Name: gm-free generation of blood-derived neuronal cells
Uploaded: 2021-02-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

Dr. Rainer Saffrich'in anısına adanmış.
Yazarlar özellikle Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 araştırma finansmanı ile desteklenen Karşılaştırmalı Nörobiyoloji Laboratuvarı, Cavanilles Biyoçeşitlilik ve Evrimsel Biyoloji Enstitüsü, Valencia Üniversitesi, CIBERNED, Valencia, İspanya'da EM deneyleri ve analizleri yaptıkları için José Manuel García-Verdugo ve Vicente Herranz-Pérez'e minnettardır. Bu çalışmanın geri kalanı ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Almanya tarafından desteklendi.

Deneyler yapılırken etik onaylar alındı.
1. İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu (PBMNC'ler)
<ol><li>Tüm bağışçıların kurumsal yönergelere uygun olarak kan çekmeden önce bilgilendirilmiş onay imzaladığını sağlayın.</li>
	<li>Standart protokole göre eğitimli sağlık personeli tarafından sağlıklı donörlerden 30 mL kan alın.</li>
	<li>PBMNC'leri yoğunluk degrade ortamları tarafından yalıtın. Fosfat tampon salin (PBS) ile seyreltilmiş 25 ...

<ol>
	<li>Peng, J., Zeng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+in+Regenerative+Medicine:+Neurodegenerative+Diseases.">The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases.</a> Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32 (2011).</li><li>Sorells, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+hippocampal+neurogenesis+drops+sharply+in+children+to+undetectable+levels+in+adults.">Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults.</a> Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).</li><li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+From+Adult+Human+Fibroblast+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Liu, G. -. H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neural+stem+cells:+a+new+tool+for+studying+neural+development+and+neurological+disorders.">Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders.</a> Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+by+ACA+Induces+Pluripotency+in+Human+Blood+Progenitor+Cells.">Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).</li><li>Marchenko, S., Flanagan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemistry:+Human+Neural+Stem+Cells.">Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e267 (2007).</li><li>Becker-Koji&#263;, Z. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+glycoprotein+ACA+is+upstream+regulator+of+human+heamtopoiesis.">A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis.</a> Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurochemical+Regulation+of+the+Expression+and+Function+of+Glial+Fibrillary+Acidic+Protein+in+Astrocytes.">Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes.</a> Glial. 68 (5), 878-897 (2020).</li><li>Melkov&#225;, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Functions+of+Microtubule+Associated+Proteins+Tau+and+MAP2c:+Similarities+and+Differences.">Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences.</a> Biomolecules. 9 (3), 105 (2019).</li><li>Menezes, J. R., Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+neuron-specific+tubulin+defines+a+novel+population+in+the+proliferative+layers+of+the+developing+telencephalon.">Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon.</a> Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).</li><li>Bernal, A., Arranz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nestin-expressing+progenitor+cells:+function,+identity+and+therapeutic+implications.">Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).</li></ol>

Bu çalışmada açıklanan insan hücrelerini yeniden programlamanın GM olmayan yöntemi, manipüle edilmemiş insan periferik kanından elde edilen ex vivo üretimine ve kendi kendini yenileyen PSC'lerin genişlemesine yol açan adanmışlık sürecini başlatan GPI bağlantılı insan membranı glikoproteinin arkasındaki sinyalizasyon (lar) makinelerinin çekirdek aktivasyonuna membran dayanmaktadır. Bu hücreler uygun ortamda kültürlendiğinde, farklı mikrop katmanlarına ait hücrelere yeniden ayırt ...

Temel ve klinik öncesi kök hücre araştırma yöntemlerinin geliştirilmesi, nörolojik hastalıklar için kök hücre temelli tedavilerin klinik olarak uygulanmasını teşvik eder. Bu tür potansiyel tedavi kritik fonksiyonel iyileşmeye yol açan insan sinir hücrelerinin üretimi için yönteme bağlıdır1.
Nöral kök hücreler (NSC'ler) yetişkin nörogenez adı verilen bir süreçte yaşam boyunca kendini yeniler ve yeni nöronlara ayırır. Sadece çok kısıtlı beyin bölgeleri, yetişkinlikte yenidoğan nöronları üretmeye yetkin NSC'leri barındırır. Bu tür NSC'ler, öğrenme ve hafızada yer alan olgun nöronlara yol açabilir, böylece kayıp veya hasarlı nöronların yerini alabilir. Ne yazık ki, bu NSC'ler sınırlı miktarlarda bulunur ve bu sınırlı nörogenez çocuk gelişimi sırasında hızla azalır2. Bu nedenle, diğer sinirsel hücre kaynakları bir hücre tedavisi hedefinde düşünülmelidir.
Dejeneratif nörolojik hastalıkların standart farmakolojik yaklaşımlar kullanılarak tedavisi zordur. Birçok eskiyen nörolojik bozukluğu kucaklamak için yeni terapötik stratejiler, hastalıklı ve yaralı dokunun hücre protezi tedavilerine dayanmaktadır. NSC transplantasyonu hasarlı hücrelerin yerini alabilir ve yararlı etkiler sağlayabilir. Nöral hücre değişimi için diğer kaynaklar arasında memeli blastosistler3'üniç hücre kütlesinden elde edilen insan embriyonik kök hücreleri (ESC) veESC'lergibi geniş kendini yenileme kapasitesine sahip ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilen iPSC 4 bulunur. NSC'ler ayrıca pluripotent durumdan kaçınarak insan fibroblastlarından doğrudan yeniden programlama ile de oluşturulabilir5.
Hücre replasman tedavisi hala zorlu bir konudur. ESC, fetal veya iPS birçok tedavi edilemez nörolojik hastalığın tedavisi için nöronal hücrelerin üretimi için bir kaynak olsa da, hasarlı dokuların otolog yetişkin SCS hücre değişimi, immünolojik, etik ve güvenlik endişelerini atlatan daha iyi bir alternatiftir.
İnsan GPI bağlantılı proteinin PLCφ/PI3K/Akt/mTor/PTEN fosforilasyonu yoluyla antikor-çapraz bağlama ile aktivasyonu, kan progenitör hücrelerinin ve kan türevli pluripotent kök hücrelerin (BD-PSC' ler) üretimine adanmışlık başlatır6. Bu hücreler, parlak alan, immünofluoresans ve iletim elektron mikroskopisi (TEM) analizi ile doğrulanan nöronal hücrelere doğru in vitro farklılaşmaz.
Bu çalışmada, BD-PSC'lerin GM'den arındırılmış neslini ve nöronal fenotipli hücrelere başarılı bir şekilde yeniden ayırt etmelerini anlatıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin Fraction V</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T8444.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP Cy3 conjugate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3402C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Alexa Fluor 555</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB3418A5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin Alexa Fluor 488</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>MAB5326A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>560381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AO/PI Cell Viability kit</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872045</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid 2-phosphate sequimagnes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Serum free 50x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11530536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic FGF solution</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10647225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biocoll</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>L6115-BC</td>
			<td>density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA Frac V 7.5%</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15260037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-045-801</td>
			<td>nano-sized magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting slides Luna</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872010</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chamber Slides Lab-Tek</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10234121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-MEM/F12</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>FG4815-BC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Durcupan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>44610</td>
			<td>epoxy resin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>S0115/1030B</td>
			<td>Discontinued. Available under: TMS-013-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GDNF recombinant human</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10679963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td>L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde grade</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5882-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium cell</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3149-50KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human BDNF</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11588836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iscove (IMDM)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>FG0465</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin mouse</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>10267092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead citrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>15326-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luna FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>872040</td>
			<td>Biozym discontinued. The product produced by Logos Biosystems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Buffer</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM NEAA 100x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniMACS Trenns&#228;ulen</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morada digital camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiplatte Nunclon 4 wells</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10507591</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement 100x</td>
			<td>Fisher Scientific (Gibco)</td>
			<td>11520536</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10888022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS sterile</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9143.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Glue-3 Loctite</td>
			<td>Henkel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEM FEI Technai G2 Spirit</td>
			<td>FEI Europe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracut UC-6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl acetate C</td>
			<td>EMS</td>
			<td>22400</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gm-free generation of blood-derived neuronal cells

Birçok insan nörolojik bozukluğu, beyindeki nöronların ve glial hücrelerin dejenerasyonundan kaynaklanır. Farmakolojik ve diğer terapötik stratejilerdeki sınırlamalar nedeniyle, şu anda yaralı veya hastalıklı beyin için mevcut bir tedavi yoktur. Hücre replasmanı nörodejeneratif durumlar için umut verici bir terapötik strateji olarak ortaya çıkar. Bu güne kadar fetal dokulardan, insan embriyonik hücrelerinden (ES) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) nöral kök hücreler (NSC) başarıyla oluşturulmuştur. Pluripotent kök hücrelerin üretilmesine yol açan yeni insan GPI bağlantılı glikoproteinin aktivasyonu ile bir adanmışlık süreci başlatılmıştır. Bu kan türevli pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) in vitroyu brightfield ve immünofluoresans mikroskopisinde gösterildiği gibi nöral fenotipli hücrelere ayırır. Bu hücrelerin elektron mikroskopisi ile ultrayapısal analizi, ilkel yapılarının yanı sıra nöronal benzeri morfoloji ve hücre altı özelliklerini doğrular.

Sonuçlar, bu yeni GM içermeyen yöntemin, kan progenitör hücrelerini doğrudan insan genomuna göre hareket etmeden en ilkel durumlarına döndürebildiğine dair kanıtlar sürmüştir.
Daha önce GPI bağlantılı proteine özgü antikor çapraz bağlantısının, WNT, NOTCH ve C-Kit gibi yüksek oranda korunmuş gelişimsel olarak ilgili genlerin PLCφ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN ile yukarı doğrulması yoluyla başlatıldığını, böylece HSC'lerin üretimine ilk adıma ve BD-PSC'le...

Watch this Scientific Journal Video about GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells at JoVE.com

GM-Free Generation of Blood-Derived Neuronal Cells

Yeniden programlanmış periferik kan hücrelerinden nöronal fenotip içeren hücreler elde etmek için genetiği değiştirilmiş (GM içermeyen) bir yöntem sunuyoruz. Yeni insan GPI bağlantılı proteine bağlı bir sinyal yolunun aktivasyonu, insan pluripotent kök hücrelerini elde etmek için verimli bir GM içermeyen yöntem ortaya koymaktadır.

Kan Türevi Nöronal Hücrelerin GM'den Arındırılmış Üretimi

Many human&#160;neurological disorders are caused by degeneration of neurons and glial cells in the brain. Due to limitations in pharmacological and other ...

Protokolün önemi, çekirdek sinyaline membrandan dayanır ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerde olduğu gibi genomu doğrudan etkilemez. Kan türevli pluripotent kök hücrelerin teratojenik olmayan doğası, tekniğin ana avantajıdır ve çeşitli rejeneratif tıp alanında güvenli klinik uygulama için uygun hale getirir. Prosedürü gösteren proje lideri Dr. Anne-Kathrin Schott ve laboratuvarımdaki laboratuvar asistanı Oksana Greenacre.PBMNC'leri izole etmek için, PBS ile seyreltilmiş 25 mililitre bire bir kanı 10 mililitre yoğunluk gradyan ortamına ekleyin ve karışımı 30 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin. Plazma ve yoğunluk gradyan ortamı arasındaki arayüz katmanını pipetleme ile izole edin. İzole edilmiş hücreleri beş mililitre steril PBS ve santrifüj ile 300 kez G'de 10 dakika yıkayın.Prosedürü iki kez tekrar ettikten sonra, bir sayım odası kullanarak hücre sayısını sayın. 15 mililitrelik bir tüpe 6'ya 10 mononükleer hücre ekleyin, ardından PBS'deki hücrelere %1 BSA ile insan GPI bağlantılı membran proteinine özgü antikor ekleyerek ve 37 santigrat derecede 30 dakika kuluçka yaparak antikor çapraz bağlama gerçekleştirin. Çapraz bağlamadan sonra, kuluçka ortamını Iscove'un %10 FBS ile desteklenmiş Modifiye Dulbecco's Medium ile değiştirin.Hücreleri 15 mililitre polistiren tüplerde 37 santigrat derecede bir inkübatöre ve 8 ila 10 gün boyunca titremeden% 5 karbondioksite yerleştirerek büyütün. Beşinci gün, her 15 mililitrelik tüpe%10 FBS ile desteklenmiş bir ila iki mililitre iscove's Medium ekleyin. Kültürlü hücreleri bir sayım odası ile sayın.Daha sonra yaklaşık 5'e 10 hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca 300 kez G'de 6. Hücre peletini 90 mikrolitre önceden soğutulmuş pH 7.2 PBS'de %0.5 BSA ve iki milimolar EDTA ile yeniden biriktirin. Daha sonra hücre süspansiyonu içine 80 mikrolitre CD-45 pozitif nano boyutlu manyetik boncuk ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.Hücreleri yıkamak için, 10 dakika boyunca 300 kez G'de iki mililitre PBS tamponu ve santrifüj ekleyin. Hücreleri 500 mikrolitre PBS arabelleğine yeniden ayırın. Kolonu önceden soğutulmuş 500 mikrolitre PBS tamponu ile yıkayın ve manyetik alana yerleştirin.Hücre süspansiyonunu kolona yerleştirin ve 500 mikrolitre PBS arabelleği ile iki kez yıkayın. Iscove's Medium'da %1 BSA ile desteklenmiş hücreleri toplayın ve sayım odasındaki hücreleri sayın. Cam kapakları dört kuyulu plakalara yerleştirin ve bir ila beş seyreltilmiş poli-L-ornitin ve çift damıtılmış su ile kaplayın.Kapakları 37 santigrat derecede bir saat kuluçkaya yatırdıktan sonra çift damıtılmış suyla yıkayın. Mililitre laminin başına 0,5 ila iki miligram yavaşça çözün ve kapakların üstüne ekleyin. İki saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, sonra pipetleme ile fazla lamininleri çıkarın ve kültür yemeklerine nöronal orta N2 ekleyin.Kültür BD türevli CD-45 negatif hücreler N2 ortamında laminin ornitin kaplı cam kapaklar üzerinde iki gün boyunca bir inkübatörde% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede yeni BD oluşturulan hücrelerin nöronal farklılaşması başlatmak için. Daha sonra, nöronal farklılaşma ortamındaki kültür hücreleri ve plakaları 37 santigrat derecede bir inkübatöre ve 16 gün boyunca% 5 karbondioksite yerleştirin. 75 mililitre steril su ve dört gram paraformaldehit ile bir fiksatif hazırlayın.Çözelti temizleninceye kadar karıştırma ile gerektiği gibi 10 normal sodyum hidroksit ekleyin. Çözeltiye sakkaroz karışımı ekleyin ve altı normal hidroklorik asitle pH 7.4'e titratlayın. Steril su ile hacmi 100 mililitreye getirin.Medyayı hücre kültüründen çıkardıktan sonra, 15 dakika boyunca ısıtıcı öncesi fiksatif ile kuluçkaya yatırın, ardından fiksatifi atın ve hücreleri her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Hemen yeni yapılmış bir %0,3 Triton-X çözeltisi ekleyin ve hücreleri beş dakika boyunca permeabilize edin. PBS ile üç kez yıkayın ve bir engelleme PBS ve%5 BSA çözeltisi ekleyin.Hücreleri oda sıcaklığında bir rocker plakasında bir saat boyunca engelleyin. %1 BSA PBS'de uygun bir antikor seyreltme hazırlayın ve hücreleri oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca bir rocker plakasındaki antikorlarla kuluçkaya yatırın. Hücreleri PBS ile üç kez yıkama başına beş dakika yıkayın.Hücreleri DAPI ile kuluçkaya yatırın ve kapakları mikroskopta görselleştirme için montaj ortamı ile monte edin. BD'ye adanmış hücrelerin morfolojik yönü ilk, beşinci ve 10. BD farklılaşmış hücreler küçüktü ve daha az organel ve ESC'lere benzer yoğun kromatinli büyük çekirdeklere sahip olgunlaşmamış agranuler hücrelerin özelliklerini gösterdi.Hücreler, 30 gün boyunca laminin kaplı kültür yemeklerinde kültlendikten sonra nöro yeniden farklılaşma için çalışıldı. Dört gün gibi erken bir sürede, uzun dallanma yapılı ilk nöronal benzeri hücreler tespit edilebilir. Çoğu küçük küresel hücre, nöronal soylara farklılaşmaya doğru aktif bir süreç anlamına gelen daha büyük uzun şekillere sahip dallı hücrelere dönüştü.Hücrelerin hücre gövdesi ve süreçleri, farklılaşmamış hücrelerden daha yüksek bir karmaşıklık göstererek, yüksek yoğunluklu kaba endoplazmik retikül ve aktin filament demetleri sundu. Farklılaşma medyasında büyüyen hücreler sıklıkla hücresel vücudu içeren hücreden hücreye temaslar kurarken, diğerleri hücresel süreçleri neurite benzeri bir şekilde içeriyordu. Spesifik antikorlar kullanılarak yapılan immün entrika analizi, BD adanmış hücrelerin GFAP astrositleri de dahil olmak üzere çeşitli nöronal soylara doğru yeniden farklılaşabildiğini doğruladı.Bu teknik, her üç mikrop tabakasının hücrelerine yeniden farklılaşabilen otolog teratojenik olmayan hücreler oluşturmayı mümkün kılmakta ve rejeneratif tıp araştırmalarında yeni bir fırsat açtır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Yüksek zenginleştirilmiş Nöronal Kültürlerin Üretimi için Kortikal Doku Blokları, Kriyoprezervasyon

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Atılan İnsan Fetal Kortikal Doku Sinir Kök Hücre Üretimi

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Bozulmamış Duyu Organ Öncü Hücreler Canlı hücre Görüntüleme Drosophila Pupa

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neuroblast Test: Akım Sitometri Kullanımı Farklılaşan Nöral Kök Hücre Döl nöronal Progenitör Hücrelerinin üretilmesi ve zenginleştirilmesi için bir Testi

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Gold Nanorod-assisted Optical Stimulation of Neuronal Cells

Altın Nöronal Hücrelerde optik Uyarım Nanorod destekli

Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared ...

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Kronik Transkraniyal elektriksel stimülasyon ve Sıçanlarda Intracortical kayıt

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

Fare Embriyonik Kök Hücre in vitro nöronal farklılaşma

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In Vitro Kama Dilimi In Vivo Nöronal Devre Bağlantısı Nın TaklitI Için Hazırlık

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...