Name: implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for dyt/park-atp1a3 dystonia
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale dell'istruzione e della ricerca (BMBF DysTract to C.W.I.) e dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (I-KF) presso l'Università di Wàrzburg (da 2 a L.R.). Gli autori ringraziano Louisa Frie, Keali Rahm, Veronika Senger e Heike Menzel e per l'assistenza tecnica, nonché Helga Brànner per la cura degli animali.

Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con le linee guida internazionali, nazionali e/o istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. Le autorità locali del Regierung von Unterfranken, in Germania, hanno approvato tutti gli esperimenti sugli animali.
1. Priming di pompe osmotiche
NOTA: Questo passaggio deve essere eseguito almeno 48 h prima dell'intervento chirurgico. Le pompe osmotiche AL-ET devono essere precompilate per garantire che il tasso di pompaggio raggiunga uno stato costante prima dell'impianto.
<ol><li>Preparare in anticipo la soluzione desiderata per la perfusione cronica. Assicurarsi che il solvente e l'agente siano compatibili con le pompe osmotiche e i cateteri. Per il progetto qui in questo caso, scongelare una soluzione di stoccaggio 10x di ouabaina (immagazzinata a -20 gradi centigradi) a temperatura ambiente e vortice per 10 s. CAUTION: Ouabain è tossico: deve essere maneggiato solo con guanti e aperto solo sotto un cappuccio sterile per evitare l'inalazione.</li>
	<li>Accendere il cappuccio sterile; disinfettare il cappuccio e tutti gli strumenti e il materiale necessari prima di metterli sotto il cofano.</li>
	<li>Indossare guanti chirurgici prima di maneggiare le pompe osmotiche. Preparare separatamente la soluzione ouabain designata per le pompe dello striato e del cervelletto. NOTA: Si consideri che la concentrazione della soluzione nella pompa per lo striato deve essere raddoppiata rispetto alla concentrazione della soluzione nella pompa designata per il cervelletto. Ciò è dovuto al fatto che la pompa per lo striato è collegata a una doppia cannula, la velocità di flusso, tuttavia, è la stessa della pompa del cervelletto, che è collegata a una singola cannula.</li>
	<li>Calcolare la quantità di soluzione necessaria utilizzando la seguente formula: velocità di consegna di massa (ko) - velocità di consegna del volume (Q) x concentrazione dell'agente nel veicolo (Cd) Per il presente progetto, le pompe osmotiche sono state innescate e riempite con soluzione di ouabaina ad una concentrazione di 11,2 ng/h o 0,9% salina per il gruppo di controllo.</li>
	<li>Vortex entrambe le soluzioni ouabain per 10 s e filtro sterile (cioè, 0,22 m filtro di siringa-end) in tubi separati, nuovi microcentrifuge, utilizzando un filtro diverso per ogni soluzione.</li>
	<li>Pesare le pompe osmotiche vuote insieme al moderatore di flusso (circa 0,4 g).</li>
	<li>Riempire una siringa da 1 mL con una cannula di riempimento da 27 G (preferibilmente con una punta smussata) con soluzione di ouabain filtrata sterile o soluzione per il veicolo.</li>
	<li>Ottenere tutte le bolle d'aria dalla siringa, tenere la pompa osmotica in posizione verticale, inserire la cannula tutta la strada nella pompa e riempire lentamente il serbatoio fino a quando la soluzione in eccesso appare in cima (evitare il riempimento rapido in quanto questo può portare a bolle d'aria nella pompa). Successivamente, inserire il moderatore del flusso nella pompa (la soluzione in eccesso dovrebbe apparire in cima).</li>
	<li>Estrarre il moderatore di flusso (circa 5 mm), togliere con cura la flangia bianca con le forbici e collegare un pezzo di tubo in vinile al moderatore del flusso. Assicurarsi che il catetere abbia una lunghezza di circa 2 cm per consentire una corretta mobilità dell'animale.</li>
	<li>Pesare ancora una volta la pompa osmotica riempita per garantire che la differenza di peso tra pompa riempita e vuota sia concordante con il peso previsto della soluzione caricata. NOTA: Per la maggior parte delle soluzioni aqueose questo peso è uguale al volume nei microlitri. Se il peso non corrisponde al volume previsto, l'aria potrebbe essere intrappolata all'interno della pompa, che deve essere svuotata e ricaricata.</li>
	<li>Per l'innesco delle pompe, preparare due tubi microcentrifuge da 2 mL, un tubo per lo striato e uno per il cervelletto.</li>
	<li>Immergere le pompe nei tubi microcentrifuge riempiti a metà con una soluzione salina dello 0,9%. Non immergere l'estremità aperta del catetere. Mettere i tubi del microcentrifuge in un termociclo per 48 h a 37 gradi centigradi per garantire che la pompa abbia raggiunto un tasso di pompaggio costante prima dell'impianto e che i cateteri siano precompilati.</li>
</ol>2. Impianto di cannula e pompa osmotica
<ol><li>Posizionare il topo (maschio, C57Bl/6N, 11-12 settimane di età) in una camera progettata per l'anestesia per inalazione; impostare la velocità di flusso dell'isoflurane al 2-3% e la velocità di flusso dell'ossigeno a 2 L/min.</li>
	<li>Dopo che il topo è profondamente anetietizzato secondo i protocolli approvati, radersi la parte superiore della testa dell'animale, il collo dorsale e il terzo prossimale della schiena.</li>
	<li>Posizionare l'animale in un telaio stereotattico e continuare l'anestesia con isoflurane tramite una maschera di anestesia del topo progettata per lo strumento stereotattico (frequenza di flusso isoflurana 1,5-2%, 2 L/min ossigeno).</li>
	<li>Utilizzando punte di gomma o barre dell'orecchio non di rottura, fissare la testa dell'animale nel telaio stereotattico, facendo attenzione che la testa sia livellata.</li>
	<li>Al fine di prevenire l'ipotermia, posizionare un tampone di riscaldamento sotto l'animale, inserire una sonda di temperatura rettale e impostare la temperatura a 37 gradi centigradi. Proteggere gli occhi dell'animale dall'essiccazione utilizzando una goccia di unguento oftalmico su ogni occhio.</li>
	<li>Applicare un analgesico, come Carprofen (5 mg/kg di peso corporeo), sottocutaneamente prima di iniziare l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Con una siringa iniettare sottocutaneamente fino a 0,2 mL di bupivacaina 0,25% e attendere 30 s per l'anestesia locale per avere effetto.</li>
	<li>Disinfettare accuratamente le aree rasate con un antisettico, come il diidroloruro di ottenidina.</li>
	<li>Dopo una disinfezione approfondita dell'area chirurgica, utilizzare un bisturi per posizionare un'incisione nella parte superiore della testa e utilizzare le forbici per continuare l'incisione fino agli arti anteriori. Esporre il cranio con l'aiuto di morsetti bulldog e pulire il periosteum con un applicatore sterile con punta di cotone.</li>
	<li>Allineare una penna o la punta di una cannula macchiata di inchiostro nero con bregma e utilizzare le coordinate appropriate per contrassegnare i tre punti di ingresso per le cannulas cerebrali sul cranio (coordinate per i fori bilaterali necessari per la perfusione dei gangli basali: anteriore/posteriore: 0,74 mm, mediale/laterale: 1,50 mm (ovvero il lato destro, - il lato sinistro rispetto al bregma); coordinate per il foro nella linea mediana del cervelletto: anteriore/posteriore: - 6,90 mm). Successivamente, praticare con cura i fori per la doppia cannula designata per i gangli basali e la singola cannula designata per il cervelletto (Figura 1A).</li>
	<li>Forare un quarto foro per una piccola vite tra lo striato e il cervelletto. Questa vite sarà infine incorporato nel cemento dentale e fornire una presa aggiuntiva per le cannulas. Utilizzando le forcette sottili e un driver a vite, introdurre con attenzione la vite nel piccolo foro fino a quando non è saldamente fissato nel cranio. Non impiantare la vite troppo profondamente in quanto questo danneggia il tessuto cerebrale. NOTA: Si consiglia di continuare con l'impianto della pompa osmotica prima di inserire le cannulas osmotiche. In questo modo si evita di causare danni accidentali alle cannulas durante l'impianto delle pompe.</li>
	<li>Al fine di creare una piccola tasca per la pompa osmotica su ogni lato degli animali indietro, utilizzare le forcelle tissutale per separare gli strati di tessuto sottocutaneo. Far avanzare le pinte verso una gamba posteriore e aprire leggermente le pinte per allargare la tasca sottocutanea. Ripetere la stessa procedura per l'altro lato, prima rimuovendo le pinte dall'incisione e poi spingendole delicatamente verso la seconda gamba posteriore. NOTA: La tasca dovrebbe consentire alla pompa di scivolare facilmente, tuttavia, non dovrebbe avere troppo spazio per muoversi sotto la pelle.</li>
	<li>Con l'aiuto di taglie tisss tissante prendere la prima pompa insieme con il pezzo collegato di tubi e farlo scorrere in una tasca sottocutanea. Ripetere la stessa procedura con la seconda pompa.</li>
	<li>Utilizzando un supporto minipump, introdurre una singola cannula osmotica con una lunghezza personalizzata di 3,0 mm nel foro forato nella linea mediana del cervelletto. Staccare la testa di cannula con attenzione e fissare la cannula così come la piccola vite con cemento dentale, facendo attenzione a non coprire il pezzo di collegamento per il tubo della pompa osmotica. Assicurarsi che il cemento dentale che circonda la cannula si sia completamente asciugato prima di continuare con l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Prima di inserire una doppia cannula con una distanza da centro a centro di 3,0 mm e una lunghezza su strada di 4,0 mm nei fori bilaterali sopra i gangli basali, fissare due brevi pezzi di tubi in vinile (0,5 cm) ai due pezzi di collegamento della doppia cannula. Collegare i tubi in vinile con un adattatore di biforcazione e precompilare con cura l'intero sistema di tubi, compreso l'adattatore e la cannula con soluzione di ouabain o veicolo (temperatura ambiente, sterile filtrata in anticipo). Questo può essere fatto meglio con una siringa da 1 mL e una cannula di riempimento da 27 G introdotta nella singola estremità posteriore dell'adattatore di biforcazione (Figura 1B).</li>
	<li>Utilizzando un supporto minipump, inserire con attenzione la doppia cannula nei fori bilaterali. Utilizzare un morsetto per staccare la testa di cannula e fissare la doppia cannula con cemento dentale.</li>
	<li>Collegare i cateteri delle pompe osmotiche rispettivamente all'adattatore di biforcazione e alla singola cannula. Assicurarsi che i cateteri abbiano una forte presa sui pezzi di collegamento delle cannulas. NOTA: Entrambe le pompe hanno una velocità di flusso uguale, quindi fate attenzione a collegare la pompa osmotica con la soluzione doppia concentrata all'adattatore di biforcazione per garantire che la stessa concentrazione raggiunga sia i gangli basali che il cervelletto.</li>
	<li>Chiudere l'incisione sul retro degli animali con punti il più possibile in direzione del cranio, facendo attenzione a non esorsi troppo la pelle (Figura 1C).</li>
	<li>Iniettare sottocutaneamente 0,5 mL dello 0,9% salina, che dovrebbe avere la temperatura corporea, in una piega cutanea su ciascun lato della parte posteriore degli animali al fine di evitare la disidratazione dei topi, evitando con attenzione le pompe.</li>
</ol>3. Sfida motoria
<ol><li>Sottoponere i topi confuso di ouabain o veicolo a compiti motori impegnativi come forma di lieve esposizione allo stress 4 h dopo la chirurgia e ripetutamente ogni 24 h in seguito al fine di indurre movimenti simili alla distonia. Questo non include una caratterizzazione comportamentale; il suo scopo è quello di indurre un livello di stress più elevato rispetto al normale mantenimento della gabbia.</li>
	<li>Posizionare il mouse su un palo di legno ruvido di 50 cm con un diametro di 1 cm, rivolto verso il basso. Assicurarsi che il palo sia posto in una grande gabbia con abbastanza biancheria da letto in caso di cadute. Non è necessario misurare il tempo di discesa, ma guardare fuori per iperestensioni involontarie di arti anteriori e arti posteriori presentati da animali perfuso ouabain durante la discesa del palo. Lasciare che i topi sscendono il palo tre volte e permettano 2 minuti di recupero tra le dita. NOTA: I topi perfuso di Ouabain dovrebbero presentare i primi sintomi come la bradykinesia 4 h dopo l'intervento chirurgico. Tuttavia, 24 h dopo l'intervento chirurgico i topi dovrebbero iniziare a presentare iperestensioni involontarie degli arti anteriori e degli arti posteriori come segno di movimenti simili alla distonia durante la discesa.</li>
	<li>Per il secondo compito del motore, posizionare i topi sull'asta rotante come fatto per il test delle prestazioni Rotarod. L'apparato Rotarod non viene utilizzato come misura della latenza di caduta, l'obiettivo è quello di sottopone i topi ad attività forzata. Posizionare i topi sull'asta rotante tre volte e lasciare 2 minuti di recupero tra le prove. NOTA: per aumentare l'esposizione allo stress, utilizzare un apparato Rotarod in accelerazione. Per il progetto qui descritto, l'asta accelera da 5 a 50 giri/min in un determinato periodo di tempo di 300 sec.</li>
	<li>Lasciate che gli animali si riprendano per 30 minuti tra la prova del palo e il test delle prestazioni Rotarod e di nuovo altri 30 minuti prima di segnare per movimenti simili alla distonia, come descritto nel punto 4 del protocollo. Tra le esposizioni ripetitive di stress, consentire ai topi di recuperare per 24 h-intervalli.</li>
</ol>4. Sistemi di punteggio per la valutazione dei movimenti simili alla distonia
NOTA: lo sperimentatore deve essere accecato all'assegnazione del gruppo analizzata per evitare distorsioni. I test comportamentali utilizzati per caratterizzare il fenotipo dei topi sono due sistemi di punteggio: una scala di distonia che segna un punteggio anormale, movimenti simili alla distonia e un punteggio comportamentale utilizzando il test di sospensione della coda. Valutare i movimenti simili alla distonia dopo un tempo di recupero di 30 minuti dopo l'esposizione a uno stress lieve.
<ol><li>Scala di valutazione della distonia NOTA: a causa della mancanza di compiti comportamentali predefiniti, la scala di valutazione della distonia è stata stabilita come un sistema di punteggio basato su osservatori simile alle scale di valutazione clinica della distonia umana. Si tratta di una versione modificata della scala di classificazione della distonia utilizzata da Calderon et al.13.<ol>
<li>Registrare la postura e l'andatura degli animali per un periodo di 4 minuti dopo che gli animali sono stati collocati in una scatola di plastica o di legno.</li>
		<li>Punteggio per frequenza e distribuzione di movimenti simili alla distonia da 0 a 4 punti: (0) normale comportamento motorio; (1) comportamento motorio anormale, nessun movimento simile alla distonia; (2) lieve compromissione motoria con lievi movimenti focali simili a distonia; (3) compromissione motoria moderata con gravi movimenti focali simili alla distonia; (4) grave compromissione, con movimenti distonia sostenuti e generalizzati(Figura 2). Considerare i seguenti movimenti o posture come distonia-like: iperestensione degli arti anteriori, ampia posizione o iperestensione di arti posteriori così come cifosi. Considerare la distonia come focale nel caso in cui una singola parte del corpo sia interessata e come generalizzata nel caso in cui il tronco e almeno altre due parti del corpo siano interessate.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test di sospensione della coda NOTA: Il test di sospensione della coda viene spesso utilizzato per osservare e segnare per il chiusura di hindlimb. Si tratta tuttavia di un fenotipo altamente non specifico che indica una compromissione del motore. Il seguente protocollo propone un sistema di punteggio specifico per i movimenti simili alla distonia. A causa della generalizzazione della distonia nei pazienti DYT/PARK-ATP1A3, i movimenti simili alla distonia dovrebbero essere valutati negli arti anteriori, nel tronco e negli arti posteriori. È stato sviluppato un sistema di punteggio di nuova consegne da 0 a 8 punti, un punteggio totale < 2 indicava che non erano presenti movimenti simili alla distonia (Figura 3).<ol>
<li>Raccogliere il topo per la coda vicino alla sua base e sollevare l'animale. Registrare un video di 2 minuti del test di sospensione della coda e assegnare un punteggio in una successiva, analisi approfondita della registrazione.</li>
		<li>Segnare gli arti anteriori da 0 a 4 punti, dove le ritrazioni toniche ripetute o sostenute di uno o entrambi gli arti anteriori, nonché un'iperestensione combinata con l'attraversamento degli arti anteriori, sono stati classificati come distonia: (0) nessun movimento anormale; (1) ridotto il movimento degli arti anteriori con iperestensione delle zampe osservate - il 50% del tempo registrato; (2) movimenti lievi simili alla distonia degli arti anteriori < 50% del tempo registrato; (3) movimenti lievi simili alla distonia degli arti anteriori: il 50% del tempo registrato o il 50% del tempo registrato; (4) gravi movimenti simili alla distonia degli arti anteriori, pari al 50% del tempo registrato. NOTA: La chiusura di Hindlimb è un movimento anormale che non deve essere segnato come distonia.NOT: Hindlimb clasping is an abnormal movement that not should not be scored as dystonia-like.</li>
		<li>Segnare gli arti posteriori da 0 a 3 punti, dove la retrazione e la chiusura degli arti posteriori e l'iperestensione sostenuta sono state valutate come distonia: (0) nessun movimento anomalo; (1) riduzione del movimento degli arti posteriori con iperestensione delle zampe osservate : 50% del tempo registrato; (2) movimenti simili alla distonia di un posteriore; (3) movimenti simili alla distonia di entrambi gli arti posteriori.</li>
		<li>In caso di distorsione del troncamento > 80% del tempo registrato, viene aggiunto un punto aggiuntivo al punteggio.</li>
		<li>Ri-mettere l'animale nella sua gabbia.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Atp1a3+mutant+mice+as+a+model+of+rapid-onset+dystonia+with+parkinsonism.">Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism.</a> Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).</li><li>Dang, M. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo modello di topo farmacologico DYT/PARK-ATP1A3 consente l'analisi dettagliata dei cambiamenti strutturali e neurochimici intracerebrali indotti esclusivamente dall'inibizione della pompa di ioni di sodio-potassio nei gangli basali e nel cervelletto, nonché da alterazioni legate all'esposizione allo stress. Nel caso di topi, un massimo di due pompe osmotiche possono essere impiantate sottocutaneamente. Qui presentiamo un metodo che descrive la consegna di farmaci cronici a più strutture cerebrali implementando una doppia cannula collegata a un adattatore di biforcazione oltre a una singola cannula. Questa metodologia può essere utilizzata per qualsiasi applicazione che richiede più strutture cerebrali da perfuso contemporaneamente e cronicamente.
Vi presentiamo un modello murino di un disturbo del movimento raro, in cui i pazienti sviluppano sintomi permanenti dopo l'esposizione allo stress. Questa presunta interazione gene-ambientale non è ancora ben compresa, ma potrebbe rappresentare uno dei patomenismi chiave nello sviluppo di DYT/PARK-ATP1A3. Diversi metodi di esposizione dei topi allo stress sono stati pubblicati in passato e includono scosse elettriche del piede, contenimento, ambiente freddo o caldo e l'esposizione a vari odori11,12,13. Nel tentativo di esporre i topi a un lieve fattore di stress con valore trasmiato, qui descriviamo la sottrazione ripetitiva dei topi a compiti motori impegnativi. Per la prova del polo, gli animali perfuso di ouabain hanno rivelato un'iperestensione involontaria degli arti anteriori e degli arti posteriori. Questi movimenti erano molto simili ai movimenti simili alla distonia osservati durante la registrazione video di 4 minuti degli animali e al test di sospensione della coda. L'applicazione di uno stress lieve sotto forma di compiti motori impegnativi potrebbe rivelarsi utile in altri modelli murini che mostrano sintomi motori o neurodegenerazione, dove le interazioni gene-ambientali influenzano massicciamente il grado di progressione della malattia.
C'è una generale mancanza di compiti comportamentali predefiniti e scale di valutazione per classificare i movimenti e le posture anomale nei topi. La maggior parte delle attività motorie disponibili rivelano anomalie non specifiche, come il chiusura di hindlimb, che è un fenomeno ben noto in molti modelli murini di disturbi del movimento con neurodegenerazione18,19. Per la corretta caratterizzazione di un fenotipo, è tuttavia necessario analizzare se il modello murino ricapitola le caratteristiche salienti della malattia. Qui presentiamo la versione modificata di una scala di valutazione della distonia utilizzata in precedenza per la valutazione della disabilità motoria nei modelli murini di distonia15,16. Abbiamo inoltre sviluppato un sistema di punteggio basato su osservatori per il test di sospensione della coda, che è stato stabilito in modo simile alle scale di valutazione clinica della distonia umana. Entrambe le scale di valutazione mostrano un punteggio significativamente più alto nei topi stressati per l'uabaina rispetto agli animali non stressati e per gli animali confusi di uabain e agli animali perfuso da veicoli. Gli inconvenienti di qualsiasi sistema di punteggio basato su osservatori sono la formazione necessaria dei rater per garantire un punteggio coerente e per ridurre la variabilità dell'osservatore, nonché il pericolo di una possibile distorsione del rater se non completamente accecata al gruppo analizzato. Tuttavia, i sistemi di punteggio basati su osservatori presentano ancora un metodo facilmente accessibile per caratterizzare un fenotipo e possono essere adattati al modello murino analizzato, come fatto nel presente progetto per la valutazione dei movimenti simili alla distonia. Per garantire un punteggio coerente tra i diversi valutare, i video di formazione devono essere resi disponibili. Per ridurre qualsiasi potenziale distorsione, si consiglia di valutare diversi punteggi gli stessi clip video e che i singoli punteggi sono mediati. Entrambi i sistemi di punteggio menzionati all'interno di questo lavoro registrano la presenza di movimenti simili alla distonia negli animali. Le scale di valutazione possono essere adattate in base ai requisiti specifici all'interno di un progetto, come fatto in precedenza da Ip et al., dove solo gli arti posteriori sono stati segnati per movimenti simili alla distonia in un modello murino per la distonia 1 (DYT-TOR1A)20. Le scale di valutazione possono essere integrate da altri sistemi di punteggio pubblicati in precedenza, valutando ad esempio il grado di bradykinesia nei roditori come fatto con il punteggio di disabilità della locomozione da Calderon et al.13.

I vantaggi di una consegna continua di droga direttamente nel cervello sono numerosi. Iniezioni ripetitive e frequenti, che rappresentano un fattore di stress non necessario per gli animali, possono essere evitate e una concentrazione più costante intracerebrale del farmaco può essere raggiunto. Questo è particolarmente valido quando i farmaci somministrati sistemicamente non riescono a penetrare facilmente la barriera ematica. Inoltre, la consegna cronica di farmaci tramite pompe osmotiche consente la consegna localizzata di substrati che altrimenti avrebbero effetti collaterali a livello di sistema. I farmaci possono essere consegnati in modo mirato alle strutture cerebrali desiderate, l'effetto risultante può quindi essere rintracciato direttamente. Questo può essere utilizzato per una serie di applicazioni, come lo studio degli effetti terapeutici, nonché lo studio di pathomechanisms. Quest'ultima applicazione è stata utilizzata nel progetto qui per creare un modello di topo farmacologico per la distonia.
L'analisi e la comprensione delle sindromi distonica, che rappresentano il terzo disturbo del movimento più comune, sono state fortemente limitate dal fatto che i modelli genetici animali in gran parte non riescono a riprodurre il fenotipo della malattia trovato nell'uomo malato e la fisiofisiologia. Questo problema non si limita alle sindromi distonica, ma riguarda in realtà molti modelli di roditori transgenici nel campo dei disturbi delmovimento 1,2. La ragione della mancanza di un fenotipo nei modelli di roditori transgenici potrebbe essere basata su meccanismi compensativi altamente efficaci3. Nel caso della distonia, la malattia è caratterizzata da contrazioni muscolari involontarie che causano movimenti di torsione e posture anomale4. Lo studio delle cause secondarie (cioè lesioni cerebrali) dei sintomi distonica, ha contribuito a identificare le strutture coinvolte nella manifestazione di queste anomalie motorie, come i gangli basali5. Studi di imaging cerebrale di forme ereditarie di distonia hanno mostrato anomalie funzionali in quasi tutte le regioni cerebrali responsabili del controllo motorio e dell'integrazionesensoriale 6,7. Tuttavia, i modelli di roditori sono ancora necessari per approfondire la comprensione delle disfunzioni neurali a livello di rete molecolare e su larga scala, nonché per lo sviluppo di opzioni terapeutiche. È qui che i modelli farmacologici dei topi offrono la possibilità di replicare le caratteristiche cliniche e patologiche di una malattia in modo più preciso.
Distonia-parkinsonismo a esordio rapido (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) è una delle forme ereditarie di distonia. È causato da mutazioni di perdita di funzione nel gene ATP1 , che codifica per la sottounitàdi3 dollari della Na /K- -ATPase8. Inoltre, è riconosciuto che i portatori di mutazioni genetiche possono essere liberi dai sintomi per anni prima di sviluppare acutamente distonia generalizzata persistente e Parkinson dopo l'esposizione a un evento stressante. Infatti, la penetrazione di DYT/PARK-ATP1A3 è eventi incompleti e stressanti che agiscono come una gamma di innesco da sovraesperimento fisico e temperature estreme al consumo eccessivo di alcol einfezioni 9,10. Al fine di studiare DYT/PARK-ATP1A3 e di trovare potenziali interventi terapeutici, è stato provato più volte per imitare lo sviluppo della malattia dipendente dallo stress nei modelli di roditori. Tuttavia, a parte quello esistente modello di topo genetico DYT/PARK-ATP1A3, in cui i movimenti anormali e simili a convulsioni transitori sono stati indotti dall'ipotermia, tutti i modelli di topo genetici pubblicati per DYT/PARK-ATP1A3 non sono riusciti a produrre sintomi distinici1,11,12. Calderon et al. in precedenza ha dimostrato che il blocco della sottounità di 3 dollari bilateralmente nei gangli basali e nel cervelletto attraverso l'ouabaina glicoside cardiaca nei topi di tipo selvaggio si traduce in lieve disturbodell'andatura 13. L'esposizione aggiuntiva agli shock elettrici del piede in un ambiente caldo ha portato a un fenotipo distonico e bradycinetico, dimostrando così che la perfusione cronica e mirata di ouabaina seguita dallo stress imita con successo il fenotipo DYT/PARK-ATP1A3.
Tuttavia, l'esposizione degli animali a scosse elettriche ai piedi in un ambiente caldo di 38-40 gradi centigradi per un periodo di due ore induce dolore e ansia negli animali, che rappresentano fattori di confusione, in particolare per la valutazione dei cambiamenti nel sistema di catecholamina legati allo sviluppo della distonia. Così, qui descriviamo un diverso tipo di paradigma di stress con alto valore traslazionale, che si riferisce al fatto che l'esercizio da lieve a moderato sono stati descritti come trigger in DYT/PARK-ATP1A3 pazienti9. Inoltre, l'esercizio ripetitivo è un trigger ben noto per la distonia focale14. I topi sono stati ripetutamente sottoposti a impegnativi compiti motori composti da tre discende di un palo di legno ("pole test") e tre corse su un apparato Rotarod ("Rotarod performance test"). Il posizionamento degli animali sulla parte superiore di un palo di legno di 50 cm è stato utilizzato per costringere gli animali a scendere, l'apparato Rotarod è stato impiegato per sottoponere i topi ad attività forzata mettendoli su una canna rotante.
La caratterizzazione del fenotipo motorio di un modello murino per la distonia è particolarmente difficile a causa della mancanza di test e punteggi predefiniti. Tuttavia, una variazione di una valutazione della disabilità motoria è stata ripetutamente utilizzata negli ultimi anni per valutare la gravità e la distribuzione di movimenti simili alla distonia nei roditori13,15,16. Qui presentiamo una versione modificata della scala di valutazione della distonia, che si è dimostrata efficace nella valutazione del fenotipo di animali simile alla distonia quando viene osservato in un periodo di tempo di quattro minuti. Come secondo metodo per valutare i movimenti simili alla distonia, presentiamo un sistema di punteggio di recente sviluppo per la valutazione dei movimenti anomali durante un test di sospensione della coda. Permette la valutazione della frequenza e della durata dei movimenti simili alla distonia e delle posture degli arti anteriori, degli arti posteriori e del tronco.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% saline</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>PZN06178437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet osmotic pumps</td>
			<td>Durect</td>
			<td>4317</td>
			<td>model 1002, &#64258;owrate 0.25 &#956;L/h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anchor Screws</td>
			<td>AgnTho&#39;s</td>
			<td>MCS1x2</td>
			<td>2 mm long with a thread of 1mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulldog Clamps</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>13-320-035</td>
			<td>straight, 3.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacain 0.25% Jenapharm</td>
			<td>mibe GmbH Arzneimittel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula and Minipump Holder</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51636</td>
			<td>designed to hold 3.4 mm cannula heads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Bifurcation</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>21Y</td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula tubing</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>C312VT/PKG</td>
			<td>vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>fine forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye cream Bepanthen</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56109M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1070-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td>prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane System Dr&#228;ger Vapor 19.3</td>
			<td>Dr. Wilfried M&#252;ller GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kallocryl A/C</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>1615</td>
			<td>dental cement, liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kallocryl CPGM rot</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>1692</td>
			<td>dental cement, red powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonates adaptor</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>51625</td>
			<td>adaptor for mice for a traditional U-frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle holder</td>
			<td>KLS Martin Group</td>
			<td>20-526-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>51649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octenisept</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td>118211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>3280PD-3.0/SPC</td>
			<td>28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>3280PM/SPC</td>
			<td>28, Gauge, custom length 3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ouabain octahydrate 250 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03125-250MG</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Kern &#38; Sohn</td>
			<td>PFB 6000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal Thermal Probe</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl 50 mg/mL, injectable</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Carprofen, prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53800M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotaRod Advanced</td>
			<td>TSE Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw driver set</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>30090-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Burrs</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>HM71009</td>
			<td>0.9 mm &#216; burr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Burrs</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>HM71014</td>
			<td>1.4 mm &#216; burr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoDrive</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic instrument</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td></td>
			<td>custom made by Neurostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic robot</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture: coated vicryl, polyglatin 910</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V797D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for dyt/park-atp1a3 dystonia

I modelli murini geneticamente modificati presentano limitazioni, soprattutto quando si studiano i disturbi del movimento, dove la maggior parte dei modelli di roditori transgenici disponibili non presentano un fenotipo motorio simile agli aspetti clinici della malattia umana. I modelli farmacologici dei topi consentono uno studio più diretto del patomeccanti e del loro effetto sul fenotipo comportamentale. Pompe osmotiche collegate al cervello cannulas aprire la possibilità di creare modelli di topo farmacologico tramite la consegna di farmaci locali e cronici. Per il disturbo ereditario del distonia-parkinsonismo a esordio rapido, la mutazione di perdita di funzione nella sottounitàdi3 dollari della Na-K- ATPase può essere simulata da un blocco altamente specifico attraverso l'ouabaina glicoside. Al fine di bloccare localmente la sottounità di z3 nei gangli basali e nel cervelletto, che sono le due strutture cerebrali che si ritiene siano fortemente coinvolte nella patogenesi della distonia-parkinsonismo a esordio rapido, una cannula bilaterale viene impiantata stereotassicamente nello striato e un'ulteriore cannula singola viene introdotta nel cervelletto. Le cannulas sono collegate tramite tubi in vinile a due pompe osmotiche, che sono sottocutaneamente impiantate sul retro degli animali e consentono la consegna cronica e precisa di ouabaina. Il modello farmacologico del topo per la distonia-parkinsonismo a esordio rapido comporta l'ulteriore vantaggio di ricapitolare le caratteristiche cliniche e patologiche dei portatori di mutazioni asintomatiche e sintomatiche. Proprio come i portatori di mutazioni del parkinsonismo di distonia a esordio rapido, i topi perfuso di ouabaina sviluppano movimenti simili alla distonia solo dopo un'ulteriore esposizione allo stress. Dimostriamo un paradigma di stress lieve e introduciamo due sistemi di punteggio modificati per la valutazione di un fenotipo motorio.

La figura 4 è stata modificata da Rauschenberger et al.17. Per l'analisi dei dati sia della scala di valutazione della distonia (A) che del test di sospensione della coda (B), calcolare il punteggio totale per ogni punto temporale per ogni animale. La media di ogni punto temporale e ogni gruppo deve essere tracciata su un grafico appropriato. La distribuzione dei valori dovrebbe essere studiata e deve essere applicata la prova statistica appropriata per determinare la significatività. Con un numero sufficiente di animali, un fenotipo motorio può essere rilevato sia con la scala di classificazione della distonia che con la valutazione di movimenti anomali nella prova di sospensione della coda. Il fenotipo simile alla distonia è dimostrato dal punteggio motorio significativamente più alto in entrambe le valutazioni nel gruppo stressato perfuso di ouabain rispetto ai topi non stressati e all'ouabain e ai topi di controllo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg"> Figura 1: I principali passaggi chirurgici per l'impianto di cannula e pompa osmotica. (A) Per le coordinate indicate, i fori devono essere forati bilateralmente per la doppia cannula designata per i gangli basali e per la singola cannula posta sulla linea mediana del cervelletto. Le due pompe osmotiche completamente costruite sono mostrate su ogni lato dell'animale. (B) L'immagine mostra una cannula singola impiantata nel cervelletto, fissata con cemento dentale. La doppia cannula per i gangli basali deve essere collegata all'adattatore di biforcazione e precompilata con ouabaina prima dell'impianto. (C) Immagine della procedura finita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg"> Figura 2: Valutazione dei movimenti simili alla distonia con una scala di valutazione della distonia. Durante un video di 4 minuti, i movimenti simili alla distonia sono stati segnati in base alla distribuzione e alla durata del corpo. L'iperestensione involontaria degli arti anteriori, una posizione ampia o iperestensione degli arti posteriori e della cifosi sono stati classificati come distonia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg"> Figura 3: Valutazione dei movimenti simili alla distonia durante un test di sospensione della coda. Il sistema di punteggio appena sviluppato per i movimenti anomali durante un test di sospensione della coda di 2 minuti valuta i movimenti simili alla distonia negli arti anteriori, negli arti posteriori e nel tronco da 0-8 punti in totale. Per gli arti anteriori, un'iperestensione e l'attraversamento degli arti anteriori, nonché una flessione tonica verso il tronco qualificato come distonia.For the front limbs, a hyperextension and crossing of the front limbs, così come una flessione tonica verso il tronco qualificato come distonia. Per gli arti posteriori l'iperestensione involontaria e la retrazione con estensione sopra la linea mediana sono stati segnati come distonia.For the hindlimbs the involuntary hyperextension, così come retraction with extension over the midline was scored as dystonia-like. Una distorsione truncal oltre l'80% del tempo registrato è stata segnata con un punto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg"> Figura 4: Grafici rappresentativi della scala di classificazione della distonia e del test di sospensione della coda. (A) Il grafico raffigura la scala di valutazione della distonia per topi confusi e stressati (linea nera tratteggiata), topi confusi di ouabain e non stressati (linea arancione tratteggiata) e topi confusi e stressati dall'uabaina (linea blu scuro). Per ogni punto di tempo, vengono visualizzati i valori medio : errore standard della media (SEM). (B) Il diagramma mostra la valutazione dei movimenti anomali durante un test di sospensione della coda di 2 minuti per topi confusi e stressati NaCl (linea nera tratteggiata), topi perfuso di ouabain e non stressati (linea arancione tratteggiata) e topi stressati per l'uabaina (linea blu scuro). L'analisi statistica è stata fatta per la scala di valutazione della distonia e il punteggio del test di sospensione della coda utilizzando il test Mann-Whitney a due code. La correzione Bonferroni-Holm dei valori p ha mostrato una differenza significativa per il periodo osservazionale di 72 h. Blu scuro - denotano differenze significative tra ouabain-perfused, topi stressati e ouabain-perfused, topi non stressati, nero - denotano differenze significative tra NaCl-perfused, topi stressati e ouabain-perfused, topi stressati così come tra NaCl-perfused, topi stressati e ouabain-perfused, topi non stressati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia at JoVE.com

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Forniamo un protocollo per generare un modello farmacologico di topo dystonia DYT/PARK-ATP1A3 attraverso l'impianto di cannulas in gangli basali e cervelletto collegati a pompe osmotiche. Descriviamo l'induzione di movimenti simili alla distonia attraverso l'applicazione di una sfida motoria e la caratterizzazione del fenotipo tramite sistemi di punteggio comportamentale.

Impianto di pompe osmotiche e induzione dello stress per stabilire un modello sintomatico, farmacologico del mouse per DYstonia DYT/PARK-ATP1A3

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è descrivere le procedure coinvolte nella definizione di un modello sintomatico e farmacologico del topo per la distonia DYT /PARK-ATP1A3 utilizzando cannule cerebrali nelle pompe osmotiche e inducendo stress attraverso compiti motori impegnativi. Questo metodo descrive in dettaglio come stabilire un modello di topo farmacologico utilizzando la somministrazione cronica di farmaci tramite pompe osmotiche a più cannule cerebrali e come indurre il fenotipo attraverso compiti motori impegnativi. Il paradigma dello stress motorio lieve fornisce anche approfondimenti sul ruolo delle interazioni gene-ambientali nei disturbi del movimento e può essere applicato ad altri modelli di roditori.Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida nazionali e istituzionali applicabili per la cura e l'uso degli animali. Inizia preparando le pompe osmotiche in un ambiente sterile. In primo luogo, riempire una siringa da un millilitro con una cannula di riempimento calibro 27 con soluzione di ouabain filtrata sterile o soluzione per veicoli.Tenere la pompa osmotica in posizione verticale, inserire la cannula fino alla pompa e riempire lentamente il serbatoio fino a quando la soluzione in eccesso appare in cima. Quindi, inserire il moderatore di flusso nella pompa. Togliere con cura la flangia bianca del moderatore di flusso con le forbici e collegare un pezzo di tubi in vinile al moderatore del flusso.Immergere ogni pompa in tubi Eppendorf riempiti a metà della soluzione salina e metterli in un termociclo di 37 gradi per garantire che la velocità di pompaggio raggiunga uno stato stazionario prima di iniziare l'intervento chirurgico. Dopo che l'animale è stato profondamente anestetizzato secondo protocolli approvati, posizionare l'animale in un telaio stereotattico e fissare la testa usando punte di gomma o barre dell'orecchio non rotture. Dopo un'accurata disinfezione dell'area chirurgica, utilizzare un bisturi per posizionare l'incisione nella parte superiore della testa e utilizzare le forbici per continuare l'incisione fino agli arti anteriori.Esporre il cranio con l'aiuto di morsetti bulldog e pulire il periostio con un applicatore sterile con punta di cotone. Allineare una penna o la punta di una cannular macchiata di inchiostro nero con bregma e utilizzare le coordinate appropriate per contrassegnare i tre punti di ingresso per le cannule cerebrali sul cranio. Successivamente, praticare con cura i fori per il doppio cannolo designato per i gangli basali e la singola cannula designata per il cervelletto.Praticare un quarto foro per una piccola vite tra lo striato e il cervelletto. Questa vite sarà infine incorporata nel cemento dentale e fornirà una presa aggiuntiva per le cannule. Al fine di creare una piccola tasca per la pompa osmotica su ciascun lato degli animali indietro, utilizzare le forcelle tissutali per separare gli strati di tessuto sottocutaneo.Avanzare le forcep verso una gamba posteriore e aprire leggermente le forcep per allargare la tasca sottocutanea. Ripetere la stessa procedura per l'altro lato, prima rimuovendo le forcep dall'incisione e quindi spingendole delicatamente verso la seconda gamba posteriore. Con l'aiuto di forcep, inserire con cura le pompe e il catetere collegato in ogni tasca sottocutanea.La tasca dovrebbe consentire alla pompa di scivolare facilmente. Utilizzando un mini portapompa, introdurre una singola cannula osmotica con una lunghezza personalizzata di 3,0 millimetri nel foro praticato nella linea mediana del cervelletto. Staccare attentamente la testa di cannula e fissare la cannula e la piccola vite con cemento dentale, facendo attenzione a non coprire il pezzo di collegamento per il tubo della pompa osmotica.Assicurarsi che il cemento del dentista che circonda la cannula si sia completamente asciugato prima di continuare con l'intervento chirurgico. Prima di inserire la doppia cannula nei fori praticati bilateralmente sopra i gangli basali, attaccare due pezzi di tubi in vinile lunghi 0,5 centimetri ai due pezzi di collegamento della doppia cannula. Collegare i tubi in vinile con un adattatore biforcazione e precomporre con cura l'intero sistema di tubi con soluzione o veicolo a ouabain sterile.Quindi, ripetere gli stessi passaggi mostrati in precedenza per la cannula singola e terminare fissando la doppia cannula con cemento dentale. Collegare i cateteri delle pompe osmotiche rispettivamente all'adattatore di biforcazione e a una singola cannula. Entrambe le pompe hanno una portata uguale, quindi fare attenzione a collegare la pompa osmotica con una doppia soluzione concentrata all'adattatore di biforcazione per garantire che la stessa concentrazione raggiunga sia i gangli basali che il cervelletto.Chiudere l'incisione sul retro degli animali con punti per quanto possibile senza allungare eccessivamente la pelle. Iniettare per via sottocutanea una soluzione salina sterile, che dovrebbe avere la temperatura corporea per evitare la disidratazione. Rimuovere l'animale dal telaio stereotattico e posizionarelo nella gabbia di recupero.Al fine di indurre movimenti simili alla distonia, i topi perfusi di ouabaina dovrebbero essere esposti a compiti motori impegnativi come paradigma di stress lieve quattro ore dopo l'intervento chirurgico e ripetutamente ogni 24 ore dopo. Questo non include una caratterizzazione comportamentale degli animali. Dimostriamo qui l'esempio di un animale perfuso dal veicolo, che viene posizionato su un palo di legno di superficie ruvida di 50 centimetri, naso rivolto verso il basso.Fornire una biancheria da letto sufficiente alla base del palo in caso di cadute. Per i topi perfusi di ouabain, gli animali dovrebbero iniziare a presentare i primi sintomi come la bradicinesia quattro ore dopo l'intervento chirurgico. Tuttavia, 24 ore dopo l'intervento chirurgico, dovresti vedere l'iperestensione involontaria degli arti anteriori o posteriori come un segno di movimenti simili alla distonia durante la discesa.I topi dovrebbero scendere il palo tre volte, consentire almeno due minuti di recupero tra ogni discesa. Il tempo di discesa non deve essere misurato. La prova del palo deve essere seguita da un secondo compito del motore, utilizzando un'asta rotante.Come per il test delle prestazioni rotarod, l'ouabain e i topi perfusi dal veicolo dei gruppi di stress vengono posizionati sull'asta rotante. La latenza a cadere non deve essere misurata. Come fatto per il test precedente, i topi devono essere posizionati sull'asta rotante tre volte, consentendo due minuti di recupero tra una serie e l'altra.La scala di classificazione della distonia modificata può essere utilizzata per valutare la frequenza, la gravità e la distribuzione corporea dei movimenti simili alla distonia dei topi. Gli animali devono essere collocati in una scatola di plastica o di legno e i movimenti devono essere registrati per un periodo di tempo di quattro minuti. I tassi devono essere accecati dall'assegnazione del gruppo.Movimenti o posture considerati simili alla distonia sono l'iperestensione involontaria degli arti anteriori, una posizione ampia o l'iperestensione degli arti posteriori, così come la cifosi. Se solo una parte del corpo è interessata, la distonia deve essere considerata focale. Se il tronco e almeno altre due parti del corpo sono colpite, la distonia deve essere considerata generalizzata.Un secondo sistema di punteggio di nuova sviluppo da zero a otto punti, valuta la presenza e la gravità dei movimenti simili alla distonia durante un test di sospensione della coda. Per il test, tenere il mouse vicino alla coda vicino alla sua base per due minuti. Si consiglia di registrare il test di sospensione della coda e assegnare un punteggio all'analisi successiva del metraggio.Gli arti anteriori sono segnati da zero a quattro punti. Le retrazioni toniche ripetute o sostenute di uno degli arti anteriori, così come l'iperestensione combinata con l'incrocio degli arti anteriori sono segnati come distonia. Movimenti simili alla distonia degli arti posteriori, che significa retrazione e stringe, così come iperestensione sostenuta, sono segnati da zero a tre punti.Una distorsione tronca presente oltre l'80% del tempo registrato viene segnata con un punto aggiuntivo. La chiusura degli arti posteriori è un segno non specifico per la compromissione motoria e non deve essere segnata. Questo grafico mostra i risultati della scala di valutazione della distonia.I topi stressati perfusi di ouabain presentano movimenti significativamente più simili alla distonia in un periodo osservazionale di 72 ore rispetto al gruppo perfuso di ouabain non stressato, così come agli animali del veicolo. Questa immagine mostra i risultati del test di sospensione della coda e mostra un risultato simile alla scala di classificazione della distonia. Si noti che i risultati della media dal punteggio totale di ogni animale per ogni punto di tempo.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impiantare stereotassicamente più cannule cerebrali e come impiantare per via sottocutanea pompe osmotiche. Il vantaggio principale di questo metodo è che le iniezioni ripetitive e stressanti possono essere evitate e che un substrato come l'ouabain, che altrimenti avrebbe effetti collaterali a livello di sistema, può essere consegnato direttamente a una specifica struttura cerebrale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Ricerca

Neuroscienze

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

L&#39;impianto di Miniosmotic Pompe e consegna di traccianti Tract allo Studio Riorganizzazione Cervello in condizioni fisiopatologiche

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Measurement &amp; Analysis of the Temporal Discrimination Threshold Applied to Cervical Dystonia

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La misura e l'analisi della soglia di discriminazione temporale applicata alla distonia cervicale

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Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

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Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

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