Name: implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for dyt/park-atp1a3 dystonia
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af forbundsministeriet for uddannelse og forskning (BMBF DysTract til C.W.I.) og af Det Tværfaglige Center for Klinisk Forskning (IZKF) ved Universitetet i Würzburg (Z2-CSP3 til L.R.). Forfatterne takker Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger og Heike Menzel og for deres tekniske bistand samt Helga Brünner for dyreplejen.

Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med gældende internationale, nationale og/eller institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af dyr. De lokale myndigheder på Regierung von Unterfranken, Würzburg, Tyskland, godkendte alle dyreforsøg.
1. Priming af osmotiske pumper
BEMÆRK: Dette trin skal udføres mindst 48 timer før operationen. ALZET osmotiske pumper skal udfyldes på forhånd for at sikre, at pumpehastigheden når en stabil tilstand før implantation.
<ol><li>Forbered den ønskede løsning til kronisk perfusion på forhånd. Sørg for, at opløsningsmidlet og agenten er kompatible med osmotiske pumper og katetre. Til projektet heri optøes en 10x lageropløsning af ouabain (opbevares ved -20 °C) ved stuetemperatur og vortex i 10 s. FORSIGTIG: Ouabain er giftig: Det må kun håndteres med handsker og åbnes kun under en steril hætte for at undgå indånding.</li>
	<li>Tænd for den sterile hætte. desinficere emhætten samt alle de instrumenter og materialer, der er nødvendige, før de sættes under kølerhjelmen.</li>
	<li>Tag kirurgiske handsker på, før du håndterer osmotiske pumper. Hver for sig klargøre ouabain-opløsningen, der er beregnet til pumperne i striatum og lillehjernen. BEMÆRK: Overvej, at koncentrationen af opløsningen i pumpen til striatum skal fordobles i forhold til koncentrationen af opløsningen i den pumpe, der er beregnet til lillehjernen. Dette skyldes det faktum, at pumpen til striatum er forbundet til en dobbelt kanyle, strømningshastigheden, dog er den samme som for pumpen af lillehjernen, som er forbundet til en enkelt kanyle.</li>
	<li>Beregn den mængde opløsning, der skal bruges, ved hjælp af følgende formel: masseleveringshastighed (ko) = volumenleveringshastighed (Q) x koncentration af agensen i køretøjet (Cd) Til det foreliggende projekt blev de osmotiske pumper primet og fyldt med enten ouabainopløsning ved en koncentration på 11,2 ng/h eller 0,9% saltvand til kontrolgruppen.</li>
	<li>Vortex både ouabain opløsninger til 10 s og sterilt filter (dvs. 0,22 μm sprøjte-end filter) dem i separate, nye mikrocentrifuge rør, ved hjælp af et andet filter for hver opløsning.</li>
	<li>De tomme osmotiske pumper vejes sammen med flowmoderatoren (ca. 0,4 g).</li>
	<li>Fyld en 1 ml sprøjte med en 27 G påfyldningskanyle (helst med en stump spids) med sterilt filtreret ouabain-opløsning eller køretøjsopløsning.</li>
	<li>Få alle luftboblerne ud af sprøjten, hold osmotisk pumpe i opretstående stilling, sæt kanylen helt ind i pumpen og fyld langsomt beholderen, indtil overskydende opløsning vises på toppen (undgå hurtig påfyldning, da dette kan føre til luftbobler i pumpen). Sæt derefter flowredaktøren ind i pumpen (overskydende opløsning skal vises øverst).</li>
	<li>Træk flowredaktøren ud (ca. 5 mm), tag forsigtigt den hvide flange af med en saks, og tilslut et stykke vinylrør til flowredaktøren. Sørg for, at kateteret har en længde på ca. 2 cm for at sikre, at dyret er sikkert sikkert.</li>
	<li>Den fyldte osmotiske pumpe afvejes igen for at sikre, at vægtforskellen mellem fyldt og tom pumpe er konkorrerende med den forventede vægt af den indlæste løsning. BEMÆRK: For de fleste vandige opløsninger er denne vægt lig med volumen i mikroliter. Hvis vægten ikke svarer til det forventede volumen, kan der blive fanget luft inde i pumpen, som skal tømmes og genfyldes.</li>
	<li>Til priming af pumperne, forberede to 2 ml mikrocentrifuge rør, et rør til striatum og en til lillehjernen.</li>
	<li>Nedsænk pumperne i mikrocentrifugerørene, der fyldes halvvejs med 0,9% saltvandsopløsning. Kateteret må ikke nedsænkes i den åbne ende. Mikrocentrifugerørene anbringes i en termocykator i 48 timer ved 37 °C for at sikre, at pumpen har nået en stabil pumpehastighed før implantation, og katetrene er fyldte på forhånd.</li>
</ol>2. Kanyle og osmotisk pumpeimplantatation
<ol><li>Placer musen (han, C57Bl/6N, 11-12 uger) i et kammer designet til indånding anæstesi; indstille strømningshastigheden af isofluran til 2-3% og strømningshastigheden af ilt til 2 L / min.</li>
	<li>Efter musen er dybt bedøvet i henhold til godkendte protokoller, barbere toppen af dyrets hoved, rygskrænning og proksimale tredjedel af ryggen.</li>
	<li>Placer dyret i en stereotaktisk ramme og fortsætte anæstesi med isofluran via en mus anæstesi maske designet til stereotaktisk instrument (isofluran strømningshastighed 1,5-2%, 2 L / min ilt).</li>
	<li>Brug gummispidser eller ikke-brud øre barer, fastsætte hovedet af dyret i stereotaktisk ramme, idet du skal passe på, at hovedet er jævnet med nivelleret.</li>
	<li>For at undgå hypotermi skal der sættes en varmepude under dyret, der indsættes en rektal temperatursonde, og temperaturen indstilles til 37 °C. Beskyt dyrets øjne mod at tørre ud ved hjælp af en dråbe oftalmisk salve på hvert øje.</li>
	<li>Påfør et smertestillende, såsom Carprofen (5 mg/kg kropsvægt), subkutisk før operationen påbegyndes.</li>
	<li>Med en sprøjte subkutanely injicere op til 0,2 ml bupivacain 0,25% og vente 30 s for den lokale anæstesi at træde i kraft.</li>
	<li>Desinficere de barberede områder grundigt med en antiseptisk, såsom octenidin dihydrochlorid.</li>
	<li>Efter grundig desinfektion af det kirurgiske område, bruge en skalpel til at placere et snit i toppen af hovedet og bruge en saks til at fortsætte snittet ned til forlemmer. Eksponere kraniet ved hjælp af bulldog klemmer og tør periosteum med en steril bomuld-tippet applikator.</li>
	<li>Juster enten en pen eller spidsen af en kanyle, der er plettet med sort blæk, med bregma, og brug de relevante koordinater til at markere de tre indgangspunkter for hjernedylene på kraniet (koordinater for de bilaterale huller, der er nødvendige for perfusion af de basale ganglier: forreste/bageste: + 0,74 mm mediale/laterale: +/- 1,50 mm (+ med angivelse af højre side, - venstre side i forhold til bregma), koordinater for hullet på midterlinjen af lillehjernen: forreste/posterior: - 6,90 mm). Derefter bores hullerne forsigtigt for den dobbelte kanyle, der er udpeget til de basale ganglier, og den enkelt kanyle, der er udpeget til lillehjernen (Figur 1A).</li>
	<li>Bor et fjerde hul til en lille skrue mellem striatum og lillehjernen. Denne skrue vil i sidste ende blive indlejret i dental cement og give ekstra hold til kanyler. Brug fine hjã 0 og en skruetrækker, indfør forsigtigt skruen ind i det lille hul, indtil den er fast fastgjort i kraniet. Implantat ikke skruen for dybt, da dette skader hjernevævet. BEMÆRK: Det anbefales at fortsætte med den osmotiske pumpeimplantatation, før du indsætter de osmotiske kanyler. Derved undgås utilsigtet skade på kanylerne ved implantering af pumperne.</li>
	<li>For at skabe en lille lomme til den osmotiske pumpe på hver side af dyrene tilbage, skal du bruge vævskraft til at adskille de subkutane vævslag. Fremstil forknierne mod det ene bagben og åbn spånerne en smule for at udvide den subkutane lomme. Gentag den samme procedure for den anden side, først fjerne snævn fra snittet og derefter skubbe dem forsigtigt mod det andet bagben. BEMÆRK: Lommen skal gøre det nemt for pumpen at glide ind, men den bør ikke have for meget plads til at bevæge sig under huden.</li>
	<li>Ved hjælp af vævskraft, skal du tage den første pumpe sammen med det tilsluttede stykke slange og skubbe den i en subkutan lomme. Gentag den samme procedure med den anden pumpe.</li>
	<li>Ved hjælp af en minipumpholder indføres en enkelt osmotisk kanyle med en brugerdefineret længde på 3,0 mm i hullet boret i lillehjernens midterlinje. Fjern kanylehovedet omhyggeligt og fastgør kanylen samt den lille skrue med dentalcement, idet det skal passe på, at tilslutningsstykket ikke dækker tilslutningsstykket til slangen på den osmotiske pumpe. Sørg for, at tandcementet omkring kanylen er helt tørret, før du fortsætter med kirurgi.</li>
	<li>Før du indsætter en dobbelt kanyle med en center-til-center afstand på 3,0 mm og skræddersyet længde på 4,0 mm i bilateralt borede huller over de basale ganglier, vedhæfte to korte stykker vinyl slanger (0,5 cm) til de to forbinder stykker af den dobbelte kanyle. Tilslut vinylslangerne med en bifurcation adapter, og opfyld forsigtigt hele slangesystemet, herunder adapteren og kanylen, med ouabainopløsning eller køretøj (stuetemperatur, steril filtreret på forhånd). Dette kan gøres bedst med en 1 ml sprøjte og en 27 G påfyldningskanyle, der indføres i den enkelte bagende af bifureringsadapteren (Figur 1B).</li>
	<li>Ved hjælp af en minipumpholder skal du forsigtigt sætte dobbelt kanylen ind i de bilaterale huller. Brug en klemme til at løsne kanylen hovedet og fastsætte den dobbelte kanyle med dental cement.</li>
	<li>Tilslut katetrene på osmotiske pumper til henholdsvis bifurcation adapteren samt den enkelte kanyle. Sørg for, at kateterne har et stærkt greb på kanylers forbindende stykker. BEMÆRK: Begge pumper har en jævnstrømningshastighed, så vær omhyggelig med at forbinde osmotisk pumpe med den dobbelte koncentrerede opløsning til bifurcation adapteren for at sikre, at den samme koncentration når både de basale ganglier og lillehjernen.</li>
	<li>Luk snittet på bagsiden af dyrene med sting så vidt muligt i retning af kraniet, passe på ikke at overbelaste huden (Figur 1C).</li>
	<li>Subkutanet injicere 0,5 ml 0,9% saltvand, som bør have kropstemperatur, i en hudfold på hver side af bagsiden af dyrene for at undgå dehydrering af musene, omhyggeligt undgå pumperne.</li>
</ol>3. Motor udfordring
<ol><li>Forsøgsperson for ouabain- eller køretøjsperfunderede mus til udfordrende motoriske opgaver som en form for mild stresseksponering 4 timer efter operationen og gentagne gange hver 24 timer derefter for at fremkalde dystonilignende bevægelser. Dette omfatter ikke en adfærdsmæssig karakterisering. dens formål er at fremkalde et højere stressniveau i forhold til normal bure.</li>
	<li>Placer musen på en 50 cm ru-overflade, træstang med en diameter på 1 cm, næse vender nedad. Sørg for, at stangen er placeret i et stort bur med nok strøelse i tilfælde af fald. Det er ikke nødvendigt at måle tidspunktet for nedstigning, men pas på ufrivillige hyperextensioner af forreste lemmer og bagbensgivet af ouabain-perfunderes dyr, mens nedstammer stangen. Lad mus ned i stangen tre gange og tillade 2 min af opsving mellem nedstigninger. BEMÆRK: Ouabain-perfunderes mus bør præsentere første symptomer som bradykinesi 4 h efter operationen. Men, 24 h efter operationen mus bør begynde at præsentere ufrivillige hyperextensioner af forreste lemmer og bagben som et tegn på dystoni-lignende bevægelser under nedstigning.</li>
	<li>For den anden motoriske opgave, placere mus på den roterende stang som gjort for Rotarod ydeevne test. Rotarod apparatet bruges ikke som et mål for latenstid til at falde, målet er at udsætte mus for tvungen aktivitet. Placer musene på den roterende stang tre gange og lad 2 min af nyttiggørelse mellem test. BEMÆRK: For at øge stresseksponeringen skal du bruge et accelererende Rotarod-apparat. For det projekt, der er beskrevet heri, accelererer stangen fra 5 til 50 omdr./min. over en bestemt periode på 300 sek.</li>
	<li>Lad dyrene komme sig i 30 minutter mellem poletesten og Rotarod-præstationstesten og igen yderligere 30 minutter, før de scorer for dystonilignende bevægelser som beskrevet under protokoltrin 4. I mellem de gentagne stress eksponeringer, tillade mus at inddrive for 24 h-intervaller.</li>
</ol>4. Scoringssystemer til vurdering af dystonilignende bevægelser
BEMÆRK: Eksperimentatoren skal gøres blinde for gruppetildelingen analyseret for at forhindre bias. De adfærdsmæssige tests, der anvendes til at karakterisere fænotype af musene er to scoring systemer: en dystoni rating skala scoring unormal, dystoni-lignende bevægelser og en adfærdsmæssig score ved hjælp af halen suspension test. Vurder de dystonilignende bevægelser efter en restitutionstid på 30 minutter efter eksponering for mild stress.
<ol><li>Dystoni rating skala BEMÆRK: På grund af manglen på foruddefinerede adfærdsmæssige opgaver, dystoni rating skala blev etableret som en observatør-baseret scoring system svarende til den kliniske rating skalaer af human dystoni. Det er en modificeret version af dystoni rating skala, der anvendes af Calderon et al.13.<ol>
<li>Optag kropsholdning og gangart af dyr over en periode på 4 min efter dyr er blevet placeret i en plastik eller trækasse.</li>
		<li>Score for frekvens og fordeling af dystoni-lignende bevægelser fra 0 til 4 point: (0) normal motoradfærd; (1) unormal motorisk adfærd, ingen dystoni-lignende bevægelser; (2) mild motorisk svækkelse med mild fokale dystoni-lignende bevægelser; 3) moderat motorisk svækkelse med alvorlige fokale dystonilignende bevægelser (4) alvorlig svækkelse, med vedvarende, generaliseret dystoni-lignende bevægelser (Figur 2). Overvej følgende bevægelser eller stillinger som dystoni-lignende: hyperextension af forreste lemmer, bred holdning eller hyperextension af hindlimbs samt kyphosis. Overvej dystoni som fokal i tilfælde af en enkelt kropsdel er påvirket, og som generaliseret i tilfælde af stammen og mindst to andre kropsdele er berørt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test af haleaffjedring BEMÆRK: Haleaffjedringstesten bruges ofte til at observere og score for hindlimb clasping. Dette er dog en meget uspecifik fænotype, der indikerer en motorisk svækkelse. Følgende protokol foreslår et pointsystem, der er specifikt for dystonilignende bevægelser. På grund af generalisering af dystoni hos DYT/PARK-ATP1A3 patienter, dystoni-lignende bevægelser bør vurderes i forreste lemmer, krop og bagben. En nyudviklet scoring system fra 0-8 point blev udviklet, en samlet score < 2 viste, at ingen dystoni-lignende bevægelser var til stede (Figur 3).<ol>
<li>Saml musen op ved halen nær sin base og løft dyret op. Optag en 2 min video af haleaffjedringstesten, og tildel en score i en efterfølgende, grundig analyse af optagelsen.</li>
		<li>Score de forreste lemmer fra 0 til 4 point, hvor gentagne eller vedvarende tonic tilbagetrækninger af en eller begge forreste lemmer, samt en hyperextension kombineret med passage af de forreste lemmer, blev klassificeret som dystoni-lignende: (0) ingen unormale bevægelser; 1) nedsat bevægelse af frontekstremiteter med hyperextension af poter set ≥ 50% af den registrerede tid; (2) mild dystoni-lignende bevægelser af forlemskab (er) < 50% af den registrerede tid; 3) milde dystonilignende bevægelser af forlemskab(er) ≥ 50 % af den registrerede tid eller alvorlige < 50 % af den registrerede tid (4) alvorlige dystonilignende bevægelser af forlemskaber ≥ 50 % af den registrerede tid. BEMÆRK: Hindlimb clasping er en unormal bevægelse, der ikke bør scores som dystoni-lignende.</li>
		<li>Score hindlimbs fra 0 til 3 point, hvor tilbagetrækning og knyttede af bageste lemmer samt vedvarende hyperextension blev vurderet som dystoni-lignende: (0) ingen unormale bevægelser; 1) nedsat bevægelse af bagben med hyperextension af poter set ≥ 50% af den registrerede tid; (2) dystoni-lignende bevægelser af en hindlimb; (3) dystoni-lignende bevægelser af begge hindlimbs.</li>
		<li>I tilfælde af truncal forvrængning > 80% af den registrerede tid, føjes der et ekstra point til scoren.</li>
		<li>Placer dyret tilbage i sit bur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Atp1a3+mutant+mice+as+a+model+of+rapid-onset+dystonia+with+parkinsonism.">Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism.</a> Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).</li><li>Dang, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+Dyt1+DeltaGAG+knock-in+mouse+as+a+model+for+early-onset+dystonia.">Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia.</a> Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).</li><li>Kreiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mechanisms+in+genetic+models+of+neurodegeneration:+are+the+mice+better+than+humans.">Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).</li><li>Albanese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenology+and+classification+of+dystonia:+a+consensus+update.">Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update.</a> Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).</li><li>Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+symptomatic+hemidystonia.">The anatomical basis of symptomatic hemidystonia.</a> Brain. 108, 463-483 (1985).</li><li>Carbon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensorimotor+network+activity+in+DYT1+dystonia:+a+functional+imaging+study.">Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study.</a> Brain. 133, 690-700 (2010).</li><li>Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+metabolism+in+primary+torsion+dystonia:+effects+of+penetrance+and+genotype.">Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype.</a> Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).</li><li>de Carvalho Aguiar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+Na+/K++-ATPase+alpha3+gene+ATP1A3+are+associated+with+rapid-onset+dystonia+parkinsonism.">Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism.</a> Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).</li><li>Brashear, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotypic+spectrum+of+rapid-onset+dystonia-parkinsonism+(RDP)+and+mutations+in+the+ATP1A3+gene.">The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene.</a> Brain. 130 (3), 828-835 (2007).</li><li>Barbano, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+triggers+and+non-motor+findings+in+a+family+with+rapid-onset+dystonia-parkinsonism.">New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).</li><li>Isaksen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+dystonia+and+abnormal+cerebellar+activity+in+a+mouse+model+with+a+single+disease-mutation+in+the+sodium-potassium+pump.">Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump.</a> PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).</li><li>Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterozygous+mice+deficient+in+Atp1a3+exhibit+motor+deficits+by+chronic+restraint+stress.">Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress.</a> Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).</li><li>Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+substrates+of+rapid-onset+Dystonia-Parkinsonism.">The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).</li><li>Cutsforth-Gregory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+exercise+dystonia:+A+difficult+to+treat+hazard+of+runner+and+non-runner+athletes.">Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 27, 74-80 (2016).</li><li>Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Cerebellar+Signaling+Induces+Dystonia+in+Mice.">Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).</li><li>Jinnah, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+agonists+and+dystonia+in+the+mouse.">Calcium channel agonists and dystonia in the mouse.</a> Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).</li><li>Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+dopaminergic+dysregulation+and+dystonia-like+movements+induced+by+sensorimotor+stress+in+a+pharmacological+mouse+model+of+rapid-onset+dystonia-parkinsonism.">Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism.</a> Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).</li><li>Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPTP+potentiates+3-nitropropionic+acid-induced+striatal+damage+in+mice:+reference+to+striatonigral+degeneration.">MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).</li><li>Guyenet, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+composite+phenotype+scoring+system+for+evaluating+mouse+models+of+cerebellar+ataxia.">A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia.</a> Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).</li><li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tor1a+/-+mice+develop+dystonia-like+movements+via+a+striatal+dopaminergic+dysregulation+triggered+by+peripheral+nerve+injury.">Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Denne DYT/PARK-ATP1A3 farmakologiske musemodel giver mulighed for en detaljeret analyse af intracerebral strukturelle og neurokemiske ændringer, der udelukkende induceres ved hæmning af natrium-kaliumionpumpen i de basale ganglier og cerebellum samt ændringer i forbindelse med stresseksponering. I tilfælde af mus kan maksimalt to osmotiske pumper implanteres subkutende. Vi heri præsentere en metode beskriver kronisk lægemiddellevering til flere hjernestrukturer ved at gennemføre en dobbelt kanyle forbundet til en bifurcation adapter ud over en enkelt kanyle. Denne metode kan bruges til enhver anvendelse, der kræver flere hjernestrukturer, der skal perfunderes samtidigt og kronisk.
Vi præsenterer en musemodel af en sjælden bevægelsesforstyrrelse, hvor patienter udvikler permanente symptomer efter udsættelse for stress. Denne formodede gen-miljømæssige interaktion er stadig ikke godt forstået, men kan repræsentere en af de vigtigste pathomechanisms i DYT/PARK-ATP1A3 udvikling. Forskellige metoder til at udsætte mus for stress er blevet offentliggjort i fortiden og omfatter elektriske fod stød, fastholdende, koldt eller varmt miljø og udsættelse for forskellige lugte11,,12,13. I et forsøg på at udsætte mus for en mild stressfaktor med translationel værdi beskriver vi heri musenes gentagne underkastelse af udfordrende motoriske opgaver. Til poletesten afslørede ouabain-perfunderede dyr ufrivillig hyperextension af forlemme og bagben. Disse bevægelser var meget lig de dystoni-lignende bevægelser observeret under 4-min videooptagelse af dyrene samt hale suspension test. Anvendelsen af mild stress i form af udfordrende motoriske opgaver kan vise sig nyttige i andre musemodeller, der viser motoriske symptomer eller neurodegeneration, hvor gen-miljømæssige interaktioner massivt påvirker graden af sygdomsprogression.
Der er en generel mangel på foruddefinerede adfærdsmæssige opgaver samt rating skalaer til at klassificere unormale bevægelser og stillinger i mus. De fleste af de tilgængelige motoriske opgaver afslører uspecifik abnormiteter, såsom hindlimb clasping, som er et velkendt fænomen i mange musemodeller af bevægelsesforstyrrelser med neurodegeneration18,19. For den korrekte karakterisering af en fænotype, er det dog nødvendigt at analysere, om musen model opsummerer de fremtrædende funktioner i sygdommen. Heri præsenterer vi den modificerede version af en dystoni rating skala, der tidligere blev brugt til vurdering af motoriske handicap i dystoni musmodeller 15,16. Vi udviklede desuden et observatørbaseret pointsystem til haleaffjedringstesten, som blev etableret på samme måde som de kliniske klassificeringsskalaer for human dystoni. Begge karakterskalaer viser en signifikant højere score i ouabain-perfunderes, stressede mus sammenlignet med ouabain-perfunderes, ikke-stressede dyr samt køretøjsperfunderede dyr. Ulemperne ved ethvert observatørbaseret pointsystem er den nødvendige uddannelse af raters for at sikre en konsekvent scoring og for at reducere observatørvariationen samt faren for en mulig skævhed i rateren, hvis ikke helt forblændet til den analyserede gruppe. Observatørbaserede scoringssystemer udgør dog stadig en lettilgængelig metode til at karakterisere en fænotype og kan tilpasses musemodellen analyseres, som det gøres i dette projekt til vurdering af dystonilignende bevægelser. For at sikre en ensartet score blandt forskellige bedømmere bør træningsvideoer gøres tilgængelige. For at reducere eventuelle bias, anbefales det, at forskellige raters score de samme videoklip, og at de enkelte scores er i gennemsnit. Begge scoringssystemer, der er nævnt i dette arbejde, registrerer tilstedeværelsen af dystonilignende bevægelser hos dyr. Karakterskalaerne kan tilpasses efter de specifikke krav i et projekt, som tidligere er udført af Ip et al., hvor der udelukkende blev scoret bagben for dystonilignende bevægelser i en musemodel for dystoni 1 (DYT-TOR1A)20. Ratingskalaerne kan suppleres af andre tidligere offentliggjorte scoringssystemer, der for eksempel vurderer graden af bradykinesi hos gnavere som udført med den bevægelseshandicapscore, som Calderon et al.13 .

Fordelene ved en kontinuerlig levering af narkotika direkte ind i hjernen er talrige. Gentagne og hyppige injektioner, som repræsenterer en unødvendig stressfaktor for dyr, kan undgås, og der kan opnås en mere konstant intracerebral koncentration af lægemidlet. Dette gælder især, når systemisk administreret medicin undlader nemt at trænge ind i blod-hjerne barrieren. Desuden, kronisk lægemiddellevering via osmotiske pumper giver mulighed for lokaliseret levering af substrater, der ellers ville have hele systemet bivirkninger. Narkotika kan leveres på en målrettet måde til de ønskede hjernestrukturer, den deraf følgende effekt kan således spores direkte. Dette kan udnyttes til en række applikationer, såsom undersøgelse af terapeutiske virkninger samt undersøgelse af pathomechanisms. Denne sidste ansøgning blev brugt i projektet heri for at skabe en farmakologisk musemodel for dystoni.
Analysen og forståelsen af dystonisk syndromer, som repræsenterer den tredje mest almindelige bevægelsesforstyrrelse, har været stærkt begrænset af det faktum, at genetiske dyremodeller stort set undlader at reproducere sygdommen fænotype findes i syge mennesker samt patofysiologi. Dette spørgsmål er ikke begrænset til dystoniske syndromer, men vedrører faktisk mange transgene gnavere modeller inden for bevægelsesforstyrrelser1,,2. Årsagen til manglen på fænotype i transgene gnaveremodeller kan være baseret på yderst effektive kompenserende mekanismer3. I tilfælde af dystoni, sygdommen er karakteriseret ved ufrivillige muskelsammentrækninger forårsager vride bevægelser og unormale stillinger4. Undersøgelsen af sekundære årsager (dvs. hjerneskade) af dystoniske symptomer, har bidraget til at identificere de strukturer, der er involveret i manifestationen af disse motoriske abnormiteter, såsom de basale ganglier5. Hjernescanningsundersøgelser af arvelige former for dystoni har vist funktionelle abnormiteter i næsten alle hjerneregioner, der er ansvarlige for motorisk kontrol og sensorisk integration6,7. Men, gnaver modeller er stadig behov for at uddybe forståelsen af de neurale dysfunktioner på en molekylær og storstilet netværksniveau samt for udvikling af terapeutiske muligheder. Det er her farmakologiske musemodeller giver mulighed for at kopiere de kliniske og patologiske træk ved en sygdom på en mere præcis måde.
Hurtig debut dystoni-parkinsonisme (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) er en af de arvelige former for dystoni. Det er forårsaget af tab af funktion mutationer i ATP1α3 genet, som koder for α3-underenhed af Na+/ K+-ATPase8. Endvidere er det anerkendt, at genmutation luftfartsselskaber kan være fri for symptomer i årevis, før akut udvikle vedvarende generaliseret dystoni og parkinsonisme efter udsættelse for en stressende begivenhed. Faktisk er penespring af DYT/PARK-ATP1A3 ufuldstændige og stressende begivenheder, der fungerer som en udløser spænder fra fysisk overanertion og ekstreme temperaturer til overforbrug af alkohol og infektioner9,10. For at studere DYT/PARK-ATP1A3 og finde potentielle terapeutiske indgreb, er det blevet forsøgt adskillige gange at efterligne den stressafhængige sygdomsudvikling i gnavere modeller. Men bortset fra den ene eksisterende genetiske DYT/PARK-ATP1A3 mus model, hvor forbigående unormale og kramper-lignende bevægelser blev induceret af hypotermi, alle offentliggjorte genetiske musemodeller for DYT /PARK-ATP1A3 har undladt at producere dystoniskesymptomer 1,11,12. Calderon et al. har tidligere vist, at blokering af α3-underenhed bilateralt i de basale ganglier og lillehjernen via hjerteglycosid ouabain i vilde type mus resulterer i mild gangforstyrrelser13. Den yderligere eksponering for elektriske fodstød i et varmt miljø førte til en dystonisk og bradykinetisk fænotype, hvilket viser, at kronisk og målrettet perfusion af ouabain efterfulgt af stress med succes efterligner DYT/PARK-ATP1A3 fænotype.
Men, udsætter dyr for elektriske fodstød i et varmt miljø på 38-40 °C over en to timers periode inducerer smerte og angst hos dyr, som repræsenterer confounding faktorer, især for vurdering af ændringer i katekolamin system i forbindelse med udviklingen af dystoni. Således vi heri beskrive en anden form for stress paradigme med høj translationel værdi, som vedrører tilbage til det faktum, at mild til moderat motion er blevet beskrevet som udløser i DYT /PARK-ATP1A3 patienter9. Desuden gentagne motion er en velkendt udløser for fokal dystoni14. Mus blev gentagne gange udsat for udfordrende motoriske opgaver, der bestod af tre nedstigninger af en træstang ("pole test") og tre kører på en Rotarod apparat ("Rotarod performance test"). Placeringen af dyr på toppen af en 50 cm træstang blev brugt til at tvinge dyrene til at stige ned, Rotarod apparatet blev ansat til at underkaste mus til tvungen aktivitet ved at placere dem på en roterende stang.
Karakteriseringen af motorfænotypen af en musemodel for dystoni er særlig udfordrende på grund af manglen på foruddefinerede tests og scorer. Der er imidlertid gentagne gange i de seneste år blevet anvendt en variation af en vurdering af motorisk invaliditet for at vurdere sværhedsgraden og fordelingen af dystonilignende bevægelser hos gnavere13,15,16. Vi heri præsentere en modificeret version af dystoni rating skala, som viste sig at være effektiv til at vurdere dystoni-lignende fænotype af dyr, når observeret over en periode på fire minutter. Som en anden metode til vurdering af dystoni-lignende bevægelser præsenterer vi et nyudviklet pointsystem til vurdering af unormale bevægelser under en haleaffjedringstest. Det giver mulighed for vurdering af hyppigheden og varigheden af dystoni-lignende bevægelser og stillinger af de forreste lemmer, bagben samt trunk.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% saline</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>PZN06178437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet osmotic pumps</td>
			<td>Durect</td>
			<td>4317</td>
			<td>model 1002, &#64258;owrate 0.25 &#956;L/h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anchor Screws</td>
			<td>AgnTho&#39;s</td>
			<td>MCS1x2</td>
			<td>2 mm long with a thread of 1mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulldog Clamps</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>13-320-035</td>
			<td>straight, 3.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacain 0.25% Jenapharm</td>
			<td>mibe GmbH Arzneimittel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula and Minipump Holder</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51636</td>
			<td>designed to hold 3.4 mm cannula heads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Bifurcation</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>21Y</td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula tubing</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>C312VT/PKG</td>
			<td>vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>fine forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye cream Bepanthen</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56109M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1070-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td>prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane System Dr&#228;ger Vapor 19.3</td>
			<td>Dr. Wilfried M&#252;ller GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kallocryl A/C</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>1615</td>
			<td>dental cement, liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kallocryl CPGM rot</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>1692</td>
			<td>dental cement, red powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonates adaptor</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>51625</td>
			<td>adaptor for mice for a traditional U-frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle holder</td>
			<td>KLS Martin Group</td>
			<td>20-526-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>51649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octenisept</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td>118211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>3280PD-3.0/SPC</td>
			<td>28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>3280PM/SPC</td>
			<td>28, Gauge, custom length 3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ouabain octahydrate 250 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03125-250MG</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Kern &#38; Sohn</td>
			<td>PFB 6000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal Thermal Probe</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl 50 mg/mL, injectable</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Carprofen, prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53800M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotaRod Advanced</td>
			<td>TSE Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw driver set</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>30090-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Burrs</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>HM71009</td>
			<td>0.9 mm &#216; burr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Burrs</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>HM71014</td>
			<td>1.4 mm &#216; burr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoDrive</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic instrument</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td></td>
			<td>custom made by Neurostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic robot</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture: coated vicryl, polyglatin 910</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V797D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for dyt/park-atp1a3 dystonia

Genetisk modificerede musemodeller har begrænsninger, især når man studerer bevægelsesforstyrrelser, hvor de fleste af de tilgængelige transgene gnavere modeller ikke udgør en motorisk fænotype, der ligner de kliniske aspekter af den menneskelige sygdom. Farmakologiske musemodeller giver mulighed for en mere direkte undersøgelse af pathomechanisms og deres virkning på adfærdsmæssige fænotype. Osmotiske pumper forbundet til hjerne kanyler åbne mulighed for at skabe farmakologiske musemodeller via lokale og kroniske lægemiddellevering. For den arvelige bevægelsesforstyrrelse af hurtig debut dystoni-parkinsonisme, tab-of-funktion mutation i α3-underenhed af Na+/ K+-ATPase kan simuleres ved en meget specifik blokade via glycoside ouabain. For lokalt at blokere α3-underenheden i de basale ganglier og lillehjernen, som er de to hjernestrukturer, der menes at være stærkt involveret i patogenesen af hurtig debut dystoni-parkinsonisme, en bilateral kanyle er stereotaxically implanteret i striatum og en ekstra enkelt kanyle indføres i lillehjernen. Kanylene er forbundet via vinylrør til to osmotiske pumper, som subkutant implanteres på bagsiden af dyrene og giver mulighed for kronisk og præcis levering af ouabain. Den farmakologiske musemodel for hurtig debut dystoni-parkinsonisme bærer den yderligere fordel at opsummere de kliniske og patologiske træk ved asymptomatiske og symptomatiske mutation bærere. Ligesom mutation bærere af hurtig-debut dystoni parkinsonisme, ouabain-perfunderes mus udvikle dystoni-lignende bevægelser kun efter yderligere eksponering for stress. Vi demonstrerer et mildt stressparadigme og indfører to modificerede pointsystemer til vurdering af en motorisk fænotype.

Figur 4 er blevet ændret fra Rauschenberger et al.17. Ved dataanalyse af både dystoniklassificeringsskalaen (A) og haleaffjedringsprøven (B) beregnes den samlede score for hvert klokkeslætspunkt for hvert dyr. Gennemsnittet for hvert tidspunktspunkt og hver gruppe skal afbildes på en passende graf. Fordelingen af værdierne bør undersøges, og der bør anvendes en passende statistisk test for at fastslå betydningen. Med et tilstrækkeligt antal dyr kan der påvises en motorisk fænotype både med dystoniklassificeringsskalaen og med vurderingen af unormale bevægelser i haleaffjedringstesten. Den dystoni-lignende fænotype demonstreres ved den signifikant højere motorscore i begge vurderinger i den ouabain-perfunderede, stressede gruppe sammenlignet med ouabain-perfunderes, ikke-stressede mus samt kontrolmusene.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg"> Figur 1: De vigtigste kirurgiske trin for kanyle og osmotisk pumpeimplantatation. AA) For de angivne koordinater skal der bores huller bilateralt for den dobbelte kanyle, der er udpeget for de basale ganglier, og for den enkelte kanyle, der er anbragt ved lillehjernens midterlinje. De to fuldt konstruerede osmotiske pumper er vist på hver side af dyret. (B) Billedet viser en implanteret, enkelt kanyle i lillehjernen, fastgjort med dental cement. Den dobbelte kanyle til de basale ganglier bør forbindes til bifurcation adapter og fyldt med ouabain før implantation. (C) Billede af den færdige procedure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg"> Figur 2: Vurdering af dystoni-lignende bevægelser med en dystoni rating skala. I løbet af en 4 min video, dystoni-lignende bevægelser blev scoret baseret på kroppens fordeling og varighed. Ufrivillig hyperextension af de forreste lemmer, en bred holdning eller hyperextension af hindlimbs samt kyphosis blev bedømt som dystoni-lignende. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg"> Figur 3: Vurdering af dystonilignende bevægelser under en haleaffjedringstest. Den nyudviklede scoring system for unormale bevægelser i løbet af en 2 min hale suspension test evaluerer dystoni-lignende bevægelser i forreste lemmer, bagben og stammen fra 0-8 point i alt. For de forreste lemmer, en hyperextension og passage af de forreste lemmer samt en tonic fleksion mod stammen kvalificeret som dystoni-lignende. For hindlimbs den ufrivillige hyperextension samt tilbagetrækning med forlængelse over midterlinjen blev scoret som dystoni-lignende. En truncal forvrængning over 80% af den registrerede tid blev scoret med et point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentative grafer over dystoni-ratingskalaen og haleaffjedringsprøven. (A) Grafen viser dystoni-rating skala for NaCl-perfunderes, stressede mus (stiplet sort linje), ouabain-perfunderes, ikke-stressede mus (stiplede orange linje) og ouabain-perfunderes, stressede mus (mørkeblå linje). For hvert tidspunkt vises middelværdierne ± standardfejl i middelværdien (SEM). (B) Diagrammet viser vurderingen af unormale bevægelser under en 2-minutters hale suspension test for NaCl-perfunderes, stressede mus (stiplet sort linje), ouabain-perfunderes, ikke-stressede mus (stiplet orange linje) og ouabain-perfunderes, stressede mus (mørkeblå linje). Statistisk analyse blev udført for dystoni rating skala og hale suspension test scoring ved hjælp af to-tailed Mann-Whitney test. Bonferroni-Holm korrektion (§) af p-værdierne viste en signifikant forskel for observationsperioden på 72 timer. Mørkeblå * betegner signifikante forskelle mellem ouabain-perfunderet, stressede mus og ouabain-perfunderes, ikke-stressede mus mus, sort * betegner betydelige forskelle mellem NaCl-perfunderet, stressede mus og ouabain-perfunderes, stressede mus samt mellem NaCl-perfunderes, stressede mus og ouabain-perfunderes, ikke-stressede mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia at JoVE.com

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Vi leverer en protokol til at generere en farmakologisk DYT/PARK-ATP1A3 dystoni musemodel via implantation af kanyler i basale ganglier og lillehjernen forbundet til osmotiske pumper. Vi beskriver induktion af dystoni-lignende bevægelser via anvendelse af en motorisk udfordring og karakterisering af fænotypen via adfærdsmæssige scoringssystemer.

Implantation af osmotiske pumper og induktion af stress for at etablere en symptomatisk, farmakologisk musemodel for DYT/PARK-ATP1A3 Dystoni

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Det overordnede mål med denne protokol er at beskrive de procedurer, der er involveret i at etablere en symptomatisk, farmakologisk musemodel for DYT/PARK-ATP1A3 dystoni ved hjælp af hjernekanyler i osmotiske pumper og ved at fremkalde stress via udfordrende motoriske opgaver. Denne metode beskriver, hvordan man etablerer en farmakologisk musemodel ved hjælp af kronisk lægemiddellevering via osmotiske pumper til flere hjernedyler, og hvordan man fremkalder fænotypen via udfordrende motoriske opgaver. Det milde motoriske stressparadigme giver også indsigt i den rolle, som gen-miljømæssige interaktioner i bevægelsesforstyrrelser, og kan anvendes på andre gnavere modeller.Dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med gældende nationale og institutionelle retningslinjer for pasning og anvendelse af dyr. Begynd med at forberede osmotiske pumper i et sterilt miljø. Først fyldes en 1 millilitersprøjte med en 27 gauge fyldekanyle med sterilt filtreret ouabain-opløsning eller køretøjsopløsning.Hold den osmotiske pumpe oprejst, sæt kanylen helt ind i pumpen og fyld langsomt beholderen, indtil overskydende opløsning vises ovenpå. Sæt derefter flowmoderatoren ind i pumpen. Tag forsigtigt den hvide flange af flow moderator med en saks og tilslut et stykke vinyl slanger til flow moderator.Nedsænk hver pumpe i Eppendorf rør fyldt halvvejs med saltvand opløsning og læg dem i en termocykhøj 37 grader for at sikre, at pumpehastigheden når en stabil tilstand, før du begynder kirurgi. Efter dyret er dybt bedøvet i henhold til godkendte protokoller, placere dyret i en stereotaktisk ramme og fastsætte hovedet ved hjælp af gummispidser eller ikke-bristede ørestænger. Efter grundig desinfektion af det kirurgiske område, bruge en skalpel til at placere snittet i toppen af hovedet og bruge saks til at fortsætte snittet ned til forlemmer.Eksponere kraniet ved hjælp af bulldog klemmer og tør periosteum med en steril bomuld-tippet applikator. Juster enten en pen eller spidsen af en kanyleplettet med sort blæk med bregma og bruge de relevante koordinater til at markere de tre indgangspunkter for hjernen kanyler på kraniet. Dernæst omhyggeligt bore hullerne til den dobbelte kannulære udpeget til de basale ganglier og enkelt kanyle udpeget til lillehjernen.Bor et fjerde hul til en lille skrue mellem striatum og lillehjernen. Denne skrue vil i sidste ende blive indlejret i dental cement og give ekstra hold til kanyler. For at skabe en lille lomme til den osmotiske pumpe på hver side af dyrene tilbage, skal du bruge vævskraft til at adskille de subkutane vævslag.Fremstil forknierne mod det ene bagben og åbn spånerne en smule for at udvide den subkutane lomme. Gentag den samme procedure for den anden side, først fjerne snævn fra snittet og derefter skubbe dem forsigtigt mod det andet bagben. Ved hjælp af stænder, forsigtigt indsætte pumperne og det tilsluttede kateter i hver subkutan lomme.Lommen skal gøre det nemt for pumpen at glide ind. Ved hjælp af en mini pumpe holder, indføre en enkelt osmotisk kanyle med en brugerdefineret længde på 3,0 millimeter i hullet boret i midterlinjen af lillehjernen. Fjern kanylehovedet omhyggeligt og fastgør kanylen samt den lille skrue med dentalcement, idet det skal passe på, at tilslutningsstykket ikke dækker tilslutningsstykket til slangen på den osmotiske pumpe.Sørg for, at tandlægecementet omkring kanylen er helt tørret, før du fortsætter med operationen. Før du indsætter den dobbelte kanyle i de bilateralt borede huller over de basale ganglier, vedhæfte to 0,5 centimeter lange stykker vinyl slanger til de to forbinder stykker af den dobbelte kanyle. Tilslut vinylslangerne med en bifurcation adapter, og opfyld forsigtigt hele slangesystemet med steril ouabainopløsning eller køretøj.Gentag derefter de samme trin som vist tidligere for den enkelte kanyle og slutter ved at fastgøre den dobbelte kanyle med tandcement. Tilslut katetrene på osmotiske pumper til henholdsvis bifurcation adapteren samt en enkelt kanyle. Begge pumper har en jævnstrømningshastighed, så vær omhyggelig med at forbinde den osmotiske pumpe med en dobbelt koncentreret opløsning til bifurcation adapteren for at sikre, at den samme koncentration når både de basale ganglier og lillehjernen.Luk snittet på bagsiden af dyrene med sting så vidt muligt uden at overbelaste huden. Subkutanely injicere sterilt saltvand, som bør have kropstemperatur for at undgå dehydrering. Fjern dyret fra den stereotaktiske ramme og læg det i bjærgningsburet.For at fremkalde dystoni-lignende bevægelser, ouabain-perfunderes mus bør udsættes for udfordrende motoriske opgaver som en mild stress paradigme fire timer efter operationen og gentagne gange hver 24 timer bagefter. Dette omfatter ikke en adfærdsmæssig karakterisering af dyrene. Vi demonstrerer her eksemplet med et køretøj-perfunderes dyr, som er placeret på en 50 centimeter ru overflade træstang, næse vender nedad.Giv nok strøelse i bunden af stangen i tilfælde af fald. For ouabain-perfunderes mus, bør dyrene begynde at præsentere første symptomer som bradykinesi fire timer efter operationen. Men, 24 timer efter operationen, bør du se ufrivillig hyperextension af for- eller bagbenene som et tegn på dystoni-lignende bevægelser under afstamning.Musene skal ned stangen tre gange, så mindst to minutters opsving i mellem hver afstamning. Nedstigningstidstid ikke behøver at blive målt. Stangprøven skal efterfølges af en anden motoropgave ved hjælp af en roterende stang.Som gjort for Rotarod ydeevne test, ouabain og køretøj-perfunderes mus fra stressgrupper er placeret på den roterende stang. Ventetiden til at falde behøver ikke at blive målt. Som gjort for den foregående test, mus bør placeres på den roterende stang tre gange, så to minutters opsving i-mellem kørsler.Den modificerede dystoni rating skala kan bruges til at vurdere hyppigheden, sværhedsgraden, og kroppen fordeling af dystoni-lignende bevægelser af mus. Dyrene skal anbringes i en plastik- eller trækasse, og bevægelserne registreres i en periode på fire minutter. Bedømmerne skal gøres blinde for gruppeopgaven.Bevægelser eller stillinger, der betragtes som dystoni-lignende er ufrivillig hyperextension af forreste lemmer, en bred holdning, eller hyperextension af baglemmer, samt kyphosis. Hvis kun én kropsdel er berørt, dystoni bør betragtes som fokale. Hvis stammen og mindst to andre kropsdele er berørt, dystoni bør betragtes som generaliseret.En anden nyudviklet scoring system fra nul til otte point, evaluerer tilstedeværelsen og sværhedsgraden af dystoni-lignende bevægelser under en hale suspension test. Til testen skal du holde musen op ved halen nær basen i to minutter. Det anbefales at registrere hale suspension test og tildele en score til efterfølgende analyse af optagelserne.Fronten er scoret fra nul til fire point. Gentagne eller vedvarende tonic tilbagetrækninger af en af begge forreste lemmer, samt hyperextension kombineret med passage af de forreste lemmer er scoret som dystoni-lignende. Dystoni-lignende bevægelser af baglemmer, hvilket betyder tilbagetrækning og knyttede, samt vedvarende hyperextension, er scoret fra nul til tre point.En truncal forvrængning, der er til stede over 80 % af den registrerede tid, vises med et ekstra point. Hind lemmer clasping er uspecifik tegn for motorisk svækkelse og bør ikke scores. Denne graf viser resultaterne af dystoni rating skala.De ouabain-perfunderede stressede mus præsenterer betydeligt flere dystonilignende bevægelser over en observationsperiode på 72 timer end den ikke-stress-ouabain-perfunderede gruppe samt køretøjets dyr. Dette billede viser resultaterne fra hale suspension test og viser et lignende resultat til dystoni rating skala. Bemærk, at resultaterne af middeltingen fra det samlede antal dyrs samlede score for hvert tidspunkt.Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man stereotaxically implantat flere hjerne kanyler og hvordan man subkutant implantat osmotiske pumper. Den største fordel ved denne metode er, at gentagne og stressende injektioner kan undgås, og at et substrat som ouabain, som ellers ville have hele systemet bivirkninger kan leveres direkte til en bestemt hjerne strukturer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Live-Imaging af Nikotin induceret Calcium Signaling og neurotransmitterfrigivelse Langs ventrale Hippocampale Axoner

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Implantation af Miniosmotic Pumper og levering af Tract Lysspor at studere Brain Reorganisering i patofysiologiske tilstande

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Measurement &amp; Analysis of the Temporal Discrimination Threshold Applied to Cervical Dystonia

Measurement & Analysis of the Temporal Discrimination Threshold Applied to Cervical Dystonia

Måling og analyse af den tidsmæssige forskelsbehandling tærskel anvendes til cervikal dystoni

The temporal discrimination threshold (TDT) is the shortest time interval at which an observer can discriminate two sequential stimuli as being ...

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Overvågning af effekten af osmotisk Stress på sekretoriske vesikler og exocytose

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Laminektomi og rygmarv vindue implantation i musen

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiografi som en enkel og kraftfuld metode for visualisering og karakterisering af farmakologiske mål

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Kronisk implantation af flere fleksible polymer elektrode systemer

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Forberedelse af perifere nervestimulationselekder til kronisk implantation hos rotter

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Induktion og vurdering af Levodopa-induceret dyskinesier i en rottemodel af Parkinsons sygdom

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...