Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

Tillägnad minnet av dr Rainer Saffrich.
Författarna är särskilt tacksamma mot José Manuel García-Verdugo och Vicente Herranz-Pérez för att ha utfört EM-experiment och analyser vid Laboratoriet för jämförande neurobiologi, Cavanilles Institute of Biodiversity and Evolutionary Biology, University of Valencia, CIBERNED, Valencia, Spanien, som stöddes av forskningsfinansiering från Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075. Resten av detta arbete stöddes av ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.

Etikgodkännanden erhölls när experimenten utfördes.
1. Isolering av mononukleära celler i perifert blod (PBMNCs)
<ol><li>Se till att alla givare har undertecknat informerat samtycke innan blod dras tillbaka i enlighet med institutionella riktlinjer.</li>
	<li>Ta 30 ml blod från friska donatorer av utbildad medicinsk personal enligt standardprotokollet.</li>
	<li>Isolera PBMNCs med densitetsgradientmedier. Använd 10 ml media med 25 ml 1:1 blod utspädd med fosfatbuffertens saltlösning...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

Den icke-GM-metod för omprogrammering av mänskliga celler som beskrivs i detta arbete är baserad på membran till kärna aktivering av signaleringsmaskiner bakom det GPI-kopplade mänskliga membranet glykoprotein som initierar dedifferentiationsprocessen som leder till ex vivo-generering och expansion av självförnyande PSC som erhållits från icke-manipulerat mänskligt perifert blod. Dessa celler när de odlas i lämpliga medier kan åter differentieras till celler som tillhör olika bakterielager<sup cla...

Utveckling av grundläggande och prekliniska stamcellsforskningsmetoder uppmuntrar klinisk tillämpning av stamcellsbaserade terapier för neurologiska sjukdomar. Sådan potentiell terapi beror kritiskt på metoden för generering av mänskliga neurala celler som leder till funktionell återhämtning1.
Neurala stamceller (NSCs) självförnya och differentiera till nya nervceller under hela livet i en process som kallas vuxen neurogenes. Endast mycket begränsade hjärnområden hyser NSCs kompetent att generera nyfödda nervceller i vuxen ålder. Sådana NSCs kan ge upphov till mogna nervceller, som är involverade i lärande och minne, vilket ersätter förlorade eller skadade nervceller. Tyvärr finns dessa NSCs i begränsade mängder och denna begränsade neurogenes minskar snabbt under ungdomsutveckling2. Därför måste andra källor till neurala celler beaktas i ett cellterapimål.
Degenerativa neurologiska sjukdomar är svåra att bota med hjälp av vanliga farmakologiska metoder. Nya terapeutiska strategier för att omfamna många omätbara neurologiska störningar är baserade på cellersättningsterapier av sjuk och skadad vävnad. NSC-transplantation kan ersätta skadade celler och ge positiva effekter. Andra källor för neuralcellsersättning inkluderar mänskliga embryonala stamceller (ESC), som härrör från den inre cellmassan hos däggdjur blastocyster3, liksom iPSCs4, som har omfattande självförnyelsekapacitet som EIC och kan skilja sig åt i olika cellstammar. NSCs kan också genereras genom direkt omprogrammering från mänskliga fibroblaster undvika pluripotent tillstånd5.
Cellersättningsterapi är fortfarande en utmanande fråga. Även om ESC, fetala eller iPS kan vara en källa för generation av neuronala celler för behandling av många obotliga neurologiska sjukdomar, är autolog vuxen SCs cellersättning av skadade vävnader ett bättre alternativ som kringgår immunologiska, etiska och säkerhetsproblem.
Aktivering av humant GPI-kopplat protein genom antikroppskorsning via fosforylering av PLCγ/PI3K/Akt/mTor/PTEN initierar en dedifferentiering av blodavkommaceller och generering av blodbaserade pluripotenta stamceller (BD-PSC)6. Dessa celler skiljer in vitro mot neuronala celler som bekräftas med hjälp av brightfield, immunofluorescens och transmission elektronmikroskopi (TEM) analys.
I detta arbete beskriver vi den GM-fria generationen av BD-PSCs och deras framgångsrika åter differentiering i celler med neuronal fenotyp.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

Många mänskliga neurologiska störningar orsakas av degeneration av nervceller och gliaceller i hjärnan. På grund av begränsningar i farmakologiska och andra terapeutiska strategier finns det för närvarande inget botemedel tillgängligt för den skadade eller sjuka hjärnan. Cell ersättning visas som en lovande terapeutisk strategi för neurodegenerativa villkor. Än i dag har neurala stamceller (NSC) framgångsrikt genererats från fetala vävnader, mänskliga embryonala celler (ES) eller inducerade pluripotenta stamceller (iPSC). En process av dedifferentiation initierades genom aktivering av den nya mänskliga GPI-länkade glykoprotein, vilket leder till generering av pluripotenta stamceller. Dessa blod-härledda pluripotenta stamceller (BD-PSCs) skiljer in vitro till celler med en neural fenotyp som visas av brightfield och immunofluorescens mikroskopi. Strukturella analys av dessa celler med hjälp av elektronmikroskopi bekräftar deras primitiva struktur samt neuronal-liknande morfologi och subcellulära egenskaper.

Resultaten ger bevis för att denna nya GM-fria metod kan återföra blod stamceller till sitt mest primitiva tillstånd utan att direkt agera på det mänskliga genomet.
Vi har tidigare visat att GPI-länkade proteinspecifika antikroppskorslänkning initierar via PLCγ / IP3K / Akt / mTOR / PTEN uppreglering av mycket bevarade utvecklingsrelevanta gener som WNT, NOTCH och C-Kit, vilket initierar en dedifferentieringsprocess som leder till det första steget till generering av HSCs oc...

Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Vi presenterar en genetiskt modifierad-fri (GM-fri) metod för att erhålla celler med en neuronal fenotyp från omprogrammerade perifera blodkroppar. Aktivering av en signalväg kopplad till nytt humant GPI-kopplat protein avslöjar en effektiv GM-fri metod för att erhålla mänskliga pluripotenta stamceller.

GM-fri generation av blodbaserade neuronala celler

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Protokollets betydelse bygger på membran till nukleussignalering och påverkar inte genomet direkt, som det är fallet med inducerade pluripotenta stamceller. Den icke-teratogena karaktären hos blod-härledda pluripotenta stamceller är den största fördelen med tekniken, vilket gör den lämplig för säker klinisk applicering inom olika områden av regenerativ medicin. Dr Anne-Kathrin Schott, projektledare, och Oksana Greenacre, labbassistent i mitt laboratorium, demonstrerar proceduren.För att isolera PBMNCs, tillsätt 25 milliliter en-till-en-blod utspädd med PBS till 10 milliliter densitetsgradientmedel och centrifugera blandningen vid 300 gånger G i 30 minuter. Isolera gränssnittslagret mellan plasma- och densitetsgradientmedierna genom pipetting. Tvätta de isolerade cellerna med fem milliliter steril PBS och centrifugera vid 300 gånger G i 10 minuter.När proceduren har upprepats två gånger räknar du antalet celler med hjälp av en räknekammare. Tillsätt 6 av 10 till de 6: e mononukleära cellerna i ett 15 milliliter rör, utför sedan antikroppskorsning genom att tillsätta mänsklig GPI-länkad membranproteinspecifik antikropp till cellerna i PBS med 1%BSA och inkubera i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Efter korslänkningen, ersätt inkubationsmediet med Iscoves Modified Dulbecco's Medium kompletterat med 10%FBS.Odla cellerna i 15 milliliter polystyrenrör genom att placera dem i en inkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 8 till 10 dagar utan skakningar. På den femte dagen, lägg till ytterligare en till två milliliter Iscoves Medium kompletterat med 10% FBS till varje 15 milliliter rör. Räkna de odlade cellerna med en räknekammare.Centrifugera sedan cellupphängningen på cirka 5 gånger 10 till de 6: e cellerna vid 300 gånger G i 10 minuter och aspirera det resulterande supernatantet med en steril Pasteur-pipett. Återanvänd cellpelleten i 90 mikroliter för förkyld PBS på pH 7,2 med 0,5% BSA och två millimolar EDTA. Tillsätt sedan 80 mikroliter CD-45 positiva magnetiska pärlor i nanostorlek till cellupphängningen och inkubera på is i 15 minuter.För att tvätta cellerna, tillsätt två milliliter PBS-buffert och centrifugera vid 300 gånger G i 10 minuter. Återanvänd cellerna i 500 mikroliter PBS-buffert. Tvätta kolonnen med 500 mikroliter för förkyld PBS-buffert och placera den i magnetfältet.Placera cellupphängningen på kolonnen och tvätta den två gånger med 500 mikroliter PBS-buffert. Samla cellerna i Iscoves medium kompletterat med 1%BSA och räkna cellerna i räknekammaren. Placera glaslock i fyra brunnsplattor och täck dem med en till fem utspädda poly-L-ornitin och dubbelt destillerat vatten.Efter att ha inkuberat täckena på 37 grader Celsius i en timme, tvätta dem med dubbelt destillerat vatten. Tina långsamt 0,5 till två milligram per milliliter laminin och lägg det till toppen av täckglas. Inkubera dem vid 37 grader Celsius i två timmar, ta sedan bort överskott av laminin genom pipetting och tillsätt neuronal medium N2 till kulturrätterna.Kultur BD-härledda CD-45 negativa celler i N2 medium på laminin ornitin-belagda glas täcklips i två dagar i en inkubator med 5%koldioxid vid 37 grader Celsius för att initiera en neuronal differentiering av nyligen BD genererade celler. Därefter odlar celler i neuronal differentieringsmedium och placerar plattorna i en inkubator vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid i 16 dagar. Förbered ett fixativ med 75 milliliter sterilt vatten och fyra gram paraformaldehyd.Tillsätt 10 normalt natriumhydroxid efter behov med omrörning tills lösningen klarnat. Tillsätt sackarosblandningen till lösningen och titrera den till pH 7.4 med sex normala saltsyra. För volymen till 100 milliliter med sterilt vatten.Efter att ha tagit bort media från cellkulturen, inkubera det med förkrigsfixativt i 15 minuter, kassera sedan fixativet och tvätta cellerna tre gånger i fem minuter vardera. Tillsätt omedelbart en nygjord 0,3%Triton-X-lösning och permeabilisera cellerna i fem minuter. Tvätta tre gånger med PBS och lägg till en blockeringslösning av PBS och 5%BSA.Blockera cellerna i rumstemperatur på en vippplatta i en timme. Förbered en lämplig utspädning av antikroppar i 1%BSA PBS och inkubera cellerna med antikropparna på en vippplatta i 1,5 timmar vid rumstemperatur. Tvätta cellerna tre gånger med PBS i fem minuter per tvätt.Inkubera cellerna med DAPI och montera täckena med monteringsmedier för visualisering i mikroskop. Den morfologiska aspekten av BD dedifferentierade celler studerades på dag ett, fem och 10, visar en trend av gradvis försvinnande av icke-aktiverade celler och en stadigt växande ny population av celler i aktiverad kultur. BD dedifferentiated celler var små och visade egenskaperna hos omogna agranular celler med mindre organeller och stora atomkärnor med kondenserade kromatin liknar EIC.Celler studerades för neuro-re-differentiering efter odling i lamininbelagda kulturrätter i 30 dagar. Så tidigt som fyra dagar kunde de första neuronala-liknande cellerna med långa förgrening strukturer upptäckas. De flesta små sfäriska celler utvecklades till grenade celler med större långsträckta former, vilket innebär en aktiv process mot differentiering till neuronala härstamningar.Cellkroppen och cellernas processer visade en högre komplexitet än odifferentierade celler, presenterar en hög densitet av grova endoplasmic reticulum och buntar av aktin filament. Celler som växer i differentieringsmedier etablerade ofta cell-till-cell-kontakter som involverar cellkroppen, medan andra involverade cellulära processer på neuritliknande sätt. Immunokemi analys utförs med hjälp av specifika antikroppar bekräftade att BD dedifferentiated celler kan återdifferentiering mot olika neuronal härstamning, inklusive GFAP astrocyter.Denna teknik gör det möjligt att skapa autologa icke-teratogena celler som kan åter differentiera sig till celler i alla tre bakterieskiktet, vilket öppnar nya möjligheter i regenerativ medicinforskning.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Frysförvaring av kortikal vävnad block för generering av höganrikat Neuronal kulturer

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Generering av neuronala stamceller från kasserade mänskliga foster Bark-Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Den Neuroblast Analys: En analys för generering och anrikning av neuronala progenitorceller från Skilja Neural Stem Cell Progeny med hjälp av flödescytometri

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Snabb Micro-iontophoresis av glutamat och GABA: Ett användbart verktyg för att undersöka Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Guld nanorod Assisterad Optisk Stimulering av nervceller

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronisk transkraniell elektrisk stimulering och Intracortical inspelning hos råttor

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Neuronal differentiering från mus embryonala stamceller in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Wedge Slice Förberedelse för Härma In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Förbereda vuxen Drosophila melanogaster för hela hjärnan imaging under beteende och Stimuli svar

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...