geração livre de células neuronais derivadas do sangue

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

A significância do protocolo depende da membrana para a sinalização do núcleo e não afeta diretamente o genoma, como é o caso das células-tronco pluripotentes induzidas. A natureza não teratogênica das células-tronco pluripotentes derivadas do sangue é a principal vantagem da técnica, tornando-a adequada para aplicação clínica segura em vários campos da medicina regenerativa. Anne-Kathrin Schott, líder do projeto, e Oksana Greenacre, assistente de laboratório do meu laboratório.Para isolar os PBMNCs, adicione 25 mililitros de sangue de um para um diluídos com PBS a 10 mililitros de mídia gradiente de densidade e centrifugar a mistura a 300 vezes G por 30 minutos. Isole a camada de interface entre o plasma e a mídia gradiente de densidade por pipetação. Lave as células isoladas com cinco mililitros de PBS estéreis e centrífuga a 300 vezes G durante 10 minutos.Depois de repetir o procedimento duas vezes, conte o número de células usando uma câmara de contagem. Adicione 6 por 10 às células mononucleares ao tubo de 15 mililitros e, em seguida, realize a ligação cruzada de anticorpos de anticorpos específicos da membrana ligada ao GPI humano às células em PBS com 1%BSA e incubando por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a ligação cruzada, substitua o meio de incubação pelo Meio De Dulbecco Modificado da Iscove complementado com 10% de FBS.Cresça as células em tubos de poliestireno de 15 mililitros colocando-as em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 8 a 10 dias sem tremer. No quinto dia, adicione um adicional de um a dois mililitros do Meio iscove complementado com 10% de FBS a cada tubo de 15 mililitros. Conte as células cultivadas com uma câmara de contagem.Em seguida, centrifugar a suspensão celular de aproximadamente 5 por 10 para as 6 células a 300 vezes G por 10 minutos e aspirar o supernante resultante com uma pipeta Pasteur estéril. Resuspenja a pelota celular em 90 microliters de PBS pré-resfriado de pH 7.2 com 0,5%BSA e dois milimôlares EDTA. Em seguida, adicione 80 microliters CD-45 contas magnéticas nano-dimensionadas positivas à suspensão celular e incubar no gelo por 15 minutos.Para lavar as células, adicione dois mililitros de tampão PBS e centrífuga a 300 vezes G durante 10 minutos. Resuspense as células em 500 microliters de tampão PBS. Lave a coluna com 500 microliters de tampão PBS pré-resfriado e coloque-a no campo magnético.Coloque a suspensão da célula na coluna e lave-a duas vezes com 500 microliters de tampão PBS. Recolher as células no Meio iscove suplementado com 1%BSA e contar as células na câmara de contagem. Coloque tampas de vidro em placas de quatro poços e cubra-as com um a cinco poli-l-ornitina diluída e água dupla destilada.Depois de incubar as tampas a 37 graus Celsius por uma hora, lave-as com água destilada dupla. Descongele lentamente de 0,5 a dois miligramas por mililitro de laminina e adicione-o ao topo das manchas. Incuba-os a 37 graus Celsius por duas horas, depois remova o excesso de laminina por pipetação e adicione o meio neuronal N2 aos pratos da cultura.Cultura CD-45 células negativas derivadas de BD em N2 médio em tampas de vidro revestidas de laminina ornithine por dois dias em uma incubadora com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius para iniciar uma diferenciação neuronal de células recém-geradas por BD. Em seguida, as células de cultura em meio de diferenciação neuronal e colocam as placas em uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 16 dias. Prepare um fixador com 75 mililitros de água estéril e quatro gramas de paraformaldeído.Adicione 10 hidróxido de sódio normal conforme necessário com a agitação até que a solução se limpe. Adicione a mistura de sacarose à solução e titule-a ao pH 7.4 com seis ácidos clorídricos normais. Leve o volume para 100 mililitros com água estéril.Depois de remover a mídia da cultura celular, incuba-a com fixação pré-inaque por 15 minutos, depois descarte o fixador e lave as células três vezes por cinco minutos cada. Adicione imediatamente uma solução triton-X recém-feita de 0,3% e permeabilize as células por cinco minutos. Lave três vezes com PBS e adicione uma solução de bloqueio de PBS e 5%BSA.Bloqueie as células à temperatura ambiente em uma placa de roqueiro por uma hora. Prepare uma diluição apropriada de anticorpos em 1%BSA PBS e incuba as células com os anticorpos em uma placa de roqueiro por 1,5 horas à temperatura ambiente. Lave as células três vezes com PBS por cinco minutos por lavagem.Incubar as células com DAPI e montar as tampas com mídia de montagem para visualização em um microscópio. O aspecto morfológico das células dediferentes da BD foi estudado nos dias um, cinco e dez, mostrando uma tendência de desaparecimento gradual de células não ativadas e uma nova população crescente de células na cultura ativada. As células dediferentes de BD eram pequenas e mostravam as características de células agranulares imaturas com menos organelas e grandes núcleos com cromatina condensada semelhante às ESCs.As células foram estudadas para a reeferição neuro após a cultura revestida de laminina por 30 dias. Em quatro dias, as primeiras células neuronais com estruturas de ramificação longas poderiam ser detectadas. A maioria das pequenas células esféricas desenvolveu-se em células ramificadas com formas alongadas maiores, implicando um processo ativo para diferenciação das linhagens neuronais.O corpo celular e os processos das células apresentaram maior complexidade do que as células indiferenciadas, apresentando uma alta densidade de tiquelum endoplasmático áspero e feixes de filamentos de actina. As células crescendo em meios de diferenciação frequentemente estabeleceram contatos célula-célula envolvendo o corpo celular, enquanto outras envolviam processos celulares de forma semelhante à neurita. A análise imunoquímica realizada por anticorpos específicos confirmou que as células dediferentes da DB são capazes de se diferenciar em várias linhagens neuronais, incluindo osstrócitos GFAP.Essa técnica possibilita a criação de células não teratogênicas autólogas capazes de se diferenciar em células das três camadas de germes, abrindo nova oportunidade na pesquisa de medicina regenerativa.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Neurociência

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Geração de células-tronco neurais de Discarded tecido fetal humano Cortical

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

O Ensaio neuroblasto: um ensaio para a Geração e Enriquecimento de células progenitoras neuronais de Diferenciando Progeny Neural Stem Cell utilizando citometria de fluxo

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Estimulação elétrica transcraniana crônica e gravação Intracortical em ratos

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Diferenciação neuronal de células-tronco embrionárias do rato in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

Preparação de fatia de cunha in vitro para imitar conectividade do circuito neuronal vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...