Name: implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for dyt/park-atp1a3 dystonia
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Ministère fédéral de l’éducation et de la recherche (BMBF DysTract à C.W.I.) et par le Centre interdisciplinaire de recherche clinique (IZKF) de l’Université de Würzburg (Z2-CSP3 à L.R.). Les auteurs remercient Louisa Frieß, Keali Röhm, Veronika Senger et Heike Menzel et pour leur assistance technique ainsi que Helga Brünner pour les soins aux animaux.

Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives internationales, nationales et/ou institutionnelles applicables en matière de soins et d’utilisation des animaux. Les autorités locales du Regierung von Unterfranken, würzburg, Allemagne, ont approuvé toutes les expériences animales.
1. Amorçage des pompes osmotiques
REMARQUE : Cette étape doit être effectuée au moins 48 h avant la chirurgie. Les pompes osmotiques ALZET doivent être préremplies afin de s’assurer que le taux de pompage atteint un état stable avant l’implantation.
<ol><li>Préparez la solution souhaitée pour la perfusion chronique à l’avance. Assurez-vous que le solvant et l’agent sont compatibles avec les pompes et les cathéters osmotiques. Pour le projet dans le présent, décongeler une solution de 10 x de stock d’ouabain (stockée à -20 °C) à température ambiante et vortex pendant 10 s. ATTENTION: Ouabain est toxique: il doit être manipulé uniquement avec des gants et ouvert uniquement sous une hotte stérile pour éviter l’inhalation.</li>
	<li>Allumez le capot stérile; désinfecter le capot ainsi que tous les instruments et matériaux nécessaires avant de les mettre sous le capot.</li>
	<li>Mettez des gants chirurgicaux avant de manipuler les pompes osmotiques. Préparer séparément la solution ouabain désignée pour les pompes du striatum et du cervelet. REMARQUE : Considérez que la concentration de la solution dans la pompe du striatum doit être doublée par rapport à la concentration de la solution dans la pompe désignée pour le cervelet. Cela est dû au fait que la pompe pour le striatum est reliée à une double canule, le débit, cependant, est le même que pour la pompe du cervelet, qui est relié à une seule canule.</li>
	<li>Calculez la quantité de solution nécessaire à l’aide de la formule suivante : taux de livraison de masse (ko) = taux de livraison en volume (Q) x concentration de l’agent dans le véhicule (Cd) Pour le présent projet, les pompes osmotiques ont été amorçées et remplies d’une solution ouabain à une concentration de 11,2 ng/h ou de 0,9% de solution saline pour le groupe témoin.</li>
	<li>Vortex à la fois des solutions ouabain pour 10 s et filtre stérile (c.-à-d. 0,22 μm filtre à l’extrémité de seringue) les dans séparés, nouveaux tubes microcentrifuge, à l’aide d’un filtre différent pour chaque solution.</li>
	<li>Peser les pompes osmotiques vides avec le modérateur de débit (environ 0,4 g).</li>
	<li>Remplissez une seringue de 1 mL d’une canule de remplissage de 27 G (de préférence avec une pointe émoussée) avec une solution ou solution de véhicule filtrée stérile.</li>
	<li>Sortez toutes les bulles d’air de la seringue, maintenez la pompe osmotique en position verticale, insérez la canule jusqu’à la pompe et remplissez lentement le réservoir jusqu’à ce que l’excès de solution apparaisse sur le dessus (évitez le remplissage rapide car cela peut conduire à des bulles d’air dans la pompe). Ensuite, insérez le modérateur d’écoulement dans la pompe (l’excès de solution doit apparaître sur le dessus).</li>
	<li>Retirez le modérateur de flux (environ 5 mm), retirez soigneusement la bride blanche avec des ciseaux et connectez un morceau de tubes en vinyle au modérateur de flux. Assurez-vous que le cathéter a une longueur d’environ 2 cm pour permettre une bonne mobilité de l’animal.</li>
	<li>Peser une fois de plus la pompe osmotique remplie pour s’assurer que la différence de poids entre la pompe remplie et la pompe vide est conforme au poids attendu de la solution chargée. REMARQUE : Pour la plupart des solutions aqueuses, ce poids est égal au volume des microlitres. Si le poids ne correspond pas au volume prévu, l’air peut être emprisonné à l’intérieur de la pompe, qui doit être vidée et rechargée.</li>
	<li>Pour l’amorçage des pompes, préparer deux tubes microcentrifuges de 2 mL, un tube pour le striatum et un pour le cervelet.</li>
	<li>Submergez les pompes dans les tubes microcentrifuge remplis à mi-chemin avec une solution saline de 0,9%. Ne submergez pas l’extrémité ouverte du cathéter. Placez les tubes de microcentrifuge dans un thermocycler pendant 48 h à 37 °C afin de s’assurer que la pompe a atteint un taux de pompage régulier avant l’implantation et que les cathéters sont préremplis.</li>
</ol>2. Implantation de la canule et de la pompe osmotique
<ol><li>Placer la souris (mâle, C57Bl/6N, 11-12 semaines) dans une chambre conçue pour l’anesthésie par inhalation; fixer le débit d’isoflurane à 2-3% et le débit d’oxygène à 2 L/min.</li>
	<li>Une fois que la souris est profondément anesthésiée selon les protocoles approuvés, raser le haut de la tête de l’animal, le cou dorsal et le tiers proximal du dos.</li>
	<li>Placez l’animal dans un cadre stéréotaxique et continuez l’anesthésie avec isoflurane via un masque d’anesthésie de souris conçu pour l’instrument stéréotaxique (débit isoflurane 1,5-2%, 2 L/min d’oxygène).</li>
	<li>À l’aide d’embouts en caoutchouc ou de barres d’oreille non rompues, fixer la tête de l’animal dans le cadre stéréotaxique, en prenant soin que la tête soit nivelée.</li>
	<li>Afin de prévenir l’hypothermie, placez un coussin chauffant sous l’animal, insérez une sonde rectale et réglez la température à 37 °C. Protéger les yeux de l’animal contre le dessèchement en utilisant une goutte d’onguent ophtalmique sur chaque œil.</li>
	<li>Appliquer un analgésique, comme le carprofène (5 mg/kg de poids corporel), sous-cutanéement avant de commencer la chirurgie.</li>
	<li>Avec une seringue sous-cutanéement injecter jusqu’à 0,2 mL de bupivacaine 0,25% et attendre 30 s pour l’anesthésie locale à prendre effet.</li>
	<li>Désinfecter complètement les zones rasées à l’arme d’un antiseptique, comme le dihydrochlorure d’octénidine.</li>
	<li>Après une désinfection complète de la zone chirurgicale, utiliser un scalpel pour placer une incision au sommet de la tête et utiliser des ciseaux pour continuer l’incision jusqu’aux membres avant. Exposez le crâne à l’aide de pinces de bouledogue et essuyez le périoste à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton.</li>
	<li>Aligner soit un stylo, soit la pointe d’une canule tachée d’encre noire avec du bregma et utiliser les coordonnées appropriées pour marquer les trois points d’entrée des canules cérébrales sur le crâne (coordonnées pour les trous bilatéraux nécessaires à la perfusion des ganglions basaux: antérieur/postérieur: + 0,74 mm, médial/latéral: +/- 1,50 mm (+ indiquant le côté droit, - le côté gauche par rapport au bregma); coordonnées pour le trou à la ligne médiane du cervelet: antérieur/postérieur: - 6,90 mm). Ensuite, percer soigneusement les trous pour la double canule désignée pour les ganglions basaux et la canule unique désignée pour le cervelet (figure 1A).</li>
	<li>Percer un quatrième trou pour une petite vis entre le striatum et le cervelet. Cette vis sera éventuellement incorporée dans le ciment dentaire et fournira la cale supplémentaire pour les canules. À l’aide de forceps fins et d’un tournevis, introduisez soigneusement la vis dans le petit trou jusqu’à ce qu’elle soit fermement fixée dans le crâne. N’implantez pas la vis trop profondément car cela endommage le tissu cérébral. REMARQUE : Il est recommandé de poursuivre l’implantation de la pompe osmotique avant d’insérer les canules osmotiques. Cela évite de causer des dommages accidentels aux canules lors de l’implantation des pompes.</li>
	<li>Afin de créer une petite poche pour la pompe osmotique de chaque côté des animaux de retour, utiliser des forceps tissulaires pour séparer les couches de tissu sous-cutané. Avancez les forceps vers une jambe arrière et ouvrez légèrement les forceps afin d’élargir la poche sous-cutanée. Répétez la même procédure pour l’autre côté, d’abord enlever les forceps de l’incision, puis les pousser doucement vers la deuxième jambe arrière. REMARQUE : La poche devrait permettre à la pompe de glisser facilement, cependant, elle ne devrait pas avoir trop d’espace pour se déplacer sous la peau.</li>
	<li>Avec l’aide de forceps de tissu prendre la première pompe avec le morceau connecté de tubes et le glisser dans une poche sous-cutanée. Répétez la même procédure avec la deuxième pompe.</li>
	<li>À l’aide d’un support de minipompe, introduire une seule canule osmotique d’une longueur personnalisée de 3,0 mm dans le trou percé dans la ligne médiane du cervelet. Détachez soigneusement la tête de la canule et fixez la canule ainsi que la petite vis avec du ciment dentaire, en prenant soin de ne pas couvrir la pièce de raccordement pour le tube de la pompe osmotique. Assurez-vous que le ciment dentaire entourant la canule a complètement séché avant de poursuivre la chirurgie.</li>
	<li>Avant d’insérer une double canule d’une distance centrale à centre de 3,0 mm et d’une longueur sur mesure de 4,0 mm dans les trous forés bilatéralement au-dessus des ganglions basaux, attachez deux courts morceaux de tubes en vinyle (0,5 cm) aux deux pièces de raccordement de la double canule. Connectez les tubes en vinyle à un adaptateur de bifurcation et remplissez soigneusement l’ensemble du système de tubes, y compris l’adaptateur et la canule avec une solution ouabain ou un véhicule (température ambiante, stérile filtré à l’avance). Cela peut être fait mieux avec une seringue de 1 mL et une canule de remplissage de 27 G introduite dans l’extrémité arrière unique de l’adaptateur de bifurcation (Figure 1B).</li>
	<li>À l’aide d’un support de minipompe, insérez soigneusement la double canule dans les trous bilatéraux. Utilisez une pince pour détacher la tête de la canule et fixer la double canule avec du ciment dentaire.</li>
	<li>Connectez les cathéters des pompes osmotiques à l’adaptateur de bifurcation ainsi qu’à la canule unique, respectivement. Assurez-vous que les cathéters ont une forte emprise sur les morceaux de raccordement des canules. REMARQUE : Les deux pompes ont un débit égal, alors veillez à connecter la pompe osmotique à la solution double concentrée à l’adaptateur de bifurcation pour s’assurer que la même concentration atteint à la fois les ganglions basaux et le cervelet.</li>
	<li>Fermez l’incision sur le dos des animaux avec des points de suture dans la mesure du possible dans la direction du crâne, en prenant soin de ne pas surmener la peau (Figure 1C).</li>
	<li>Injecter sous-cutanéement 0,5 mL de saline de 0,9%, qui devrait avoir la température du corps, dans un pli de la peau de chaque côté de l’arrière des animaux afin d’éviter la déshydratation des souris, en évitant soigneusement les pompes.</li>
</ol>3. Défi moteur
<ol><li>Sujet des souris ouabain- ou véhicule-perfused à des tâches motrices difficiles comme une forme d’exposition légère de stress 4 h après la chirurgie et répétitivement tous les 24 h par la suite afin d’induire des mouvements dystonia-like. Cela n’inclut pas une caractérisation comportementale; son but est d’induire un niveau de stress plus élevé par rapport à l’élevage normal de cage.</li>
	<li>Placez la souris sur un poteau en bois à surface rugueuse de 50 cm d’un diamètre de 1 cm, le nez orienté vers le bas. Assurez-vous que le poteau est placé dans une grande cage avec suffisamment de literie en cas de chutes. Il n’est pas nécessaire de mesurer le temps de descente, mais de surveiller les hyperextensions involontaires des membres avant et des pattes postérieures présentées par les animaux ouabain-perfusés lors de la descente du pôle. Laissez les souris descendre le pôle trois fois et laisser 2 min de récupération entre les descentes. REMARQUE : Les souris perfusées d’Ouabain devraient présenter les premiers symptômes comme la bradykinésie 4 h après la chirurgie. Cependant, 24 h après la chirurgie des souris devraient commencer à présenter des hyperextensions involontaires des membres avant et des hindlimbs comme signe des mouvements dystonia-like pendant la descente.</li>
	<li>Pour la deuxième tâche motrice, placez les souris sur la tige tournante comme cela a été fait pour le test de performance Rotarod. L’appareil Rotarod n’est pas utilisé comme une mesure de la latence de tomber, le but est de soumettre les souris à l’activité forcée. Placez les souris sur la tige tournante trois fois et laissez 2 min de récupération entre les tests. REMARQUE : Pour augmenter l’exposition au stress, utilisez un appareil Rotarod qui accélère. Pour le projet décrit ci-après, la tige accélère de 5 à 50 tr/min sur une période de temps définie de 300 s.</li>
	<li>Laissez les animaux récupérer pendant 30 min entre le test de pôle et le test de performance rotarod et encore 30 minutes avant de marquer pour des mouvements semblables à la dystonie comme décrit dans l’étape 4 du protocole. Entre les expositions répétitives de stress, permettre aux souris de récupérer pendant 24 h-intervalles.</li>
</ol>4. Systèmes de notation pour l’évaluation des mouvements semblables à la dystonie
REMARQUE : L’expérimentateur doit être aveuglé par l’affectation de groupe analysée pour prévenir les biais. Les tests comportementaux utilisés pour caractériser le phénotype des souris sont deux systèmes de notation : une échelle de notation de dystonie marquant anormale, des mouvements de dystonie-comme et un score comportemental utilisant le test de suspension de queue. Évaluer les mouvements semblables à la dystonie après un temps de récupération de 30 min après l’exposition à un stress léger.
<ol><li>Échelle d’évaluation dystonie NOTE : En raison de l’absence de tâches comportementales prédéfinies, l’échelle d’évaluation de la dystonie a été établie comme un système de notation basé sur les observateurs semblable aux échelles d’évaluation cliniques de la dystonie humaine. Il s’agit d’une version modifiée de l’échelle de notation de la dystonie utilisée par Calderon et al.13.<ol>
<li>Enregistrer la posture et la démarche des animaux sur une période de 4 min après que les animaux ont été placés dans une boîte en plastique ou en bois.</li>
		<li>Score pour la fréquence et la distribution des mouvements de dystonie-like de 0 à 4 points : (0) comportement moteur normal ; (1) comportement moteur anormal, pas de mouvements semblables à la dystonie; (2) l’affaiblissement doux de moteur avec les mouvements focals doux de dystonie-comme ; (3) déficience motrice modérée avec des mouvements graves de dystonie focale; (4) une déficience grave, avec des mouvements soutenus et généralisés de dystonie (figure 2). Considérez les mouvements ou les postures suivants comme dystonia-like : hyperextension des membres avant, position large ou hyperextension des hindlimbs aussi bien que cyphose. Considérez la dystonie comme focale dans le cas où une seule partie du corps est affectée et comme généralisée au cas où le tronc et au moins deux autres parties du corps sont affectés.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test de suspension de queue REMARQUE : Le test de suspension de la queue est souvent utilisé pour observer et marquer pour les fermoirs postérieurs. Il s’agit cependant d’un phénotype très peu spécifique indiquant une déficience motrice. Le protocole suivant propose un système de notation spécifique aux mouvements semblables à la dystonie. En raison de la généralisation de la dystonie chez les patients atteints de DYT/PARK-ATP1A3, les mouvements semblables à la dystonie devraient être évalués dans les membres avant, le tronc et les pattes postérieures. Un nouveau système de notation de 0 à 8 points a été mis au point, un score total < 2 indiquait qu’aucun mouvement semblable à la dystonie n’était présent (figure 3).<ol>
<li>Ramassez la souris près de la queue près de sa base et soulevez l’animal. Enregistrez une vidéo de 2 min du test de suspension de la queue et attribuez une note dans une analyse ultérieure et approfondie de l’enregistrement.</li>
		<li>Marquer les membres avant de 0 à 4 points, où les rétractions toniques répétées ou soutenues d’un ou des deux membres avant, ainsi qu’une hyperextension combinée avec le croisement des membres avant, ont été classées comme dystonia-like: (0) aucun mouvement anormal; (1) mouvement réduit des membres avant avec hyperextension des pattes vues ≥ 50% du temps enregistré; (2) les mouvements légers de dystonie des membres avant des membres avant et de 50 % du temps enregistré; (3) les mouvements semblables à la dystonie légère des membres avant(s) ≥ 50 % du temps enregistré ou graves < 50 % du temps enregistré; (4) mouvements graves semblables à la dystonie des membres avant (s) ≥ 50 % du temps enregistré. NOTE : Le fermoir hindlimb est un mouvement anormal qui ne devrait pas être marqué comme dystonie-comme.</li>
		<li>Marquer les hindlimbs de 0 à 3 points, où la rétraction et le serrage des membres arrière ainsi que l’hyperextension soutenue ont été évalués comme dystonie-like : (0) aucun mouvement anormal ; (1) mouvement réduit des hindlimbs avec hyperextension des pattes vues ≥ 50% du temps enregistré; (2) les mouvements semblables à la dystonie d’un anti-hindlimb; (3) les mouvements dystonia-like des deux hindlimbs.</li>
		<li>En cas de distorsion truncale > 80% du temps enregistré, un point supplémentaire est ajouté au score.</li>
		<li>Remettre l’animal dans sa cage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Atp1a3+mutant+mice+as+a+model+of+rapid-onset+dystonia+with+parkinsonism.">Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism.</a> Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).</li><li>Dang, M. 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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce modèle de souris pharmacologique DYT/PARK-ATP1A3 permet l’analyse détaillée des changements structurels et neurochimiques intracérébraux induits uniquement par l’inhibition de la pompe à ions sodium-potassium dans les ganglions basaux et le cervelet ainsi que des altérations liées à l’exposition au stress. Dans le cas des souris, un maximum de deux pompes osmotiques peuvent être implantées sous-cutanéement. Nous présentons ici une méthode détaillant l’administration chronique de médicaments à de multiples structures cérébrales en mettant en œuvre une double canule reliée à un adaptateur de bifurcation en plus d’une seule canule. Cette méthodologie peut être utilisée pour toute application nécessitant plusieurs structures cérébrales à perfuser simultanément et de façon chronique.
Nous présentons un modèle de souris d’un désordre rare de mouvement, où les patients développent des symptômes permanents après exposition au stress. Cette interaction gène-environnement présumée n’est pas encore bien comprise, mais pourrait représenter l’un des pathomechanisms clés dans le développement de DYT/PARK-ATP1A3. Différentes méthodes d’exposition des souris au stress ont été publiées dans le passé et comprennent des chocs électriques du pied, la restriction, l’environnement froid ou chaud et l’exposition à diverses odeurs11,12,13. Dans un effort pour exposer des souris à un facteur de stress doux avec la valeur translationnelle, nous décrivons ici la soumission répétitive des souris aux tâches motrices difficiles. Pour l’essai de pôle, les animaux ouabain-perfused ont indiqué l’hyperextension involontaire des membres avant et des pattes postérieures. Ces mouvements étaient très semblables aux mouvements de dystonie-comme observés pendant l’enregistrement vidéo de 4 minutes des animaux aussi bien que le test de suspension de queue. L’application d’un stress léger sous forme de tâches motrices difficiles pourrait s’avérer utile dans d’autres modèles de souris présentant des symptômes moteurs ou une neurodégénérescence, où les interactions gène-environnement influencent massivement le degré de progression de la maladie.
Il y a un manque général de tâches comportementales prédéfinies ainsi que des échelles d’évaluation pour classer les mouvements et les postures anormaux chez les souris. La plupart des tâches motrices disponibles révèlent des anomalies non spécifiques, telles que le fermoir de l’arrière, qui est un phénomène bien connu dans de nombreux modèles de souris de troubles du mouvement avec neurodégénérescence18,19. Pour la caractérisation appropriée d’un phénotype, il est cependant nécessaire d’analyser si le modèle de souris récapitule les caractéristiques saillantes de la maladie. Ici, nous présentons la version modifiée d’une échelle de notation de dystonie utilisée précédemment pour l’évaluation de l’incapacité motrice dans les modèles de souris dystonie15,16. Nous avons en outre développé un système de notation basé sur l’observateur pour le test de suspension de queue, qui a été établi de la même manière que les échelles cliniques de notation de la dystonie humaine. Les deux échelles d’évaluation montrent un score significativement plus élevé chez les souris ouabain-perfusées et stressées par rapport aux animaux non-perfusés et non-stressés d’ouabain ainsi qu’aux animaux perfusés par véhicule. Les inconvénients de tout système de notation basé sur les observateurs sont la formation nécessaire des évaluateurs pour assurer une notation cohérente et réduire la variabilité des observateurs ainsi que le danger d’un biais possible du évaluateur s’il n’est pas entièrement aveuglé par le groupe analysé. Toutefois, les systèmes de notation basés sur les observateurs présentent toujours une méthode facilement accessible pour caractériser un phénotype et peuvent être adaptés au modèle de souris analysé, comme le fait le présent projet pour l’évaluation des mouvements semblables à la dystonie. Afin d’assurer une notation uniforme entre les différents évaluateurs, des vidéos de formation devraient être mises à disposition. Pour réduire tout biais potentiel, il est recommandé que les différents évaluateurs marquent les mêmes clips vidéo et que les scores individuels soient calculés en moyenne. Les deux systèmes de notation mentionnés dans ce travail enregistrent la présence de mouvements semblables à la dystonie chez les animaux. Les échelles de notation peuvent être adaptées en fonction des exigences spécifiques d’un projet, comme l’a déjà fait Ip et coll., où les hindlimbs ont été notés uniquement pour les mouvements semblables à la dystonie dans un modèle de souris pour la dystonie 1 (DYT-TOR1A)20. Les échelles d’évaluation peuvent être complétées par d’autres systèmes de notation publiés précédemment, évaluant par exemple le degré de bradykinésie chez les rongeurs comme fait avec le score d’incapacité de locomotion par Calderon et al.13.

Les avantages d’une livraison continue de médicaments directement dans le cerveau sont nombreux. Les injections répétitives et fréquentes, qui représentent un facteur de stress inutile pour les animaux, peuvent être évitées et une concentration intracérébrale plus constante du médicament peut être réalisée. Ceci est particulièrement valable lorsque les médicaments administrés systématiquement ne parviennent pas à pénétrer facilement la barrière hémato-encéphalique. En outre, l’administration chronique de médicaments par pompes osmotiques permet la livraison localisée de substrats qui auraient autrement des effets secondaires à l’échelle du système. Les médicaments peuvent être livrés de manière ciblée aux structures cérébrales souhaitées, l’effet résultant peut donc être directement tracé. Cela peut être utilisé pour un éventail d’applications, telles que l’étude des effets thérapeutiques ainsi que l’étude des pathomécanismes. Cette dernière application a été utilisée dans le projet dans le présent afin de créer un modèle pharmacologique de souris pour la dystonie.
L’analyse et la compréhension des syndromes dystoniques, qui représentent le troisième trouble de mouvement le plus commun, ont été fortement limitées par le fait que les modèles animaux génétiques ne parviennent pas à reproduire le phénotype de la maladie trouvé chez l’homme malade ainsi que la pathophysiologie. Cette question ne se limite pas aux syndromes dystoniques, mais concerne en fait de nombreux modèles transgéniques de rongeurs dans le domaine des troubles du mouvement1,2. La raison de l’absence de phénotype dans les modèles transgéniques de rongeurs pourrait être basée sur des mécanismes compensatoires très efficaces3. Dans le cas de la dystonie, la maladie est caractérisée par des contractions musculaires involontaires causant des mouvements de torsion et des postures anormales4. L’étude des causes secondaires (c.-à-d. lésions cérébrales) des symptômes dystoniques, a aidé à identifier les structures impliquées dans la manifestation de ces anomalies motrices, telles que les ganglions basaux5. Les études d’imagerie cérébrale des formes héréditaires de dystonie ont montré des anomalies fonctionnelles dans presque toutes les régions du cerveau responsables du contrôle moteur et de l’intégration sensorimotrice6,7. Cependant, des modèles de rongeurs sont encore nécessaires pour approfondir la compréhension des dysfonctionnements neuronaux au niveau moléculaire et à grande échelle des réseaux ainsi que pour le développement d’options thérapeutiques. C’est là que les modèles pharmacologiques de souris offrent la possibilité de reproduire les caractéristiques cliniques et pathologiques d’une maladie d’une manière plus précise.
Dystonie-parkinsonisme à début rapide (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) est l’une des formes héréditaires de dystonie. Elle est causée par des mutations de perte de fonction dans le gène ATP1α3, qui code pour la sous-unité α3 de la Na+/K+-ATPase8. En outre, il est reconnu que les porteurs de mutation de gène peuvent être exempts de symptômes pendant des années avant de développer acuité aiguë la dystonie généralisée persistante et le parkinsonisme après exposition à un événement stressant. En effet, la pénétrance de DYT/PARK-ATP1A3 est des événements incomplets et stressants agissant comme une gamme de déclenchement de la surmenage physique et des températures extrêmes à la surconsommation d’alcool et d’infections9,10. Afin d’étudier DYT/PARK-ATP1A3 et de trouver des interventions thérapeutiques potentielles, il a été essayé à de nombreuses reprises d’imiter le développement de la maladie dépendante du stress dans les modèles de rongeurs. Cependant, mis à part le modèle génétique existant de souris DYT/PARK-ATP1A3, où les mouvements anormaux et convulsifs transitoires ont été induits par l’hypothermie, tous les modèles de souris génétiques publiés pour DYT/PARK-ATP1A3 n’ont pas produit de symptômes dystoniques1,11,12. Calderon et coll. ont déjà démontré que le blocage bilatéral de l’α3-subunit dans les ganglions basaux et le cervelet par l’intermédiaire de l’ouabain cardiaque glycoside chez les souris de type sauvage entraîne une légère perturbation de la démarche13. L’exposition supplémentaire aux chocs électriques de pied dans un environnement chaud a mené à un phénotype dystonique et bradykinetic, démontrant ainsi que la perfusion chronique et ciblée de l’ouabain suivie du stress imite avec succès le phénotype DYT/PARK-ATP1A3.
Cependant, exposer les animaux à des chocs électriques du pied dans un environnement chaud de 38-40 °C sur une période de deux heures induit la douleur et l’anxiété chez les animaux, qui représentent des facteurs de confusion, en particulier pour l’évaluation des changements dans le système de catécholamine liés au développement de la dystonie. Ainsi, nous décrivons ici un autre type de paradigme de stress avec une valeur translationnelle élevée, qui se rapporte au fait que l’exercice doux à modéré ont été décrits comme déclencheurs chez les patients de DYT/PARK-ATP1A39. En outre, l’exercice répétitif est un déclencheur bien connu pour la dystonie focale14. Les souris ont été soumises à plusieurs reprises à des tâches motrices difficiles composées de trois descentes d’un poteau en bois (« essage de la tô ») et de trois pistes sur un appareil Rotarod (« essage de performance rota »). Le placement des animaux sur le dessus d’un poteau en bois de 50 cm a été utilisé pour contraindre les animaux à descendre, l’appareil Rotarod a été utilisé pour soumettre les souris à l’activité forcée en les plaçant sur une tige tournante.
La caractérisation du phénotype moteur d’un modèle de souris pour la dystonie est particulièrement difficile en raison de l’absence de tests et de scores prédéfinints. Cependant, une variante d’une évaluation de l’incapacité motrice a été utilisée à plusieurs reprises au cours des dernières années afin d’évaluer la gravité et la distribution des mouvements semblables à la dystonie chez les rongeurs13,15,16. Nous présentons ici une version modifiée de l’échelle d’évaluation de la dystonie, qui s’est avérée efficace dans l’évaluation du phénotype dystonia-like des animaux une fois observé sur une période de temps de quatre minutes. Comme deuxième méthode d’évaluation des mouvements dystonia-like, nous présentons un système de notation nouvellement développé pour l’évaluation des mouvements anormaux pendant un essai de suspension de queue. Il permet d’évaluer la fréquence et la durée des mouvements et des postures semblables à la dystonie des membres avant, des pattes postérieures ainsi que du tronc.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% saline</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>PZN06178437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet osmotic pumps</td>
			<td>Durect</td>
			<td>4317</td>
			<td>model 1002, &#64258;owrate 0.25 &#956;L/h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anchor Screws</td>
			<td>AgnTho&#39;s</td>
			<td>MCS1x2</td>
			<td>2 mm long with a thread of 1mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulldog Clamps</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>13-320-035</td>
			<td>straight, 3.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacain 0.25% Jenapharm</td>
			<td>mibe GmbH Arzneimittel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula and Minipump Holder</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51636</td>
			<td>designed to hold 3.4 mm cannula heads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Bifurcation</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>21Y</td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula tubing</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>C312VT/PKG</td>
			<td>vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>fine forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye cream Bepanthen</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56109M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1070-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td>prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane System Dr&#228;ger Vapor 19.3</td>
			<td>Dr. Wilfried M&#252;ller GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kallocryl A/C</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>1615</td>
			<td>dental cement, liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kallocryl CPGM rot</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>1692</td>
			<td>dental cement, red powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonates adaptor</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>51625</td>
			<td>adaptor for mice for a traditional U-frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle holder</td>
			<td>KLS Martin Group</td>
			<td>20-526-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>51649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octenisept</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td>118211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>3280PD-3.0/SPC</td>
			<td>28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>3280PM/SPC</td>
			<td>28, Gauge, custom length 3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ouabain octahydrate 250 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03125-250MG</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Kern &#38; Sohn</td>
			<td>PFB 6000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal Thermal Probe</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl 50 mg/mL, injectable</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Carprofen, prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53800M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotaRod Advanced</td>
			<td>TSE Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw driver set</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>30090-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Burrs</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>HM71009</td>
			<td>0.9 mm &#216; burr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Burrs</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>HM71014</td>
			<td>1.4 mm &#216; burr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoDrive</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic instrument</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td></td>
			<td>custom made by Neurostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic robot</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture: coated vicryl, polyglatin 910</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V797D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for dyt/park-atp1a3 dystonia

Les modèles de souris génétiquement modifiés font face à des limitations, en particulier lors de l’étude des troubles du mouvement, où la plupart des modèles de rongeurs transgéniques disponibles ne présentent pas un phénotype moteur ressemblant aux aspects cliniques de la maladie humaine. Les modèles pharmacologiques de souris permettent une étude plus directe des pathomechanisms et de leur effet sur le phénotype comportemental. Les pompes osmotiques reliées aux canules cérébrales ouvrent la possibilité de créer des modèles pharmacologiques de souris par l’intermédiaire de la livraison locale et chronique de médicaments. Pour le trouble du mouvement héréditaire du dystonia-parkinsonisme à début rapide, la mutation de perte de fonction dans la sous-unité α3 de la Na+/K+-ATPase peut être simulée par un blocus très spécifique via l’ouabain glycoside. Afin de bloquer localement la sous-unité α3 dans les ganglions basaux et le cervelet, qui sont les deux structures cérébrales censées être fortement impliquées dans la pathogénie du dystonie-parkinsonisme à début rapide, une canule bilatérale est stéréotaxiquement implantée dans le striatum et une canule unique supplémentaire est introduite dans le cervelet. Les canules sont reliées par des tubes en vinyle à deux pompes osmotiques, qui sont implantées sous-cutanéement sur le dos des animaux et permettent la livraison chronique et précise de l’ouabain. Le modèle pharmacologique de souris pour le dystonia-parkinsonism de rapide-début porte l’avantage additionnel de récapituler les dispositifs cliniques et pathologiques des porteurs asymptomatiques et symptomatiques de mutation. Tout comme les porteurs de mutation du parkinsonisme de dystonie rapide-début, les souris ouabain-perfused développent des mouvements dystonia-comme seulement après exposition supplémentaire au stress. Nous démontrons un paradigme de stress doux et introduisons deux systèmes de notation modifiés pour l’évaluation d’un phénotype moteur.

La figure 4 a été modifiée à partir de Rauschenberger et coll.17. Pour l’analyse des données de l’échelle d’évaluation de la dystonie (A) et du test de suspension de la queue (B), calculer le score total pour chaque point de temps pour chaque animal. La moyenne de chaque point de temps et de chaque groupe doit être tracée sur un graphique approprié. La répartition des valeurs devrait être étudiée et le test statistique approprié devrait être appliqué pour déterminer l’importance. Avec un nombre suffisant d’animaux, un phénotype moteur peut être détecté à la fois avec l’échelle d’évaluation de la dystonie ainsi qu’avec l’évaluation des mouvements anormaux dans le test de suspension de queue. Le phénotype dystonia-like est démontré par le score moteur sensiblement plus élevé dans les deux évaluations dans le groupe ouabain-perfusé, stressé comparé aux souris ouabain-perfused, non-stressées aussi bien que les souris témoins.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg"> Figure 1 : Les principales étapes chirurgicales pour l’implantation de la canule et de la pompe osmotique. (A) Pour les coordonnées indiquées, des trous doivent être forés bilatéralement pour la double canule désignée pour les ganglions basaux et pour la canule unique placée à la ligne médiane du cervelet. Les deux pompes osmotiques entièrement construites sont présentées de chaque côté de l’animal. (B) L’image montre une canule unique implantée dans le cervelet, fixé avec du ciment dentaire. La double canule pour les ganglions basaux doit être reliée à l’adaptateur de bifurcation et préremplies avec de l’ouabain avant l’implantation. (C) Image de la procédure terminée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg"> Figure 2 : Évaluation des mouvements de dystonie-comme avec une échelle d’évaluation de dystonie. Au cours d’une vidéo de 4 minutes, des mouvements semblables à la dystonie ont été marqués en fonction de la distribution du corps et de la durée. L’hyperextension involontaire des membres avant, une position large ou hyperextension des hindlimbs aussi bien que le cyphose ont été évalués comme dystonia-comme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg"> Figure 3 : Évaluation des mouvements semblables à la dystonie lors d’un test de suspension de la queue. Le système de notation nouvellement développé pour les mouvements anormaux pendant un essai de suspension de queue de 2 minutes évalue les mouvements dystonia-comme dans les membres avant, les pattes postérieures et le tronc de 0-8 points au total. Pour les membres avant, une hyperextension et la croisement des membres avant ainsi qu’une flexion tonique vers le tronc qualifiée de dystonie-like. Pour les hindlimbs l’hyperextension involontaire ainsi que la rétraction avec l’extension au-dessus de la ligne médiane a été marqué comme dystonia-like. Une distorsion truncale sur 80% du temps enregistré a été marqué avec un point. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg"> Figure 4 : Graphiques représentatifs de l’échelle d’évaluation de la dystonie et du test de suspension de la queue. (A) Le graphique représente l’échelle de classification de la dystonie pour les souris stressées et perfusées par NaCl (ligne noire pointillée), les souris non stressées ouabain-perfusées (ligne orange pointillée) et les souris ouabain-perfusées et stressées (ligne bleue foncée). Pour chaque point de temps, les valeurs moyennes ± erreur standard de la moyenne (SEM) sont affichées. (B) Le diagramme montre l’évaluation des mouvements anormaux au cours d’un test de suspension de queue de 2 min pour les souris stressées et perfuées par NaCl (ligne noire pointillée), les souris non stressées ouabain (ligne orange pointillée) et les souris stressées ouabain (ligne bleue foncée). L’analyse statistique a été faite pour l’échelle d’évaluation de la dystonie et la notation de l’essai de suspension de queue à l’aide du test Mann-Whitney à deux queues. La correction de Bonferroni-Holm (§) des valeurs p a montré une différence significative pour la période d’observation de 72 h. Bleu foncé * dénote des différences significatives entre les souris ouabain-perfusées, stressées et les souris ouabain-perfusées et non stressées, noires * dénotent des différences significatives entre les souris perfusées et les souris stressées ouabain ainsi qu’entre les souris non stressées et les souris non stressées et perfusées de NaCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia at JoVE.com

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Nous fournissons un protocole pour générer un modèle pharmacologique de souris de dystonie de DYT/PARK-ATP1A3 par l’implantation de canules dans les ganglions basaux et le cervelet reliés aux pompes osmotiques. Nous décrivons l’induction des mouvements dystonia-like par l’application d’un défi moteur et la caractérisation du phénotype par l’intermédiaire des systèmes de notation comportementale.

Implantation de pompes osmotiques et induction du stress pour établir un modèle de souris pharmacologique symptomatique pour la dystonie DYT/PARK-ATP1A3

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

L’objectif global de ce protocole est de décrire les procédures impliquées dans l’établissement d’un modèle symptomatique et pharmacologique de souris pour la dystonie DYT/PARK-ATP1A3 en utilisant des canules cérébrales dans des pompes osmotiques et en induisant le stress par des tâches motrices difficiles. Cette méthode détaille comment établir un modèle pharmacologique de souris utilisant la livraison chronique de drogue par l’intermédiaire des pompes osmotic aux canules multiples de cerveau et comment induire le phénotype par des tâches motrices provocantes. Le paradigme du stress moteur léger donne également un aperçu du rôle des interactions gène-environnement dans les troubles du mouvement, et peut être appliqué à d’autres modèles de rongeurs.Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément aux lignes directrices nationales et institutionnelles applicables en matière de soins et d’utilisation des animaux. Commencez par préparer les pompes osmotiques dans un environnement stérile. Tout d’abord, remplissez une seringue d’un millilitre d’une canule de remplissage de calibre 27 avec une solution ouabain filtrée stérile ou une solution de véhicule.Maintenez la pompe osmotique en position verticale, insérez la canule jusqu’à la pompe et remplissez lentement le réservoir jusqu’à ce qu’une solution excédentaire apparaisse sur le dessus. Ensuite, insérez le modérateur de flux dans la pompe. Enlever soigneusement la bride blanche du modérateur de flux avec des ciseaux et connecter un morceau de tube de vinyle au modérateur de flux.Submergez chaque pompe dans des tubes Eppendorf remplis à mi-chemin de solution saline et mettez-les dans un thermocycler de 37 degrés afin de s’assurer que le taux de pompage atteint un état stable avant de commencer la chirurgie. Une fois que l’animal est profondément anesthésié selon les protocoles approuvés, placez l’animal dans un cadre stéréotaxique et fixez la tête à l’aide de pointes en caoutchouc ou de barres d’oreille non rompues. Après une désinfection complète de la zone chirurgicale, utiliser un scalpel pour placer l’incision au sommet de la tête et utiliser des ciseaux pour continuer l’incision jusqu’aux membres avant.Exposez le crâne à l’aide de pinces à bouledogue et essuyez le périoste à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton. Alignez soit un stylo ou la pointe d’un cannular taché d’encre noire avec du bregma et utilisez les coordonnées appropriées pour marquer les trois points d’entrée pour les canules cérébrales sur le crâne. Ensuite, percez soigneusement les trous pour le double cannular désigné pour les ganglions basiques et la canule unique désignée pour le cervelet.Percer un quatrième trou pour une petite vis entre le striatum et le cervelet. Cette vis sera éventuellement intégrée dans le ciment dentaire et fournira une prise supplémentaire pour les cannulas. Afin de créer une petite poche pour la pompe osmotique de chaque côté des animaux en arrière, utilisez des forceps tissulaires pour séparer les couches de tissu sous-cutanées.Avancez les forceps vers une jambe arrière et ouvrez légèrement les forceps afin d’élargir la poche sous-cutanée. Répétez la même procédure de l’autre côté, en enlevant d’abord les forceps de l’incision, puis en les poussant doucement vers la deuxième jambe arrière. À l’aide de forceps, insérez soigneusement les pompes et le cathéter connecté dans chaque poche sous-cutanée.La poche doit permettre à la pompe de glisser facilement. À l’aide d’un mini support de pompe, introduire une seule canule osmotique d’une longueur personnalisée de 3,0 millimètres dans le trou foré dans la ligne médiane du cervelet. Détachez soigneusement la tête de canule et fixez la canule ainsi que la petite vis avec du ciment dentaire, en prenant soin de ne pas couvrir la pièce de raccordement pour le tube de la pompe osmotique.Assurez-vous que le ciment dentaire entourant la canule a complètement séché avant de poursuivre la chirurgie. Avant d’insérer la double canule dans les trous forés bilatéralement au-dessus des ganglions basiques, attachez deux morceaux de tube de vinyle de 0,5 centimètre de long aux deux pièces de raccordement de la double canule. Connectez les tubes en vinyle avec un adaptateur de bifurcation et remplissez soigneusement l’ensemble du système de tubes avec une solution ou un véhicule stérile ou un véhicule.Ensuite, répétez les mêmes étapes que précédemment pour la canule unique et terminez en fixant la double canule avec du ciment dentaire. Connectez les cathéters des pompes osmotiques à l’adaptateur de bifurcation ainsi qu’à une seule canule respectivement. Les deux pompes ont un débit égal alors faites attention à connecter la pompe osmotique avec une double solution concentrée à l’adaptateur de bifurcation pour s’assurer que la même concentration atteint à la fois les ganglions basiques et le cervelet.Fermer l’incision sur le dos des animaux avec des points de suture dans la mesure du possible sans trop serrer la peau. Injecter subcutanément de la solution saline stérile, qui devrait avoir une température corporelle pour éviter la déshydratation. Retirez l’animal du cadre stéréotaxique et placez-le dans une cage de récupération.Afin d’induire des mouvements dystoniques, les souris ouabain-perfusées devraient être exposées à des tâches motrices difficiles comme paradigme de stress doux quatre heures après la chirurgie et de façon répétitive toutes les 24 heures après. Cela n’inclut pas une caractérisation comportementale des animaux. Nous démontrons ici l’exemple d’un animal perfusé par véhicule, qui est placé sur un poteau en bois rugueux de surface de 50 centimètres, nez orienté vers le bas.Fournir suffisamment de literie à la base du poteau en cas de chute. Pour les souris perfusées d’ouabain, les animaux devraient commencer à présenter les premiers symptômes comme la bradykinésie quatre heures après la chirurgie. Cependant, 24 heures après la chirurgie, vous devriez voir l’hyperextension involontaire des membres avant ou postérieur comme signe des mouvements dystonia-comme pendant la descente.Les souris doivent descendre le pôle trois fois, permettre au moins deux minutes de récupération entre chaque descente. Le temps de descente n’a pas besoin d’être mesuré. Le test du poteau doit être suivi d’une deuxième tâche motrice, à l’aide d’une tige rotative.Comme pour le test de performance Rotarod, les souris ouabain et perfusées par véhicule des groupes de stress sont placées sur la tige rotative. La latence à la baisse n’a pas besoin d’être mesurée. Comme pour le test précédent, les souris doivent être placées sur la tige rotative trois fois, ce qui permet deux minutes de récupération entre les courses.L’échelle modifiée de notation de dystonie peut être employée pour évaluer la fréquence, la sévérité, et la distribution de corps des mouvements dystonia-comme des souris. Les animaux doivent être placés dans une boîte en plastique ou en bois et les mouvements doivent être enregistrés pendant une période de quatre minutes. Les tauxeurs doivent être aveuglés par l’affectation de groupe.Les mouvements ou les postures qui sont considérés comme dystonie-like sont l’hyperextension involontaire des membres avant, une position large, ou hyperextension des membres postérieurs, aussi bien que la cyphose. Si une seule partie du corps est affectée, la dystonie doit être considérée comme focale. Si le tronc et au moins deux autres parties du corps sont affectés, la dystonie doit être considérée comme généralisée.Un deuxième système de notation nouvellement développé de zéro à huit points, évalue la présence et la sévérité des mouvements dystonia-comme pendant un essai de suspension de queue. Pour le test, maintenez la souris près de sa base pendant deux minutes. Il est recommandé d’enregistrer le test de suspension de la queue et d’attribuer une note à l’analyse ultérieure de la séquence.Les membres avant sont marqués de zéro à quatre points. Les rétractions toniques répétées ou soutenues de l’un des deux membres avant, aussi bien que l’hyperextension combinée avec le croisement des membres avant sont marqués comme dystonie-comme. Les mouvements dystoniques des membres postérieurs, c’est-à-dire la rétractation et le serrement, ainsi que l’hyperextension soutenue, sont marqués de zéro à trois points.Une distorsion matraque présente plus de 80% du temps enregistré est notée avec un point supplémentaire. Le serrant de membre postérieur est signe non spécifique pour l’affaiblissement moteur et ne devrait pas être noté. Ce graphique montre les résultats de l’échelle d’évaluation de la dystonie.Les souris stressées imprégnées d’ouabain présentent beaucoup plus de mouvements dystonia-like sur une période d’observation de 72 heures que le groupe ouabain-perfusé non-stress, aussi bien que les animaux de véhicule. Cette image représente les résultats du test de suspension de la queue et montre un résultat similaire à l’échelle d’évaluation de la dystonie. Notez que les résultats de la moyenne à partir du score total de chaque animal pour chaque point de temps.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’implanter stéréotaxiquement canules cérébrales multiples et comment implanter sous-cutanée pompes osmotiques. Le principal avantage de cette méthode est que les injections répétitives et stressantes peuvent être évitées et qu’un substrat comme l’ouabain, qui autrement aurait des effets secondaires à l’échelle du système peut être directement livré à une structure cérébrale spécifique.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Recherche

Neurosciences

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