Name: implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for dyt/park-atp1a3 dystonia
Uploaded: 2020-09-12T15:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia at JoVE.com

Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и научных исследований (BMBF DysTract to C.W.I.) и Междисциплинарным центром клинических исследований при Университете Вюрцбурга (No2-CSP3 в Лос-Анджелесе). Авторы благодарят Луизу Фриш, Кеали Рём, Веронику Сенгер и Хайко Менцеля, а также Хельгу Брюннер за заботу о животных.

<ol>
	<li>DeAndrade, M. P., Yokoi, F., van Groen, T., Lingrel, J. B., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Atp1a3+mutant+mice+as+a+model+of+rapid-onset+dystonia+with+parkinsonism.">Characterization of Atp1a3 mutant mice as a model of rapid-onset dystonia with parkinsonism.</a> Behavioural Brain Research. 216 (2), 659-665 (2011).</li><li>Dang, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+Dyt1+DeltaGAG+knock-in+mouse+as+a+model+for+early-onset+dystonia.">Generation and characterization of Dyt1 DeltaGAG knock-in mouse as a model for early-onset dystonia.</a> Experimental Neurology. 196 (2), 452-463 (2005).</li><li>Kreiner, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mechanisms+in+genetic+models+of+neurodegeneration:+are+the+mice+better+than+humans.">Compensatory mechanisms in genetic models of neurodegeneration: are the mice better than humans.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 56 (2015).</li><li>Albanese, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenology+and+classification+of+dystonia:+a+consensus+update.">Phenomenology and classification of dystonia: a consensus update.</a> Movement Disorders. 28 (7), 863-873 (2013).</li><li>Marsden, C. D., Obeso, J. A., Zarranz, J. J., Lang, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomical+basis+of+symptomatic+hemidystonia.">The anatomical basis of symptomatic hemidystonia.</a> Brain. 108, 463-483 (1985).</li><li>Carbon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+sensorimotor+network+activity+in+DYT1+dystonia:+a+functional+imaging+study.">Increased sensorimotor network activity in DYT1 dystonia: a functional imaging study.</a> Brain. 133, 690-700 (2010).</li><li>Carbon, M., Su, S., Dhawan, V., Raymond, D., Bressman, S., Eidelberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+metabolism+in+primary+torsion+dystonia:+effects+of+penetrance+and+genotype.">Regional metabolism in primary torsion dystonia: effects of penetrance and genotype.</a> Neurology. 62 (8), 1384-1390 (2004).</li><li>de Carvalho Aguiar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+Na+/K++-ATPase+alpha3+gene+ATP1A3+are+associated+with+rapid-onset+dystonia+parkinsonism.">Mutations in the Na+/K+ -ATPase alpha3 gene ATP1A3 are associated with rapid-onset dystonia parkinsonism.</a> Neuron. 43 (2), 169-175 (2004).</li><li>Brashear, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phenotypic+spectrum+of+rapid-onset+dystonia-parkinsonism+(RDP)+and+mutations+in+the+ATP1A3+gene.">The phenotypic spectrum of rapid-onset dystonia-parkinsonism (RDP) and mutations in the ATP1A3 gene.</a> Brain. 130 (3), 828-835 (2007).</li><li>Barbano, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+triggers+and+non-motor+findings+in+a+family+with+rapid-onset+dystonia-parkinsonism.">New triggers and non-motor findings in a family with rapid-onset dystonia-parkinsonism.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 18 (6), 737-741 (2012).</li><li>Isaksen, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypothermia-induced+dystonia+and+abnormal+cerebellar+activity+in+a+mouse+model+with+a+single+disease-mutation+in+the+sodium-potassium+pump.">Hypothermia-induced dystonia and abnormal cerebellar activity in a mouse model with a single disease-mutation in the sodium-potassium pump.</a> PLOS Genetics. 13 (5), 1006763 (2017).</li><li>Sugimoto, H., Ikeda, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterozygous+mice+deficient+in+Atp1a3+exhibit+motor+deficits+by+chronic+restraint+stress.">Heterozygous mice deficient in Atp1a3 exhibit motor deficits by chronic restraint stress.</a> Behavioural Brain Research. 272, 100-110 (2014).</li><li>Calderon, D. P., Fremont, R., Kraenzlin, F., Khodakhah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+substrates+of+rapid-onset+Dystonia-Parkinsonism.">The neural substrates of rapid-onset Dystonia-Parkinsonism.</a> Nature Neuroscience. 14 (3), 357-365 (2011).</li><li>Cutsforth-Gregory, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+exercise+dystonia:+A+difficult+to+treat+hazard+of+runner+and+non-runner+athletes.">Repetitive exercise dystonia: A difficult to treat hazard of runner and non-runner athletes.</a> Parkinsonism &amp; Related Disorders. 27, 74-80 (2016).</li><li>Pizoli, C. E., Jinnah, H. A., Billingsley, M. L., Hess, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Cerebellar+Signaling+Induces+Dystonia+in+Mice.">Abnormal Cerebellar Signaling Induces Dystonia in Mice.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (17), 7825-7833 (2002).</li><li>Jinnah, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channel+agonists+and+dystonia+in+the+mouse.">Calcium channel agonists and dystonia in the mouse.</a> Movement Disorders. 15 (3), 542-551 (2000).</li><li>Rauschenberger, L., Knorr, S., Al-Zuraiqi, Y., Tovote, P., Volkmann, J., Ip, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+dopaminergic+dysregulation+and+dystonia-like+movements+induced+by+sensorimotor+stress+in+a+pharmacological+mouse+model+of+rapid-onset+dystonia-parkinsonism.">Striatal dopaminergic dysregulation and dystonia-like movements induced by sensorimotor stress in a pharmacological mouse model of rapid-onset dystonia-parkinsonism.</a> Experimental Neurology. 323, 113109 (2020).</li><li>Fernagut, P. O., Diguet, E., Bioulac, B., Tison, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MPTP+potentiates+3-nitropropionic+acid-induced+striatal+damage+in+mice:+reference+to+striatonigral+degeneration.">MPTP potentiates 3-nitropropionic acid-induced striatal damage in mice: reference to striatonigral degeneration.</a> Experimental Neurology. 185 (1), 47-62 (2004).</li><li>Guyenet, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+composite+phenotype+scoring+system+for+evaluating+mouse+models+of+cerebellar+ataxia.">A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia.</a> Journal of Visualized Experiments. 39, 1787 (2010).</li><li>Ip, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tor1a+/-+mice+develop+dystonia-like+movements+via+a+striatal+dopaminergic+dysregulation+triggered+by+peripheral+nerve+injury.">Tor1a+/- mice develop dystonia-like movements via a striatal dopaminergic dysregulation triggered by peripheral nerve injury.</a> Acta Neuropathologica Communications. 4, 108 (2016).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Эта фармакологическая модель мыши DYT/PARK-ATP1A3 позволяет детально анализ внутримозговых структурных и нейрохимических изменений, вызванных исключительно ингибированием ионного насоса натрия и калия в базальных ганглиях и мозжечках, а также изменениями, связанными со стрессовым воздействием. В случае мышей, максимум два осмотических насосов могут быть подкожно имплантированы. В настоящем настоящем мы представляем метод, подробно описывающий хроническую доставку лекарств в несколько структур мозга путем реализации двойной канюли, подключенной к адаптеру бифуркации в дополнение к одной канюле. Эта методология может быть использована для любого приложения, требующего нескольких структур мозга, которые будут проникнуты одновременно и хронически.
Мы представляем модель мыши редкого расстройства движения, где у пациентов развиваются постоянные симптомы после воздействия стресса. Это предполагаемое генно-экологическое взаимодействие до сих пор не изучено, но может представлять собой один из ключевых патомеханизмов в развитии DYT/PARK-ATP1A3. Различные методы подвергая мышей стресс были опубликованы в прошлом и включают в себя электрическим током ноги, сдерживание, холодная или теплая окружающая среда и воздействиеразличных запахов 11,12,13. В попытке подвергать мышей мягкому стресс-фактору с трансляционным значением, мы описываем повторяющееся субъективим мышей сложным моторным задачам. Для полюса тест, ouabain перфузных животных показали непроизвольные гиперэкстензии передних конечностей и задних конечностей. Эти движения были очень похожи на дистонии, как движения, наблюдаемые во время 4-минутной видеозаписи животных, а также хвост подвески испытания. Применение легкого стресса в виде сложных двигательных задач может оказаться полезным в других моделях мыши, показывающих двигательные симптомы или нейродегенерацию, где генно-экологические взаимодействия массово влияют на степень прогрессирования заболевания.
Существует общее отсутствие предопределенных поведенческих задач, а также рейтинговых шкал для классификации аномальных движений и поз у мышей. Большинство доступных двигательных задач выявить неспецифические аномалии, такие как задняя сжимая, который является известным явлением во многих моделях мыши двигательных расстройств с нейродегенерации18,19. Для правильной характеристики фенотипа, однако, необходимо проанализировать, является ли модель мыши резюмирует основные особенности заболевания. В этом случае мы представляем модифицированную версию шкалы рейтинга дистонии, используемую ранее для оценки двигательной инвалидности в моделяхмышей дистонии 15,,16. Мы дополнительно разработали систему оценки на основе наблюдателей для теста на подвеску хвоста, которая была создана по аналогии с клиническими рейтинговыми шкалами дистонии человека. Обе шкалы рейтинга показывают значительно более высокий балл в ouabain-perfused, подчеркнул мышей по сравнению с ouabain перфектом, не подчеркнул животных, а также транспортных средств проникнуты животных. Недостатками любой системы подсчета очков на основе наблюдателей являются необходимая подготовка тарифов для обеспечения последовательного скоринга и уменьшения изменчивости наблюдателей, а также опасность возможного смещения тарифера, если он не будет полностью ослеплен анализируемой группой. Тем не менее, системы оценки на основе наблюдателей по-прежнему представляют можно легкодоступный метод характеристики фенотипа и могут быть адаптированы к модели мыши проанализированы, как это делается в настоящем проекте для оценки дистонии, как движения. Для обеспечения последовательного скоринга среди различных тарифов, учебные видео должны быть доступны. Чтобы уменьшить любые потенциальные предубеждения, рекомендуется, чтобы различные тарифы оценка же видеоклипы и что отдельные баллы усредняться. Обе системы скоринга, упомянутые в этой работе, записывают наличие дистонии, как движения у животных. Шкалы рейтинга могут быть адаптированы в соответствии с конкретными требованиями в рамках проекта, как это было сделано ранее Ip et al., где исключительно задние конечности были забиты для дистонии, как движения в мышиной модели для дистонии 1 (DYT-TOR1A)20. Рейтинговые шкалы могут быть дополнены другими ранее опубликованными системами скоринга, оценивая, например, степень брадикинезии у грызунов, как это делается с оценкой инвалидности передвижения Calderon et al.13.

Преимущества непрерывной доставки препарата непосредственно в мозг многочисленны. Повторяющиеся и частые инъекции, которые представляют собой ненужный фактор стресса для животных, можно избежать и более постоянная внутримозговая концентрация препарата может быть достигнута. Это особенно актуально, когда системно вводимые препараты не могут легко проникнуть в геммоугефалический барьер. Кроме того, хроническая доставка лекарств с помощью осмотических насосов позволяет локализовать доставку субстратов, которые в противном случае были бы системно-широкими побочными эффектами. Препараты могут быть доставлены в целенаправленной образом желаемых структур мозга, в результате эффект может быть непосредственно прослеживается. Это может быть использовано для целого ряда приложений, таких как изучение терапевтических эффектов, а также изучение патомеханизмов. Последнее приложение было использовано в проекте в настоящем для того, чтобы создать фармакологическую модель мыши для дистонии.
Анализ и понимание дистонических синдромов, которые представляют собой третье наиболее распространенное расстройство движения, были сильно ограничены тем фактом, что генетические модели животных в значительной степени не в состоянии воспроизвести фенотип болезни, найденный у больного человека, а также патофизиологии. Этот вопрос не ограничивается дистоническими синдромами, но на самом деле касается многих трансгенных моделей грызуновв области нарушений движения 1,,2. Причина отсутствия фенотипа в трансгенных моделях грызунов может быть основана на высокоэффективных компенсационных механизмах3. В случае дистонии, болезнь характеризуется непроизвольными сокращениями мышц, вызывая скручивание движений и ненормальные позы4. Изучение вторичных причин (т.е. черепно-мозговой травмы) дистонических симптомов, помогло определить структуры, участвующие в проявлении этих двигательных аномалий, таких как базальныеганглии 5. Исследования изображений мозга наследственных форм дистонии показали функциональные аномалии почти во всех областях мозга, ответственных за контроль двигателя и сенсорнойинтеграции 6,7. Тем не менее, модели грызунов по-прежнему необходимы для углубления понимания нервных дисфункций на молекулярном и крупномасштабном сетевом уровне, а также для разработки терапевтических вариантов. Именно здесь фармакологические модели мышей предлагают возможность более точной репликации клинических и патологических особенностей заболевания.
Быстрый дистония-паркинсонизм (DYT/PARK-ATP1A3; RDP; DYT12) является одной из наследственных форм дистонии. Это вызвано потерей функциональных мутаций в гене АТФ1-3, который кодирует для 3-субъединитNaq/K-ATPase8. Кроме того, признается, что носители генных мутаций могут быть свободны от симптомов в течение многих лет, прежде чем остро развивается постоянная обобщенная дистония и паркинсонизм после воздействия стрессового события. Действительно, penetrance DYT/PARK-ATP1A3 является неполным и стрессовых событий, действующих в качестве триггера диапазоне от физического перенапряжения и экстремальных температур чрезмерного потребления алкоголяи инфекций 9,10. Для того, чтобы изучить DYT/PARK-ATP1A3 и найти потенциальные терапевтические вмешательства, он был опробован много раз, чтобы имитировать стресс-зависимого развития болезни в моделях грызунов. Однако, помимо одной существующей генетической модели мыши DYT/PARK-ATP1A3, где переходные ненормальные и судороги, как движения были вызваны переохлаждением, все опубликованные генетические модели мыши для DYT/PARK-ATP1A3 не смогли произвести дистонические симптомы1,11,12. Кальдерон и др. ранее продемонстрировали, что блокирование No 3-субъединит на двусторонней основе в базальных ганглиев и мозжечка через сердечный гликозид уабаин в диких мышей типа приводит к мягкой походкенарушения 13. Дополнительное воздействие электрошоков в теплой среде привело к дистонической и брадикинетической фенотип, тем самым продемонстрировав, что хроническая и целевая перфузия уабаина с последующим стрессом успешно имитирует фенотип DYT/PARK-ATP1A3.
Тем не менее, подвергая животных электрическим током ног в теплой среде 38-40 градусов по Цельсию в течение двух часов-период вызывает боль и беспокойство у животных, которые представляют собой смешанные факторы, особенно для оценки изменений в системе катехоламинов, связанных с развитием дистонии. Таким образом, мы описываем другой вид стресса парадигмы с высокой трансляционной стоимости, которая относится к тому, что легкой до умеренной упражнения были описаны как триггеры в DYT/ PARK-ATP1A3пациентов 9. Кроме того, повторяющиеся упражнения является известным триггером для очаговой дистонии14. Мыши неоднократно подвергались сложным моторным задачам, состоящим из трех спусков деревянного столба ("полюс-тест") и трех пробежек на аппарате Ротарода ("Тест производительности Ротарода"). Размещение животных на вершине 50-сантиметрового деревянного столба было использовано для принуждения животных к спуску, аппарат Ротарода использовался для принудительной деятельности мышей, помещая их на вращающийся стержень.
Характеристика моторного фенотипа мышиной модели для дистонии является особенно сложной из-за отсутствия предопределенных тестов и оценок. Тем не менее, один вариант оценки двигательной инвалидности неоднократно использовался в течение последних лет для того, чтобы оценить тяжесть и распределение дистонии, как движенияу грызунов 13,15,16. Настоящим мы представляем модифицированную версию рейтинговой шкалы дистонии, которая доказала свою эффективность в оценке фенотипа животных, похожего на дистонию, при наблюдении в течение четырех минут. В качестве второго метода оценки дистонии, как движения, мы представляем недавно разработанную систему скоринга для оценки ненормальных движений во время теста подвески хвоста. Это позволяет оценить частоту и продолжительность дистонии, как движения и позы передних конечностей, задних конечностей, а также туловища.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% saline</td>
			<td>Fresenius Kabi</td>
			<td></td>
			<td>PZN06178437</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alzet osmotic pumps</td>
			<td>Durect</td>
			<td>4317</td>
			<td>model 1002, &#64258;owrate 0.25 &#956;L/h</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anchor Screws</td>
			<td>AgnTho&#39;s</td>
			<td>MCS1x2</td>
			<td>2 mm long with a thread of 1mm O.D.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bulldog Clamps</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>13-320-035</td>
			<td>straight, 3.5 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bupivacain 0.25% Jenapharm</td>
			<td>mibe GmbH Arzneimittel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula and Minipump Holder</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51636</td>
			<td>designed to hold 3.4 mm cannula heads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula Bifurcation</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>21Y</td>
			<td>custom made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula tubing</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>C312VT/PKG</td>
			<td>vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5SF forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>fine forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye cream Bepanthen</td>
			<td>Bayer Vital GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56109M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hardened fine scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Rotary Micromotor Kit</td>
			<td>Foredom</td>
			<td>K.1070-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL</td>
			<td>cp-pharma</td>
			<td>1214</td>
			<td>prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane System Dr&#228;ger Vapor 19.3</td>
			<td>Dr. Wilfried M&#252;ller GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kallocryl A/C</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>1615</td>
			<td>dental cement, liquid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kallocryl CPGM rot</td>
			<td>Speiko</td>
			<td>1692</td>
			<td>dental cement, red powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse and neonates adaptor</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>51625</td>
			<td>adaptor for mice for a traditional U-frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle holder</td>
			<td>KLS Martin Group</td>
			<td>20-526-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td>51649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octenisept</td>
			<td>Sch&#252;lke</td>
			<td>118211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>3280PD-3.0/SPC</td>
			<td>28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single</td>
			<td>Plastics One</td>
			<td>3280PM/SPC</td>
			<td>28, Gauge, custom length 3.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ouabain octahydrate 250 mg</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03125-250MG</td>
			<td>CAUTION: toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td>Kern &#38; Sohn</td>
			<td>PFB 6000-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rectal Thermal Probe</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rimadyl 50 mg/mL, injectable</td>
			<td>Zoetis</td>
			<td></td>
			<td>Carprofen, prescription needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53800M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotaRod Advanced</td>
			<td>TSE Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>screw driver set</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>30090-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Burrs</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>HM71009</td>
			<td>0.9 mm &#216; burr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Burrs</td>
			<td>Agntho&#39;s</td>
			<td>HM71014</td>
			<td>1.4 mm &#216; burr</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StereoDrive</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td></td>
			<td>software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic instrument</td>
			<td>Stoelting Co.</td>
			<td></td>
			<td>custom made by Neurostar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic robot</td>
			<td>Neurostar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>suture: coated vicryl, polyglatin 910</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>V797D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for dyt/park-atp1a3 dystonia

Генетически модифицированные модели мышей сталкиваются с ограничениями, особенно при изучении двигательных расстройств, где большинство доступных трансгенных моделей грызунов не представляют моторный фенотип, напоминающий клинические аспекты болезни человека. Фармакологические модели мышей позволяют более непосредственно изучать патомеханизмы и их влияние на поведенческий фенотип. Осмотические насосы, подключенные к канюли мозга, открывают возможность создания фармакологических моделей мышей с помощью местных и хронических лекарств. Для наследственного расстройства движения быстрого начала дистонии-паркинсонизма, потеря функции мутации в No 3-субъединицыNaq/K-ATPase может быть смоделирована весьма специфической блокады через гликозид уабаин. Для того, чтобы локально блокировать No 3-субъединит в базальных ганглиев и мозжечка, которые являются двумя структурами мозга, как полагают, активно участвует в патогенеза быстрого начала дистонии-паркинсонизма, двусторонняя канюля стереотаксис имплантируется в стриатум и дополнительные одной канюли вводится в мозжечок. Каннулы соединены через виниловые трубки с двумя осмотическими насосами, которые подкожно имплантируются на спину животных и позволяют хронические и точные поставки уабаина. Фармакологическая модель мыши для быстрого начала дистонии-паркинсонизма несет в себе дополнительное преимущество повторения клинических и патологических особенностей азимптоматических и симптоматических носителей мутаций. Так же, как носители мутации быстрого начала дистонии паркинсонизма, уабаин проникнуты мышей развивать дистония, как движения только после дополнительного воздействия стресса. Мы демонстрируем мягкую парадигму стресса и внедряем две модифицированные системы скоринга для оценки фенотипа двигателя.

Рисунок 4 был изменен из Rauschenberger и др.17. Для анализа данных как по шкале рейтинга дистонии(A), так ипо тесту подвескихвоста (B),вычислите общий балл за каждую точку времени для каждого животного. Среднее время каждой точки времени и каждой группы должно быть вы построения на соответствующем графике. Следует иззнать распределение значений и продать соответствующий статистический тест для определения значимости. При достаточном количестве животных, моторный фенотип может быть обнаружен как по шкале оценки дистонии, так и с оценкой аномальных движений в тесте подвески хвоста. Дистония-как фенотип демонстрируется значительно более высокий двигатель оценка в обеих оценках в уабаин-perfused, подчеркнул группы по сравнению с уабаин проникнуты, не подчеркнул мышей, а также контроля мышей.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2.jpg"> Рисунок 1: Основные хирургические шаги для имплантации канюли и осмотического насоса. A)Для указанных координат отверстия необходимо просверлить на двусторонней основе для двойной канюли, предназначенной для базальных ганглиев и для одной канюли, помещенной в средней линии мозжечка. Два полностью построенных осмотических насоса показаны с каждой стороны животного. (B)На рисунке показан имплантированный одиночный канюлю в мозжечок, закрепленный зубным цементом. Двойная канюля для базальных ганглиев должна быть подключена к адаптеру бифуркации и предварительно заполнена уабаином перед имплантацией. (C)Изображение готовой процедуры. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig1v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig02.jpg"> Рисунок 2: Оценка дистонии, как движения с дистонией рейтинговой шкалы. Во время 4 мин видео, дистония, как движения были забиты на основе распределения тела и продолжительности. Непроизвольная гиперэкстензия передних конечностей, широкая позиция или гиперэкстензия задних конечностей, а также кифоз были оценены как дистония-как. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig03.jpg"> Рисунок 3: Оценка дистонии, как движения во время теста подвески хвоста. Недавно разработанная система скоринга для аномальных движений во время 2-минутного теста подвески хвоста оценивает дистонии, как движения в передних конечностях, задних конечностей и туловища от 0-8 баллов в общей сложности. Для передних конечностей, гиперэкстензии и пересечения передних конечностей, а также тонизирующее сгибание к стволу квалифицированы как дистония- как. Для задних конечностей непроизвольная гиперэкстензия, а также опровержение с расширением над средней линией был забит как дистония-как. С одним очком было забито truncal искажение более 80% записанного времени. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61635/61635fig04.jpg"> Рисунок 4: Репрезентативные графики шкалы оценки дистонии и тест на подвеску хвоста. (A) График изображает дистония-рейтинг шкалы для NaCl-perfused, подчеркнул мышей (пунктирная черная линия), ouabain проникнуты, не подчеркнул мышей (пунктирная оранжевая линия) и уабаин проникнуты, подчеркнул мышей (темно-синяя линия). Для каждой точки времени отображаются средние значения и стандартная погрешность среднего (SEM). (B) Диаграмма показывает оценку аномальных движений во время 2-минутного теста подвески хвоста для NaCl-perfused, подчеркнул мышей (пунктирная черная линия), уабаин проникнуты, не подчеркнул мышей (пунктирная оранжевая линия) и ouabain-perfused, подчеркнул мышей (темно-синяя линия). Статистический анализ был сделан для шкалы рейтинга дистонии и теста подвески хвоста, используя двуххвостый тест Манн-Уитни. Коррекция р-значений Bonferroni-Holm показала существенную разницу за период наблюдений 72 ч. Темно-синий - обозначают значительные различия между ouabain-perfused, подчеркнул мышей и уабаин проникнуты, не-напряженных мышей мышей, черный - обозначают значительные различия между NaCl-perfused, подчеркнул мышей и уабаин-perfused, подчеркнул мышей, а также между NaCl-perfused, подчеркнул мышей и ouabain-perfused, не-напряженных мышей. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61635/61635fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia at JoVE.com

Implantation of Osmotic Pumps and Induction of Stress to Establish a Symptomatic, Pharmacological Mouse Model for DYT/PARK-ATP1A3 Dystonia

Мы предоставляем протокол для создания фармакологических DYT/PARK-ATP1A3 дистония мыши модели через имплантацию канюли в базальных ганглиев и мозжечка подключены к осмотических насосов. Мы описываем индукцию дистонии, как движения с помощью применения двигательного вызова и характеристики фенотипа с помощью поведенческих систем скоринга.

Имплантация Осмотических насосов и индукция стресса для создания симптоматической, фармакологической модели мыши для ДИТ/ПАРК-ATP1A3 Дистония

Genetically modified mouse models face limitations, especially when studying movement disorders, where most of the available transgenic rodent models do ...

Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы описать процедуры, связанные с созданием симптоматической, фармакологической модели мыши для дистонии DYT/PARK-ATP1A3 с помощью канюлей мозга в осмотических насосах и вызывая стресс через сложные двигательные задачи. Этот метод подробно, как установить фармакологическую модель мыши с использованием хронической доставки наркотиков с помощью осмотических насосов для нескольких канюли мозга и как вызвать фенотип через сложные двигательные задачи. Мягкая парадигма моторного стресса также дает представление о роли генно-экологических взаимодействий в двигательных расстройствах и может быть применена к другим моделям грызунов.Эксперименты на животных проводились в соответствии с применимыми национальными и институциональными руководящими принципами по уходу и использованию животных. Начните с подготовки осмотических насосов в стерильной среде. Во-первых, заполните один миллилитр шприц с 27 калибровочных заполнения канюли со стерильным фильтрованным ouabain-решение или раствор транспортного средства.Держите осмотический насос в вертикальном положении, вставьте канюлю полностью в насос и медленно заполняй резервуар до тех пор, пока сверху не появится избыток раствора. Затем вставьте модератор потока в насос. Аккуратно смахните белый фланг модератора потока ножницами и подключите кусок виниловых труб к модератору потока.Погрузим каждый насос в трубы Эппендорфа, заполненные на полпути солевым раствором, и поместите их в термоциклер на 37 градусов, чтобы скорость перекачки достигла стабильного состояния перед началом операции. После того, как животное глубоко обезболилось в соответствии с утвержденными протоколами, поместите животное в стереотаксическую рамку и зафиксните голову резиновыми наконечниками или неразороткими ушными прутьями. После тщательной дезинфекции хирургической области, используйте скальпель, чтобы поместить разрез в верхней части головы и использовать ножницы, чтобы продолжить разрез до конечностей.Выставить череп с помощью бульдога зажимы и протрите периостеум с стерильным хлопчатобумажным аппликатором. Выровнять либо ручку или кончик канюрной окрашены черными чернилами с bregma и использовать соответствующие координаты, чтобы отметить три точки входа для мозга канюли на черепе. Далее тщательно просверлите отверстия для двойного канюляра, предназначенного для базальных ганглиев и одной канюли, предназначенной для мозжечка.Просверлите четвертое отверстие для небольшого винта между стриатумом и мозжечок. Этот винт в конечном итоге будет встроен в зубной цемент и обеспечить дополнительное удержание для канюли. Для того, чтобы создать небольшой карман для осмотического насоса с каждой стороны спины животных, используйте ткани force, чтобы отделить слои подкожной ткани.Заранее типсы к одной задней ноге и открыть миппы немного для того, чтобы расширить подкожный карман. Повторите ту же процедуру для другой стороны, сначала удалив типсы из разреза, а затем толкая их осторожно к второй задней ноге. С помощью типсов тщательно вставьте насосы и подключенный катетер в каждый подкожный карман.Карман должен позволить насосу легко скользить дюйма Используя держатель мини-насоса, ввемите одну осмотическую канюлю с пользовательской длиной 3,0 миллиметра в отверстие, просверленное в средней линии мозжечка. Отсоедините голову канюли тщательно и исправить канюлю, а также небольшой винт с зубным цементом, заботясь, чтобы не покрыть соединительный кусок для трубки осмотического насоса.Убедитесь, что стоматолог цемента, окружающего канюлю полностью высохли, прежде чем продолжить операцию. Перед вставкой двойной канюли в двусторонние пробуренные отверстия над базальными ганглиями прикрепите два 0,5-сантиметровых куска виниловых труб к двум соединительным частям двойной канюли. Соедините виниловые трубки с адаптером бифуркации и тщательно заполните всю трубную систему стерильным раствором уабаина или транспортным средством.Затем повторите те же шаги, что и ранее для одной канюле, и завершите, зафиксировав двойную канюлю зубным цементом. Подключите катетеры осмотических насосов к адаптеру бифуркации, а также к одной канюле соответственно. Оба насоса имеют равную скорость потока, поэтому будьте осторожны, чтобы соединить осмотический насос с двойным концентрированным раствором к адаптеру бифуркации, чтобы гарантировать, что та же концентрация достигает как базальных ганглиев, так и мозжечка.Закройте разрез на спине животных швами, насколько это возможно, не перенапряжение кожи. Подкожно вводят стерильный солевой раствор, который должен иметь температуру тела, чтобы избежать обезвоживания. Удалите животное из стереотаксической рамы и поместите его в клетку восстановления.Для того, чтобы вызвать дистонию, как движения, уабаин проникнуты мышей должны подвергаться сложным задачам двигателя, как мягкий стресс парадигмы через четыре часа после операции и повторяется каждые 24 часа после этого. Это не включает в себя поведенческую характеристику животных. Мы демонстрируем здесь пример транспортного средства проникнуты животных, который помещается на 50 сантиметров грубой поверхности деревянный столб, нос лицом вниз.Обеспечить достаточно постельных принадлежностей у основания полюса в случае падения. Для уабаин проникнуты мышей, животные должны начать представлять первые симптомы, как bradykinesia четыре часа после операции. Тем не менее, через 24 часа после операции, вы должны увидеть непроизвольное гиперэкстензии передних или задних конечностей, как признак дистонии, как движения во время спуска.Мыши должны спуститься полюс три раза, позволяют по крайней мере две минуты восстановления между каждым спуском. Время спуска не нужно измерять. Полюс тест должен сопровождаться второй задачей двигателя, используя вращающийся стержень.Как сделано для теста производительности Rotarod, ouabain и транспортного средства проникнуты мышей из стрессовых групп помещаются на вращающийся стержень. Задержка падения не нуждается в измерении. Как и в предыдущем тесте, мышей следует поместить на вращающийся стержень три раза, что позволяет две минуты восстановления между пробегами.Модифицированная шкала рейтинга дистонии может быть использована для оценки частоты, тяжести и распределения тела дистонии, как движения мышей. Зверей следует поместить в пластиковую или деревянную коробку, а движения следует фиксировать в течение четырех минут. Тариферы должны быть ослеплены групповым заданием.Движения или позы, которые считаются дистонией, как являются непроизвольные гиперэкстензии передних конечностей, широкая позиция, или гиперэкстензия задних конечностей, а также кифоз. Если только одна часть тела влияет, дистония должна рассматриваться в качестве координационного. Если ствол и по крайней мере две другие части тела страдают, дистония должна рассматриваться как обобщенные.Вторая недавно разработанная система скоринга от нуля до восьми баллов, оценивает наличие и тяжесть дистонии, как движения во время теста подвески хвоста. Для теста держите мышь за хвост возле ее основания в течение двух минут. Рекомендуется записать тест подвески хвоста и назначить балл для последующего анализа отснятого материала.Передние конечности набрали от нуля до четырех очков. Повторные или устойчивые опровержения тонизирующего средства одной из передних конечностей, а также гиперэкстензия в сочетании с пересечением передних конечностей забиваются как дистония. Дистония-как движения задних конечностей, что означает опровержение и сжимая, а также устойчивый гиперэкстензии, забиваются от нуля до трех очков.Truncal искажения настоящее более 80% от записанного времени забил с дополнительным пунктом. Задние конечности обхватив является неспецифическим признаком для двигательных нарушений и не должны быть забиты. На этом графике показаны результаты рейтинговой шкалы дистонии.Уабаин проникнуты подчеркнул мышей настоящее время значительно больше дистонии, как движения в течение наблюдательного периода 72 часов, чем не-стресс уабаин проникнуты группы, а также животных транспортного средства. Это изображение изображает результаты теста подвески хвоста и показывает аналогичный результат по шкале рейтинга дистонии. Обратите внимание, что результаты среднего от общего балла каждого животного за каждый момент времени.После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как стереотаксис имплантировать несколько канюли мозга и как подкожно имплантировать осмотические насосы. Основным преимуществом этого метода является то, что повторяющиеся и стрессовые инъекции можно избежать, и что субстрат, как уабаин, который в противном случае будет иметь системные побочные эффекты могут быть непосредственно доставлены в конкретные структуры мозга.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Живая съемка никотина индуцированной сигнализации кальция и высвобождение нейромедиаторов Наряду вентральной гиппокампа Аксоны

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

Имплантация Miniosmotic Насосы и доставка урочище TRACERS по изучению мозга реорганизации в патофизиологических условиях

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

Measurement &amp; Analysis of the Temporal Discrimination Threshold Applied to Cervical Dystonia

Measurement & Analysis of the Temporal Discrimination Threshold Applied to Cervical Dystonia

Измерение и анализ порога временной дискриминации применяется к цервикальной дистонии

The temporal discrimination threshold (TDT) is the shortest time interval at which an observer can discriminate two sequential stimuli as being ...

Monitoring the Effect of Osmotic Stress on Secretory Vesicles and Exocytosis

Мониторинг влияние осмотического стресса на секреторные пузырьки и экзоцитоз

Amperometry recording of cells subjected to osmotic shock show that secretory cells respond to this physical stress by reducing the exocytosis activity ...

Laminectomy and Spinal Cord Window Implantation in the Mouse

Ламинэктомия и имплантация окна спинного мозга в мыши

This protocol describes a method for spinal cord laminectomy and glass window implantation for in vivo imaging of the mouse spinal cord. An integrated ...

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Авторадиографии как простой и мощный метод для визуализации и характеристика фармакологического целей

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

Chronic Implantation of Multiple Flexible Polymer Electrode Arrays

Хроническая имплантация нескольких гибких полимерных электродов

Simultaneous recordings from large populations of individual neurons across distributed brain regions over months to years will enable new avenues of ...

Preparation of Peripheral Nerve Stimulation Electrodes for Chronic Implantation in Rats

Подготовка электродеса стимуляции периферического нерва для хронической имплантации у крыс

Peripheral nerve cuff electrodes have long been used in the neurosciences and related fields for stimulation of, for example, vagus or sciatic nerves. ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Индукция и оценка дискинезий, вызванных леводопой, в крысиной модели болезни Паркинсона

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...