Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door INSERM, Université Côte d'Azur, en door subsidies van het Franse Nationale Onderzoeksagentschap (ANR) via de Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), het programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via Academy 2 "Systèmes Complex academie 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), en het Young Investigator Program naar J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). We danken ook de Imaging Core Facility van C3M gefinancierd door de Conseil Départemental des Alpes-Maritimes en de Région PACA, en die ook wordt ondersteund door het IBISA Microscopie en Imaging Platform Côte d'Azur (MICA). Wij danken Marion Dussot voor technische hulp bij weefselbereiding. Wij danken Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, voor het bewijs lezen van het manuscript.

Dit protocol werd getest en is gevalideerd voor alle muis- en menselijke witte vetweefseldepots. Menselijke en muisvetweefsels werden dienovereenkomstig verzameld aan Europese wetten en goedgekeurd door Franse en Zweedse Ethische commissies.
1. Fixatie van muis en menselijk wit vetweefsel
<ol><li>Dompel de geoogste muis of menselijke witte vetweefsels onder in ten minste 10 mL PBS met 4% paraformaldehyde (PFA) in een plastic buis van 15 mL.</li>
	<li>Schud de plastic buis bij kamertemperatuu...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

De wijzigingen die zich voordoen in het vetweefsel in de loop van pathologische progressie, zoals die van obesitas, is fundamenteel voor het begrip van de mechanismen achter de pathologie. Baanbrekende studies die dergelijke mechanismen in vetweefsel aan het licht brachten, zijn gebaseerd op globale benaderingen zoals gehele vetweefselproteomics21, flow cytometrie22,23en transcriptomics24,<sup class="xref...

Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel massa en is uitgegroeid tot een belangrijke wereldwijde volksgezondheid probleem, gezien het feit dat mensen met obesitas hebben een verhoogd risico op het ontwikkelen van hart-en vaatziekten, type-2 diabetes, leverziekten en sommige vormen van kanker.
Een fundamentele fysiologische functie van vetweefsel is het moduleren van lichaam-lichaam glucose en lipide homeostase1,2. Tijdens de voederperiode slaan de adipocyten (d.w.z. de belangrijkste cellen van het vetweefsel) het teveel aan glucose en lipiden op die door een maaltijd in triglyceriden worden verstrekt. Tijdens het vasten breken de adipocyten de triglyceriden af in niet-gestreelde vetzuren en glycerol om de energievraag van het lichaam te ondersteunen. Tijdens de ontwikkeling van obesitas breidt vetweefsel uit door de grootte (hypertrophia) en/of het aantal (hyperplasie) van adipocyten1te vergroten, om hun opslagcapaciteit te vergroten. Wanneer de expansie van vetweefsel zijn limiet bereikt, een constante zeer variabele bij patiënten, de resterende lipiden accumuleert in andere metabole organen, waaronder spieren en lever3,4, wat leidt tot hun functionele falen en het initiëren van obesitas-gerelateerde cardio-metabole complicaties1,5. Daarom is het identificeren van de mechanismen die de expansie van vetweefsel regelen een belangrijke klinische uitdaging.
De morfologische modificaties gedocumenteerd in vetweefsels tijdens obesitas zijn gekoppeld aan zijn pathologische disfunctie. Verschillende kleuringsprocedures zijn gebruikt om de weefselorganisatie van het vetweefsel te beschrijven, waaronder actine6, vasculaire markers7, lipidedruppelmarkers8en specifieke immuuncelmarkers9,10. Vanwege de enorme diameter van adipocyten (50 tot 200 μm)11is het echter essentieel om een groot deel van het hele weefsel in drie dimensies te analyseren om de dramatische structurele AT-veranderingen die tijdens obesitas worden waargenomen, nauwkeurig te analyseren. Omdat het licht echter geen ondoorzichtig weefsel binnendringt, is beeldvorming in 3D binnen een groot weefselmonster met behulp van fluorescentiemicroscopie niet mogelijk. Methoden van weefselclearing om ze transparant te maken zijn gemeld in de literatuur (voor een onderzoek, zie12) waardoor men weefsels kan wissen en diepgaande, hele weefselfluorescentiemicroscopie kan uitvoeren. Deze methoden bieden ongekende mogelijkheden om de 3D cellulaire organisatie in gezond en ziek weefsel te beoordelen. Elk van de beschreven methoden hebben voor- en nadelen en moet daarom zorgvuldig worden geselecteerd, afhankelijk van het bestudeerde weefsel (zie13). Sommige benaderingen vereisen immers een lange incubatietijd en/of het gebruik van materialen of verbindingen die duur, giftig of moeilijk te verkrijgen zijn14,15,16,17,18,19. Profiterend van een van de eerste verbindingen die werner Spalteholz een eeuw geleden gebruikte om weefsels20te wissen, hebben we een gebruiksvriendelijk en goedkoop protocol opgezet dat zeer goed is aangepast voor het opruimen van alle muis- en menselijke vetweefseldepots in elk laboratorium met typische apparatuur, waaronder een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een confocale microscoop.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

Obesitas is een belangrijk wereldwijd probleem op het gebied van de volksgezondheid dat het risico op het ontwikkelen van hart- en vaatziekten, diabetes type-2 en leverziekten verhoogt. Obesitas wordt gekenmerkt door een toename van vetweefsel (AT) massa als gevolg van adipocyte hyperplasie en / of hypertrophia, wat leidt tot een grondige verbouwing van de driedimensionale structuur. Inderdaad, de maximale capaciteit van AT om uit te breiden tijdens obesitas is cruciaal voor de ontwikkeling van obesitas-geassocieerde pathologieën. Deze AT-expansie is een belangrijk homeostatisch mechanisme om aanpassing aan een overmaat aan energie-inname mogelijk te maken en om schadelijke lipide-overloop naar andere metabole organen, zoals spieren en lever, te voorkomen. Daarom is het begrijpen van de structurele verbouwing die leidt tot het falen van AT-expansie een fundamentele vraag met een hoge klinische toepasbaarheid. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige en snelle clearingmethode die routinematig wordt gebruikt in ons laboratorium om de morfologie van muis en menselijk wit vetweefsel te verkennen door fluorescerende beeldvorming. Deze geoptimaliseerde AT clearing methode is gemakkelijk uit te voeren in elk standaard laboratorium uitgerust met een chemische kap, een temperatuurgecontroleerde orbitale shaker en een fluorescerende microscoop. Bovendien zijn de gebruikte chemische verbindingen direct beschikbaar. Belangrijk is dat deze methode het mogelijk maakt om de 3D AT-structuur op te lossen door verschillende markers te bevlekken om specifiek de adipocyten, de neuronale en vasculaire netwerken en de aangeboren en adaptieve immuuncellenverdeling te visualiseren.

Met behulp van de procedure hier beschreven en samengevat in figuur 1, waren we in staat om vlekken en optisch duidelijk menselijke en muis wit vetweefsel zoals gepresenteerd in figuur 2A en figuur 2B, respectievelijk. Het gerooide weefsel werd overgebracht naar de metalen beeldkamer om confocale beeldvorming uit te voeren(figuur 3A). De clearing drastisch verbeterd de diepte van het weefsel beelden die...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Hier beschrijven we een eenvoudige, goedkope en snelle clearing methode om de 3D-structuur van zowel muis- als menselijk wit vetweefsel op te lossen met behulp van een combinatie van markers om vasculatuur, kernen, immuuncellen, neuronen en lipidedruppelcoateiwitten te visualiseren door fluorescerende beeldvorming.

Het verkennen van vetweefselstructuur door methylsalicylaatcle clearing en 3D-beeldvorming

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Dit protocol maakt analyse van driedimensionale structuur van Zeer grote mens op muis vetweefsel ballet microscopie. Het vergemakkelijken van de koppeling van pathologische disfunctie met vetweefsel structurele veranderingen. Dit clearing proces zijn zeer eenvoudig, zeer goed aangepast aan het opruimen van de mens op warme muizen vetweefsel en gebruik minder giftig oplosmiddel zoals ethanol of methyyl salicylaat in vergelijking met andere duidelijke protocollen.Begin met het onderdompelen van de geoogste muis of menselijk wit vetweefsel in ten minste 10 milliliter van 4%power formaldehyde in PBS in een 15 milliliter plastic buis bij voorkeur onder een chemische kap. Schud het weefsel op een rolplaat op kamertemperatuur gedurende een uur voordat u de buis 's nachts overzet naar een rolplaat bij vier graden Celsius. Spoel de volgende ochtend het vaste witte vetweefsel in 10 milliliter PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur om alle sporen van fixatief te verwijderen en breng het weefsel over op een buis van 15 milliliter met 10 milliliter van 0,3%glycine in PBS voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker bij 100 omwentelingen per minuut.Wanneer de resterende vrije aldehyde groepen zijn geblust, dompel het weefsel in een 15 milliliter buis met 10 milliliter van 0,2%Triton X-100 in PBS voor een twee uur durende incubatie met schudden op 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie behandel het weefsel met 10 milliliter van 0,2%Triton X-100 en 20%DMSO met schudden bij 37 graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend dompel het weefsel onder in een 15 milliliter plastic buis met 10 milliliter van 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1%deoxycholaat en 20%DMSO in PBS voor een minstens 24 uur durende incubatie bij 37 graden Celsius met schudden.Aan het einde van de incubatie, spoel het weefsel met 10 milliliter van 0,2%Triton X-100 in PBS op een orbitale shaker op 100 omwentelingen per minuut gedurende een uur. Gevolgd door onderdompeling in 15 milliliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3% BSA in PBS gedurende 12 uur bij 37 graden Celsius met schudden. Voor het beitsen van het witte vetweefsel.Breng het weefsel over in 300 microliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS, aangevuld met de primaire antilichamen van belang in een 1,5 milliliter microbuis beschermen tegen licht met aluminiumfolie en plaats de buis in een 50 milliliter Falcon buis. Plaats de buis in de orbitale shaker voor een twee daagse incubatie op 37 graden Celsius met schudden. Aan het einde van de incubatie spoel het weefsel twee keer in 10 milliliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius met schudden en bescherming tegen licht.Na de tweede spoeling was het weefsel in 10 milliliter verse 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA en PBS gedurende 16 tot 48 uur bij 37 graden Celsius bij schudden, breng het weefsel vervolgens over naar een buis van 1,5 milliliter met 300 microliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS, aangevuld met de juiste secundaire antilichamen en beschermt de buis tegen lichtaluminiumfolie. Na een tweedaagse incubatie bij 37 graden Celsius op een shaker, was het weefsel twee keer in 10 milliliter van 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS gedurende vijf uur bij 37 graden Celsius met schudden beschermd tegen licht. Na de tweede wasbeurt spoel je het weefsel in een buis met 10 milliliter verse 0,2%Triton X-100, 10%DMSO en 3%BSA in PBS gedurende 16 tot 48 uur bij 37 graden Celsius met schudden en lichte bescherming.Gevolgd door een twee uur wassen in 10 milliliter PBS alleen op 37 graden Celsius met schudden en licht bescherming. Voor witte vetweefsel clearing aan het einde van de PBS wassen dompel het weefsel en 10 milliliter van een stijgende verzendende ethanol concentratie serie voor een twee uur incubatie per concentratie bij kamertemperatuur met schudden beschermd tegen licht zoals aangegeven. De volgende ochtend dompel het weefsel onder in een 20 milliliter glazen fles met een plastic dop met vijf milliliter methyylzilcylaat in een rookkap.Het witte vetweefsel is nog steeds duidelijk zichtbaar in dit stadium. Schud de container gedurende ten minste twee uur tegen licht bij kamertemperatuur. Het witte vetweefsel wordt volledig transplantatie.Voor 3D confocale beeldvorming van het glas-in-lood- en wit vetweefsel monteer een metalen beeldkamer uitgerust met een glazen bodem en in een rookkap breng het weefsel naar de kamer. Vul de kamer met verse methyylsalcylaat. Rond de montage van de kamer af door een kleine afdekbrief toe te voegen om het weefsel te stabiliseren en een grote afdekkingslip om de kamer te sluiten.Plaats de kamer op een omgekeerde confocale microscoop stadium voor weefsel beeldvorming bij lage vergroting tot een paar kubieke centimeter 3D-kaarten van het hele vetweefsel monster te genereren. Gebruik na het genereren van 3D-kaarten een 20X lange afstandsluchtdoelstelling die een goede verhouding biedt tussen de resolutie en diepte om verschillende gebieden te selecteren voor weefselbemonstering bij een hogere vergroting. Voor celsegmentatie converteren 3D-stacks naar de software-indeling om geheugenruimte vrij te maken.Voordat u de celmodule van de software opent. Wijzig de celdetectie-instelling in plasmamembraankenkening en selecteer het fluorescerende kanaal van de marker die wordt gebruikt om de celperiferie af te bakenen. Stel vervolgens de drempelwaarden in, geef een bereik van de verwachte celformaten en voer de segmentatie uit.De invloed van clearing op menselijke en muis wit vetweefsel kan worden waargenomen met het blote oog. Clearing verbetert ook drastisch de beelddiepte van het weefsel dat kan worden verworven. En vergemakkelijkt hele weefsel 3D-beeldvorming en 3D-kaart generatie uit 4X Vergroting.3D mapping maakt het verder mogelijk om verschillende interessegebieden te selecteren bij een vergroting van 20x tot een diepte van twee millimeter. Specifieke kleuring van lipidedruppels en adipocyten kan worden bereikt met behulp van perilipin en anti-GLUT4 antilichamen respectievelijk. Bloedvaten kunnen worden gedetecteerd met behulp van cd31-antilichaam of intraveneuze injectie van Lectin DyLight 649 kort voor het offer.Macrofagen en T-cellen kunnen worden gevisualiseerd met behulp van anti CD301 phycoerythrin antilichaam en anti TCR beta Pacific blauwe antilichaam. Het perifere zenuwnetwerk kan worden gedetecteerd met behulp van anti Tyrosine Hydroxylase antilichaam. Met behulp van deze etiketteringen kan dan de gemiddelde grootte en grootteverdeling van de adipocyten en de dichtheid van het bloedvatnetwerk in het vetweefsel worden bepaald.Het is cruciaal om de bezettingstijd te volgen, zoals aangetoond, omdat een slechte monstervoorbereiding niet zal resulteren in een goede beeldkwaliteit. Dit protocol kan worden gecombineerd met geavanceerde imaging systeem of kan worden gekoppeld aan post-processing image analyse freeware.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Bereiding van de monsters en de beeldvorming van de Exosomes door transmissie-elektronenmicroscopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Een weefsel Clearing methode voor driedimensionale beeldvorming van vetweefsel

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisatie van 3D witte adipeus weefsel structuur met behulp van geheel-mount kleuring

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Optische clearing van plantenweefsels voor fluorescentiebeeldvorming

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Semi-geautomatiseerde isolatie van de stromale vasculaire fractie uit muizenwit vetweefsel met behulp van een weefseldissociator

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...