Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par l’INSERM, Université Côte d’Azur, et grâce à des subventions de l’Agence nationale de la recherche Français (ANR) par le biais des Investissements pour le futur Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), le programme UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via l’Académie 2 « Systèmes Complexes » et l’Académie 4 « Complexité et diversité du vivant », Fondation pour la Recherche Médicale (Équipe FRM DEQ20180839587) et programme des jeunes chercheurs à J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Nous remercions également le Centre d’imagerie de C3M financé par le Conseil Départemental des Alpes-Maritimes et la Région PACA, et qui est également soutenu par la Plate-forme de microscopie et d’imagerie IBISA Côte d’Azur (MICA). Nous remercions Marion Dussot pour son aide technique dans la préparation des tissus. Nous remercions Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, pour la lecture de la preuve du manuscrit.

Ce protocole a été testé et est validé pour tous les dépôts de tissus adipeux blancs et de souris. Les tissus adipeux humains et murins ont été recueillis en conséquence aux lois européennes et approuvés par les comités d’éthique Français et suédois.
1. Fixation de la souris et du tissu adipeux blanc humain
<ol><li>Immerger la souris récoltée ou les tissus adipeux blancs humains dans au moins 10 ml de PBS contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tube en plastique de...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

Les modifications qui se produisent dans le tissu adipeux au cours de la progression pathologique, comme celle de l’obésité, est fondamentale pour la compréhension des mécanismes derrière la pathologie. Des études pionnières qui ont révélé de tels mécanismes dans les tissus adipeux ont été basées sur des approches globales telles que la protéomique tissulaire adipeuse entière21, cytométrie de flux22,23, et transcriptomic...

L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse tissulaire adipeuse et est devenue un problème majeur de santé publique dans le monde entier, étant donné que les personnes souffrant d’obésité ont un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, les maladies du foie et certains cancers.
Une fonction physiologique fondamentale du tissu adipeux est de moduler l’homéostasie du glucose entier du corps et des lipides1,2. Pendant la période d’alimentation, les adipocytes (c.-à-d. les principales cellules du tissu adipeux) stockent l’excès de glucose et de lipides fournis par un repas dans les triglycérides. Pendant le jeûne, les adipocytes décomposent les triglycérides en acides gras non estérifiés et en glycérol pour soutenir la demande énergétique du corps. Pendant le développement de l’obésité, les tissus adipeux se développent en augmentant la taille (hypertrophie) et/ou le nombre (hyperplasie) des adipocytes1,pour augmenter leur capacité de stockage. Lorsque l’expansion du tissu adipeux atteint sa limite, une constante très variable chez les patients, les lipides restants s’accumulent dans d’autres organes métaboliques, y compris les muscles et le foie3,4, conduisant à leur échec fonctionnel et l’initiation de l’obésité liées complications cardio-métaboliques1,5. Par conséquent, l’identification des mécanismes qui régissent l’expansion des tissus adipeux est un défi clinique clé.
Les modifications morphologiques documentées dans les tissus adipeux pendant l’obésité sont liées à son dysfonctionnement pathologique. Plusieurs procédures de coloration ont été utilisées pour décrire l’organisation tissulaire du tissu adipeux, y compris l’actine6, les marqueurs vasculaires7, les marqueurs de gouttelettes de lipides8, et les marqueurs spécifiques de cellules immunitaires9,10. Cependant, en raison de l’énorme diamètre des adipocytes (50 à 200 μm)11, il est essentiel d’analyser une grande partie du tissu entier en trois dimensions afin d’analyser avec précision les changements structurels dramatiques AT observés pendant l’obésité. Cependant, comme la lumière ne pénètre pas dans un tissu opaque, l’imagerie en 3D à l’intérieur d’un grand échantillon de tissus utilisant la microscopie par fluorescence n’est pas possible. Des méthodes de compensation des tissus pour les rendre transparentes ont été rapportées dans la littérature (pour un examen, voir12)permettant de dégager des tissus et d’effectuer en profondeur, la microscopie de fluorescence de tissu entier. Ces méthodes offrent des occasions sans précédent d’évaluer l’organisation cellulaire 3D dans les tissus sains et malades. Chacune des méthodes décrites présente des avantages et des inconvénients et doit donc être soigneusement sélectionnée en fonction du tissu étudié (pour un examen, voir13). En effet, certaines approches nécessitent une longue période d’incubation et/ou l’utilisation de matériaux ou de composés coûteux, toxiques ou difficiles à obtenir14,,15,16,17,18,19. Profitant de l’un des premiers composés utilisés il y a un siècle par Werner Spalteholz pour dégager les tissus20,nous avons mis en place un protocole convivial et peu coûteux qui est très bien adapté pour le nettoyage de tous les dépôts de tissus adipeux souris et humains dans n’importe quel laboratoire avec un équipement typique, y compris une hotte chimique, un shaker à température contrôlée et un microscope confocal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

L’obésité est un problème majeur de santé publique dans le monde entier qui augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2 et des maladies du foie. L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse de tissu adipeux (AT) due à l’hyperplasie d’adipocyte et/ou à l’hypertrophie, menant au remodelage profond de sa structure tridimensionnelle. En effet, la capacité maximale d’AT à se développer pendant l’obésité est essentielle au développement des pathologies associées à l’obésité. Cette expansion AT est un mécanisme homéostatique important pour permettre l’adaptation à un excès d’apport énergétique et pour éviter les retombées délétères lipidiques à d’autres organes métaboliques, tels que les muscles et le foie. Par conséquent, la compréhension du remodelage structurel qui conduit à l’échec de l’expansion AT est une question fondamentale avec une applicabilité clinique élevée. Dans cet article, nous décrivons une méthode de compensation simple et rapide qui est couramment utilisée dans notre laboratoire pour explorer la morphologie de la souris et du tissu adipeux blanc humain par imagerie fluorescente. Cette méthode de compensation AT optimisée est facilement réalisée dans n’importe quel laboratoire standard équipé d’une hotte chimique, d’un shaker orbital à température contrôlée et d’un microscope fluorescent. De plus, les composés chimiques utilisés sont facilement disponibles. Fait important, cette méthode permet de résoudre la structure 3D AT en tachant divers marqueurs pour visualiser spécifiquement les adipocytes, les réseaux neuronaux et vasculaires, et la distribution innée et adaptative des cellules immunitaires.

En utilisant la procédure décrite ici et résumée à la figure 1, nous avons été en mesure de tacher et optiquement clair l’homme et la souris blanc tissu adipeux tel que présenté à la figure 2A et figure 2B, respectivement. Le tissu effacé a été transféré à la chambre d’imagerie métallique pour effectuer l’imagerie confocale (figure 3A). La compensation a considérablement amélior...

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Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Ici, nous décrivons une méthode simple, peu coûteuse et rapide de compensation pour résoudre la structure 3D de la souris et du tissu adipeux blanc humain en utilisant une combinaison de marqueurs pour visualiser la vascularisation, les noyaux, les cellules immunitaires, les neurones, et les protéines de couche de lipide-goutte par imagerie fluorescente.

Exploration de la structure des tissus adipeux par compensation du méthylsalicylate et imagerie 3D

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Ces protocoles permettent l’analyse de la structure tridimensionnelle de très grand humain sur la souris adipeux tissu ballet microscopie. Faciliter le lien entre le dysfonctionnement pathologique et les changements structurels des tissus adipeux. Ce processus de compensation est très simple, très bien adapté pour éliminer l’homme sur les souris chaudes tissus adipeux et utiliser des solvants moins toxiques tels que l’éthanol ou le salicylate méthylique par rapport à d’autres protocoles clairs.Commencez par immerger la souris récoltée ou le tissu adipeux blanc humain dans au moins 10 millilitres de formaldéhyde de 4% de puissance dans PBS dans un tube en plastique de 15 millilitres de préférence sous un capot chimique. Secouez le tissu sur une plaque roulante à température ambiante pendant une heure avant de transférer le tube dans une plaque roulante à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin rincer le tissu adipeux blanc fixe dans 10 millilitres de PBS pendant cinq minutes à température ambiante pour enlever toutes les traces de fixatif et transférer le tissu à un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de 0,3% glycine dans PBS pour une incubation d’une heure à température ambiante sur un shaker orbital à 100 révolutions par minute.Lorsque les autres groupes d’aldéhyde libre ont été trempés, immerger le tissu dans un tube de 15 millilitres contenant 10 millilitres de 0,2%Triton X-100 dans PBS pour une incubation de deux heures avec secousses à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation traiter le tissu avec 10 millilitres de 0,2%Triton X-100 et 20%DMSO avec secouant à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, immerger le tissu dans un tube en plastique de 15 millilitres contenant 10 millilitres de 0,1%Tween 20, 0,1%Triton X-100, 0,1% désoxycholate et 20%DMSO en PBS pour une incubation d’au moins 24 heures à 37 degrés Celsius avec secousses.À la fin de l’incubation, rincer le tissu avec 10 millilitres de 0,2%Triton X-100 en PBS sur un shaker orbital à 100 révolutions par minute pendant une heure. Suivi d’une immersion de 15 millilitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS pendant 12 heures à 37 degrés Celsius avec secousses. Pour la coloration du tissu adipeux blanc.Transférer le tissu en 300 microlitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS, complétés par les principaux anticorps d’intérêt dans un micro tube de 1,5 millilitre le protéger de la lumière avec du papier d’aluminium et placer le tube dans un tube Falcon de 50 millilitres. Placez le tube dans le shaker orbital pendant une incubation de deux jours à 37 degrés Celsius avec des secousses. À la fin de l’incubation rincer le tissu deux fois en 10 millilitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS pendant cinq heures à 37 degrés Celsius avec secousses et protection contre la lumière.Après le deuxième rinçage laver les tissus en 10 millilitres de frais 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA et PBS pendant 16 à 48 heures à 37 degrés Celsius avec secousse, puis transférer le tissu à un tube de 1,5 millilitre contenant 300 microlitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA dans PBS, complétée par les anticorps secondaires appropriés et protéger le tube de la lumière à l’aide de papier d’aluminium. Après une incubation de deux jours à 37 degrés Celsius sur un shaker, laver le tissu deux fois en 10 millilitres de 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS pendant cinq heures à 37 degrés Celsius avec secousses protégées de la lumière. Après le deuxième lavage, rincer le tissu dans un tube contenant 10 millilitres de frais 0,2%Triton X-100, 10%DMSO et 3%BSA en PBS pendant 16 à 48 heures à 37 degrés Celsius avec secousses et protection contre la lumière.Suivi d’un lavage de deux heures dans 10 millilitres de PBS seul à 37 degrés Celsius avec secousses et protection contre la lumière. Pour le nettoyage des tissus adipeux blancs à la fin du lavage PBS immerger le tissu et 10 millilitres d’une série ascendante de concentration d’éthanol d’envoi pour une incubation de deux heures par concentration à température ambiante avec des secousses protégées de la lumière comme indiqué. Le lendemain matin, plongez le tissu dans une bouteille en verre de 20 millilitres avec un bouchon en plastique contenant cinq millilitres de salicylate méthyle dans une hotte de fumée.Le tissu adipeux blanc est encore clairement visible à ce stade. Secouez le récipient pour le protéger de la lumière à température ambiante pendant au moins deux heures. Le tissu adipeux blanc devient complètement transplanté.Pour l’imagerie confocale 3D du tissu adipeux blanc taché et déblayé monter une chambre d’imagerie métallique équipée d’un fond de verre et dans une hotte de fumée transférer le tissu à la chambre. Remplissez la chambre de salicylate méthylique frais. Finaliser le montage de la chambre en ajoutant un petit glissement de couverture pour stabiliser le tissu et un grand glissement de couverture pour fermer la chambre.Placez la chambre sur un stade de microscope confocal inversé pour l’imagerie tissulaire à faible grossissement pour générer quelques cartes 3D centimètre cube de l’échantillon de tissu adipeux entier. Après la génération de cartes 3D, utilisez un objectif aérien interurbain de 20 X qui fournit un bon rapport entre la résolution et la profondeur pour sélectionner plusieurs zones pour l’échantillonnage des tissus à un grossissement plus élevé. Pour la segmentation cellulaire convertir les piles 3D sur le format logiciel pour libérer de l’espace mémoire.Avant d’ouvrir le module cellulaire du logiciel. Modifiez le réglage de détection cellulaire en colorant la membrane plasmatique et sélectionnez le canal fluorescent du marqueur utilisé pour délimifier la périphérie cellulaire. Ensuite, définissez les seuils, fournissez une plage des tailles de cellules attendues et exécutez la segmentation.Les effets de la compensation sur le tissu adipeux blanc humain et de souris peuvent être observés à l’œil nu. La compensation améliore également considérablement la profondeur d’image du tissu qui est capable d’être acquise. Et facilite l’imagerie 3D des tissus entiers et la génération de cartes 3D à partir du grossissement 4X.La cartographie 3D permet en outre d’acquérir la sélection de différentes zones d’intérêt à un grossissement 20X à une profondeur de deux millimètres. La coloration spécifique des gouttelettes lipidiques et des adipocytes peut être obtenue en utilisant respectivement des anticorps perilipins et anti-GLUT4. Les vaisseaux sanguins peuvent être détectés à l’aide d’anticorps CD31 ou d’injection intraveineuse de Lectin DyLight 649 peu de temps avant le sacrifice.Les macrophages et les lymphocytes T peuvent être visualisés à l’aide d’anticorps anti CD301 phycoerythrine et d’anticorps bleu bêta-Pacifique anti TCR. Le réseau nerveux périphérique peut être détecté à l’aide de l’anticorps anti tyrosine Hydroxylase. À l’aide de ces étiquetages, la taille moyenne et la répartition de la taille des adipocytes et la densité du réseau des vaisseaux sanguins dans le tissu adipeux peuvent ensuite être déterminées.Il est crucial de suivre le temps d’occupation tel que démontré parce qu’une mauvaise préparation de l’échantillon n’entraînera pas une bonne qualité d’image. Ce protocole peut être combiné avec un système d’imagerie avancé ou peut être couplé à l’analyse d’image post-traitement freeware.

Research

JoVE Journal

Biology

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