Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af INSERM, Université Côte d'Azur, og ved tilskud fra det franske nationale forskningsagentur (ANR) gennem investeringer for fremtiden Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), programmet UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complexes" og Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587) og Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Vi takker også Imaging Core Facility i C3M, der finansieres af Conseil Départemental des Alpes-Maritimes og Région PACA, og som også støttes af IBISA-mikrokopi- og billedplatformen Côte d'Azur (MICA). Vi takker Marion Dussot for teknisk hjælp i vævspræparat. Vi takker Abby Cuttriss, UCA International Videnskabelig synlighed, for korrekturlæsning af manuskriptet.

Denne protokol blev testet og er valideret for alle mus og humane hvide fedtvæv depoter. Humane og mus fedtvæv blev indsamlet i overensstemmelse hermed til europæisk lovgivning og godkendt af franske og svenske etiske udvalg.
1. Fiksering af mus og humant hvidt fedtvæv
<ol><li>Det høstede mus eller det hvide fedtvæv hos mennesker nedsænkes i mindst 10 ml PBS, der indeholder 4 % paraformaldehyd (PFA), nedsænkes i et 15 ml plastrør.</li>
	<li>Plastrøret rystes ved stuetemperatur på ...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

De ændringer, der opstår inden for fedtvævet i løbet af patologisk progression, såsom fedme, er afgørende for forståelsen af mekanismerne bag patologien. Banebrydende undersøgelser, der afslørede sådanne mekanismer i fedtvæv har været baseret på globale tilgange såsom hele fedtvæv proteomics21, flow cytometri22,23, og transskriptomics24,25. Desuden er der gjort en in...

Fedme er karakteriseret ved en stigning i fedtvæv masse og er blevet et stort verdensomspændende folkesundhedsproblem, da mennesker med fedme har øget risiko for at udvikle hjerte-kar-sygdom, type-2 diabetes, leversygdomme og nogle kræftformer.
En grundlæggende fysiologisk funktion af fedtvæv er at modulere helkropsglukose og lipidhomøostase1,2. I fodringsperioden opbevarer adipocytterne (dvs. de vigtigste celler i fedtvævet) det overskydende glukose og lipider, som et måltid leverer, til triglycerider. Under fastende, adipocytter nedbryde triglycerider i ikke-esterificerede fedtsyrer og glycerol at opretholde energibehovet i kroppen. Under udviklingen af fedme, fedtvæv udvide ved at øge størrelsen (hypertrophia) og / eller antallet (hyperplasi) af adipocytes1, at øge deres lagerkapacitet. Når udvidelsen af fedtvæv når sin grænse, en konstant meget varierende blandt patienter, de resterende lipider ophobes i andre metaboliskeorganer,herunder muskler oglever 3,4, fører til deres funktionelle svigt og indlede fedme-relaterede cardio-metaboliskekomplikationer 1,5. Derfor, identificere de mekanismer, der styrer fedtvæv ekspansion er en vigtig klinisk udfordring.
De morfologiske ændringer dokumenteret i fedtvæv under fedme er knyttet til dens patologiske dysfunktion. Flere farvning procedurer er blevet brugt til at beskrive væv organisation af fedtvæv, herunder actin6, vaskulæremarkører 7, lipid-dråbemarkører 8, og specifikke immuncelle markører9,10. Men på grund af den enorme diameter af adipocytter (50 til 200 μm)11, er det vigtigt at analysere en stor del af hele vævet i tre dimensioner for præcist at analysere de dramatiske strukturelle AT ændringer observeret under fedme. Men da lyset ikke trænger ind i et uigennemsigtigt væv, er billeddannelse i 3D i en stor vævsprøver ved hjælp af fluorescensmikroskopi ikke mulig. Metoder til vævsclearing for at gøre dem gennemsigtige er blevet rapporteret i litteraturen (til gennemgang, se12), så man kan rydde væv og udføre dybdegående, hele vævfluorescensmikroskopi. Disse metoder giver hidtil usete muligheder for at vurdere 3D cellulære organisation i sundt og syge væv. Hver af de beskrevne metoder har fordele og ulemper, og derfor skal nøje vælges afhængigt af det undersøgte væv (for en gennemgang, se13). Nogle metoder kræver faktisk en lang inkubationstid og/eller anvendelse af materialer eller forbindelser , der enten er dyre , giftige eller vanskelige atopnå 14,15,16,17,18,19. Drage fordel af en af de første forbindelser, der anvendes et århundrede siden af Werner Spalteholz at rydde væv20, vi oprettet en brugervenlig og billig protokol, der er meget velegnet til clearing af alle mus og menneskelige fedtvæv depoter i ethvert laboratorium med typisk udstyr, herunder en kemisk hætte, en temperatur-kontrolleret orbital shaker og en konfokal mikroskop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

Fedme er et stort verdensomspændende folkesundhedsproblem, der øger risikoen for at udvikle hjerte-kar-sygdomme, type-2 diabetes, og leversygdomme. Fedme er karakteriseret ved en stigning i fedtvæv (AT) masse på grund af adipocyt hyperplasi og / eller hypertrophia, fører til dybtgående remodeling af sin tre-dimensionelle struktur. Faktisk er AT's maksimale evne til at ekspandere under fedme afgørende for udviklingen af fedme-associerede patologier. Denne AT ekspansion er en vigtig homeostatisk mekanisme til at muliggøre tilpasning til et overskud af energiindtag og for at undgå skadelige lipid spillover til andre metaboliske organer, såsom muskler og lever. Derfor er forståelse af den strukturelle remodeling, der fører til svigt af AT ekspansion et grundlæggende spørgsmål med høj klinisk anvendelighed. I denne artikel beskriver vi en enkel og hurtig clearing metode, der rutinemæssigt anvendes i vores laboratorium til at udforske morfologi af mus og humant hvidt fedtvæv ved fluorescerende billeddannelse. Denne optimerede AT-clearingmetode udføres nemt i ethvert standardlaboratorium, der er udstyret med en kemisk hætte, en temperaturstyret orbitalshaker og et fluorescerende mikroskop. Desuden er de anvendte kemiske forbindelser let tilgængelige. Vigtigere er det, denne metode gør det muligt at løse 3D AT struktur ved farvning forskellige markører til specifikt visualisere adipocytter, neuronal og vaskulære netværk, og den medfødte og adaptive immunceller fordeling.

Ved hjælp af den procedure, der er beskrevet her og opsummeret i figur 1, var vi i stand til at plette og optisk klart humant og mushvidt fedtvæv som beskrevet i henholdsvis figur 2A og figur 2B. Det clearede væv blev overført til det metalliske billeddannelseskammer for at udføre konfokal billeddannelse (figur 3A). Clearingen drastisk forbedret dybden af vævsbilleder, som vi var i stand til at er...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Her beskriver vi en enkel, billig og hurtig clearing metode til at løse 3D-strukturen af både mus og humanhvidt fedtvæv ved hjælp af en kombination af markører til at visualisere vaskulatur, kerner, immunceller, neuroner, og lipid-dråbe pels proteiner ved fluorescerende billeddannelse.

Udforskning af fedtvævsstruktur ved methylsalicylatclearing og 3D-billeddannelse

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Denne protokol tillader analyse af tre-dimensionelle struktur meget store menneskelige på mus fedtvæv ballet mikroskopi. Lette sammenkok af patologisk dysfunktion med fedtvæv strukturelle ændringer. Denne clearing proces er meget enkel, meget godt tilpasset til clearing mennesker på varme mus fedtvæv og bruge mindre giftige opløsningsmiddel såsom ethanol eller methyl salicylat i forhold til andre klare protokoller.Begynd med at nedsænke den høstede mus eller humane hvide fedtvæv i mindst 10 milliliter 4% effekt formaldehyd i PBS i en 15 milliliter plastrør fortrinsvis under en kemisk hætte. Vævet rystes på en rulleplade ved stuetemperatur i en time, før røret overføres til en rulleplade ved fire grader Celsius natten over. Næste morgen skylles det faste hvide fedtvæv i 10 milliliter PBS i fem minutter ved stuetemperatur for at fjerne alle spor af fiksativ og overføre vævet til et 15 milliliterrør indeholdende 10 milliliter 0,3 % glycin i PBS i en times inkubation ved stuetemperatur på en orbitalshaker ved 100 omdrejninger i minuttet.Når de resterende frie aldehydgrupper er blevet slukket, nedsænkes vævet i et 15 milliliterrør indeholdende 10 milliliter 0,2% Triton X-100 i PBS i en to timers inkubation med rystelser ved 37 grader Celsius. Ved slutningen af inkubationen behandles vævet med 10 milliliter på 0,2 % Triton X-100 og 20% DMSO med omrystning ved 37 grader Celsius natten over. Næste morgen nedsænkes vævet i et 15 milliliter plastrør indeholdende 10 milliliter 0,1% Tween 20, 0,1% Triton X-100, 0,1% deoxycholate og 20% DMSO i PBS i mindst 24 timers inkubation ved 37 grader Celsius med rystelser.Ved slutningen af inkubationen skylles vævet med 10 milliliter 0,2% Triton X-100 i PBS på en orbital shaker ved 100 omdrejninger i minuttet i en time. Efterfulgt af nedsænkning i 15 milliliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i 12 timer ved 37 grader Celsius med omrystning. For farvning af det hvide fedtvæv.Vævet overføres til 300 mikroliter på 0,2 % Triton X-100, 10%DMSO og 3%BSA i PBS suppleret med de primære interesseantistoffer i et 1,5 milliliter mikrorør beskytter det mod lys med aluminiumsfolie og placerer røret i et 50 milliliter Falcon-rør. Placer røret i orbital shaker for en to dages inkubation ved 37 grader Celsius med omrystning. Ved slutningen af inkubationen skylles vævet to gange i 10 milliliter 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i fem timer ved 37 grader Celsius med omrystning og beskyttelse mod lys.Efter den anden skylning vaskes vævet i 10 milliliter frisk 0,2 %Triton X-100, 10%DMSO og 3%BSA og PBS i 16 til 48 timer ved 37 grader Celsius med omrystning Derefter overføres vævet til et 1,5 milliliterrør indeholdende 300 mikroliter på 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS, suppleret med de relevante sekundære antistoffer og beskytte røret mod lys ved hjælp af aluminiumsfolie. Efter en to dages inkubation ved 37 grader Celsius på en shaker, vaskes vævet to gange i 10 milliliter 0,2% Triton X-100, 10% DMSO og 3% BSA i PBS i fem timer ved 37 grader Celsius med rystelser beskyttet mod lys. Efter den anden vask skylles vævet i et rør, der indeholder 10 milliliter frisk 0,2 %, Triton X-100, 10%DMSO og 3%BSA i PBS i 16 til 48 timer ved 37 grader Celsius med omrystning og lysbeskyttelse.Efterfulgt af en to timers vask i 10 milliliter PBS alene ved 37 grader Celsius med omrystning og lysbeskyttelse. For vævsrydning af hvidt fedt i slutningen af PBS-vasken nedsænkes vævet og 10 milliliter af en stigende ethanolkoncentrationsserie i en to timers inkubation pr. koncentration ved stuetemperatur med omrystning beskyttet mod lys som angivet. Den næste morgen nedsænkes vævet i en 20 milliliter glasflaske med en plastik hætte indeholdende fem milliliter methyl salicylate i en røghætte.Det hvide fedtvæv er stadig tydeligt på nuværende tidspunkt. Beholderen rystes mod lys ved stuetemperatur i mindst to timer. Den hvide fedtvæv bliver helt transplantation.For 3D konfokale billeddannelse af de farvede og ryddet hvide fedtvæv montere en metallisk billeddannelse kammer udstyret med en glasbund og i en røghætte overføre vævet til kammeret. Fyld kammeret med frisk methylsalicylat. Færdiggøre montering af kammeret ved at tilføje en lille dækning slip for at stabilisere vævet og en stor dækning slip for at lukke kammeret.Placer kammeret på en omvendt konfokal mikroskop fase for væv billeddannelse ved lav forstørrelse til at generere et par kubikcentimeter 3D kort over hele fedtvæv prøve. Efter 3D-kortgenerering skal du bruge et 20x langdistanceluftmål, der giver et godt forhold mellem opløsning og dybde til at vælge flere områder til vævsprøvetagning ved en højere forstørrelse. Til cellesegmentering skal du konvertere 3D-stakke til softwareformatet for at frigøre hukommelse.Før du åbner softwarens cellemodul. Skift indstillingen for celledetektion til plasmamembranfarvning, og vælg fluorescerende kanal for den markør, der bruges til at afgrænse celleperiferiet. Konfigurer derefter tærsklerne, angiv et interval af de forventede cellestørrelser, og kør segmenteringen.De påvirker af clearing på menneskelige og mus hvide fedtvæv kan observeres med det blotte øje. Clearing også drastisk forbedrer billedet dybden af det væv, der er i stand til at blive erhvervet. Og letter hele væv 3D-billedbehandling og 3D-kort generation ud af 4X Forstørrelse.3D-kortlægning gør det yderligere muligt at vælge forskellige interesseområder, der skal erhverves ved en 20X forstørrelse til en dybde på to millimeter. Specifikke farvning af lipid dråber og adipocytter kan opnås ved hjælp af perilipin og anti-GLUT4 antistoffer henholdsvis. Blodkarrene kan påvises ved hjælp af enten CD31 antistof eller intravenøs injektion af Lectin DyLight 649 kort før ofring.Makrofager og T-celler kan visualiseres ved hjælp af anti CD301 phycoerythrin antistof og anti TCR beta Pacific blå antistof. Den perifere nerve netværk kan påvises ved hjælp af anti tyrosin Hydroxylase antistof. Ved hjælp af disse mærkninger den gennemsnitlige størrelse og størrelse fordeling af adipocytter og blodkar netværk tæthed i fedtvæv kan derefter bestemmes.Det er afgørende at følge besættelse tid som påvist, fordi dårlig prøve forberedelse ikke vil resultere i en god billedkvalitet. Denne protokol kan kombineres med avanceret billedbehandlingssystem eller kan kobles til efterbehandling billedanalyse freeware.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO: Biologisk Tissue Clearing og immunolabeling Metoder til Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Forberedelse af prøver og billeddannelse af Exosomes af transmissions Elektron Mikroskopi

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-klar: En væv Clearing metode til tredimensional billeddannelse af fedtvæv

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisering af 3D hvidt fedtvæv struktur ved hjælp af hele-mount farvning

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Optisk rydning af plantevæv til fluorescensbilleddannelse

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Halvautomatisk isolering af den stromale vaskulære fraktion fra murine hvidt fedtvæv ved hjælp af en vævsdissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...