Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von INSERM, Université Céte d'Azur, und durch Stipendien der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR) über die Investitionen für die Zukunft Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), das Programm UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) über Academy 2 "Systémes Complexes" und Academy 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Equipe FRM DEQ20180839587) und das Young Investigator Program to J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON ). Wir danken auch der Imaging Core Facility von C3M, die vom Conseil Départemental des Alpes-Maritimes und der Région PACA finanziert wird und die auch von der IBISA-Plattform für Mikroskopie und Bildgebungsplattform Céte d'Azur (MICA) unterstützt wird. Wir danken Marion Dussot für die technische Hilfe bei der Gewebeaufbereitung. Wir danken Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, für die beweissichere Lektüre des Manuskripts.

Dieses Protokoll wurde getestet und ist für alle Maus- und menschlichen weißen Fettgewebedepots validiert. Mensch und Maus fettgewebe wurden entsprechend den europäischen Gesetzen gesammelt und von französischen und schwedischen Ethik-Ausschüssen genehmigt.
1. Fixierung von Maus und menschlichem weißem Fettgewebe
<ol><li>Tauchen Sie die geernteten Maus- oder menschlichen weißen Fettgewebe in mindestens 10 ml PBS ein, die 4% Paraformaldehyd (PFA) in einem 15 ml Kunststoffrohr enthalten...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. 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T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

Die Veränderungen, die im Verlauf des pathologischen Verlaufs des Fettgewebes auftreten, wie die von Adipositas, sind für das Verständnis der Mechanismen hinter der Pathologie von grundlegender Bedeutung. Wegweisende Studien, die solche Mechanismen im Fettgewebe aufdeckten, basierten auf globalen Ansätzen wie der gesamten Fettgewebeproteomik21, der Durchflusszytometrie22,23und der Transkriptomik24,<su...

Adipositas ist durch eine Zunahme der Fettgewebemasse gekennzeichnet und hat sich zu einem wichtigen weltweiten Problem der öffentlichen Gesundheit entwickelt, da Menschen mit Adipositas ein erhöhtes Risiko haben, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes, Lebererkrankungen und einige Krebsarten zu entwickeln.
Eine grundlegende physiologische Funktion des Fettgewebes ist es, Ganzkörperglukose und Lipidhomöostase1,2zu modulieren. Während der Fütterungszeit speichern die Adipozyten (d. h. die Hauptzellen des Fettgewebes) den Überschuss an Glukose und Lipiden, die durch eine Mahlzeit in Triglyceride bereitgestellt werden. Während des Fastens brechen die Adipozyten die Triglyceride in nicht veresterte Fettsäuren und Glycerin auf, um den Energiebedarf des Körpers zu decken. Während der Entwicklung von Adipositas, Fettgewebe erweitern, indem sie die Größe (Hypertrophe) und/oder die Anzahl (Hyperplasie) der Adipozyten1, um ihre Speicherkapazität zu erhöhen. Wenn die Ausdehnung des Fettgewebes an seine Grenze stößt, eine konstante, sehr variable unter den Patienten, akkumulieren sich die verbleibenden Lipide in anderen Stoffwechselorganen einschließlich Muskeln und Leber3,4, was zu ihrem funktionellen Versagen führt und adipositasbedingte kardiometabolische Komplikationen einleitet1,5. Daher ist die Identifizierung der Mechanismen, die die Fettgewebeexpansion steuern, eine zentrale klinische Herausforderung.
Die morphologischen Veränderungen, die während der Fettleibigkeit in Fettgewebe dokumentiert werden, sind mit seiner pathologischen Dysfunktion verbunden. Mehrere Färbungsverfahren wurden verwendet, um die Gewebeorganisation des Fettgewebes zu beschreiben, einschließlich Actin6, Gefäßmarker7, Lipid-Tröpfchen-Marker8, und spezifische Immunzellmarker9,10. Aufgrund des enormen Durchmessers von Adipozyten (50 bis 200 m)11ist es jedoch wichtig, einen großen Teil des gesamten Gewebes in drei Dimensionen zu analysieren, um die dramatischen strukturellen AT-Veränderungen, die während Adipositas beobachtet wurden, genau zu analysieren. Da das Licht jedoch nicht in ein undurchsichtiges Gewebe eindringt, ist eine Bildgebung in 3D innerhalb einer großen Gewebeprobe mittels Fluoreszenzmikroskopie nicht möglich. Methoden der Geweberäumung, um sie transparent zu machen, wurden in der Literatur berichtet (für eine Überprüfung, siehe12), die es einem ermöglichen, Gewebe zu löschen und eine gründliche, ganzgewebte Fluoreszenzmikroskopie durchzuführen. Diese Methoden bieten beispiellose Möglichkeiten, die 3D-Zellorganisation in gesundem und krankem Gewebe zu bewerten. Jede der beschriebenen Methoden hat Vor- und Nachteile und muss daher je nach untersuchtem Gewebe sorgfältig ausgewählt werden (für eine Überprüfung siehe13). In der Tat erfordern einige Ansätze eine lange Inkubationszeit und/oder die Verwendung von Materialien oder Verbindungen, die entweder teuer, toxisch oder schwer zu erhalten sind14,,15,16,17,18,19. Unter Ausnutzung einer der ersten Verbindungen, die Werner Spalteholz vor einem Jahrhundert zur Reinigung von Geweben20verwendet hat, haben wir ein benutzerfreundliches und kostengünstiges Protokoll eingerichtet, das sehr gut für die Räumung aller Maus- und menschlichen Fettgewebedepots in jedem Labor mit typischen Geräten wie einer chemischen Haube, einem temperaturgeregelten Orbitalshaker und einem konfokalen Mikroskop geeignet ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

Adipositas ist ein weltweit wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit, das das Risiko erhöht, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Typ-2-Diabetes und Lebererkrankungen zu entwickeln. Adipositas ist durch eine Zunahme der Fettgewebemasse (AT) aufgrund von Adipozytenhyperplasie und/oder Hypertrophie gekennzeichnet, was zu einer tiefgreifenden Umgestaltung seiner dreidimensionalen Struktur führt. Tatsächlich ist die maximale Fähigkeit von AT, während Adipositas zu expandieren, von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Adipositas-assoziierten Pathologien. Diese AT-Erweiterung ist ein wichtiger homöostatischer Mechanismus, um die Anpassung an einen Überschuss an Energiezufuhr zu ermöglichen und schädliche Lipid-Spillover auf andere Stoffwechselorgane wie Muskel und Leber zu vermeiden. Daher ist das Verständnis der strukturellen Umgestaltung, die zum Scheitern der AT-Erweiterung führt, eine grundlegende Frage mit hoher klinischer Anwendbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache und schnelle Clearing-Methode, die routinemäßig in unserem Labor verwendet wird, um die Morphologie von Maus und menschlichem weiß fettem Gewebe durch fluoreszierende Bildgebung zu erforschen. Diese optimierte AT-Clearing-Methode wird problemlos in jedem Standardlabor durchgeführt, das mit einer chemischen Haube, einem temperaturgeregelten Orbitalshaker und einem Fluoreszenzmikroskop ausgestattet ist. Darüber hinaus sind die verwendeten chemischen Verbindungen leicht verfügbar. Wichtig ist, dass diese Methode es ermöglicht, die 3D-AT-Struktur aufzulösen, indem verschiedene Marker gefärbt werden, um die Adipozyten, die neuronalen und vaskulären Netzwerke sowie die angeborene und adaptive Immunzellenverteilung gezielt zu visualisieren.

Mit dem hier beschriebenen und in Abbildung 1zusammengefassten Verfahren konnten wir weißes Fettgewebe von Mensch und Maus färben und optisch klarmachen, wie in Abbildung 2A bzw. Abbildung 2Bdargestellt. Das gereinigte Gewebe wurde in die metallische Bildgebungskammer übertragen, um eine konfokale Bildgebung durchzuführen (Abbildung 3A). Die Lichtung hat die Tiefe der Gewebebilder, die wir erfassen ...

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Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

Hier beschreiben wir eine einfache, kostengünstige und schnelle Clearing-Methode, um die 3D-Struktur von Maus- und menschlichem weiß-fettgewebe mithilfe einer Kombination von Markern zu lösen, um Vaskulatur, Kerne, Immunzellen, Neuronen und Lipid-Tröpfchen-Beschichtungsproteine durch fluoreszierende Bildgebung zu visualisieren.

Untersuchung der Adipose-Gewebestruktur durch Methylsalicylat-Clearing und 3D-Bildgebung

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der dreidimensionalen Struktur von Sehr großen menschlichen auf Maus Fettgewebe Ballettmikroskopie. Erleichterung der Verbindung von pathologischer Dysfunktion mit Fettgewebe strukturelle Veränderungen. Dieser Clearing-Prozess ist sehr einfach, sehr gut geeignet, um menschliche auf warmen Mäusen Fettgewebe zu löschen und weniger toxische Lösungsmittel wie Ethanol oder Methylsalicylat im Vergleich zu anderen klaren Protokollen verwenden.Beginnen Sie damit, die geerntete Maus oder das menschliche weiße Fettgewebe in mindestens 10 Milliliter 4%Leistungsformaldehyd in PBS in einem 15 Milliliter Kunststoffrohr bevorzugt unter einer chemischen Haube einzutauchen. Schütteln Sie das Gewebe auf einer Rollplatte bei Raumtemperatur für eine Stunde, bevor Sie das Rohr über Nacht bei vier Grad Celsius auf eine Rollplatte übertragen. Am nächsten Morgen spülen Sie das feste weiße Fettgewebe in 10 Milliliter PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur ab, um alle Spuren von Fixiermittel zu entfernen und das Gewebe in ein 15 Milliliter-Rohr mit 10 Millilitern 0,3%Glycin in PBS für eine eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur auf einem Orbital-Shaker bei 100 Umdrehungen pro Minute zu übertragen.Wenn die verbleibenden freien Aldehydgruppen abgeschreckt wurden, tauchen Sie das Gewebe in eine 15-Milliliter-Röhre mit 10 Millilitern 0,2%Triton X-100 in PBS für eine zweistündige Inkubation mit Schütteln bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation behandeln Sie das Gewebe mit 10 Millilitern von 0,2%Triton X-100 und 20%DMSO mit Schütteln bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Morgen tauchen Sie das Gewebe in ein 15 Milliliter Kunststoffrohr mit 10 Milliliter n.20, 0,1% Triton X-100, 0,1% Desoxycholat und 20% DMSO in PBS für eine mindestens 24-stündige Inkubation bei 37 Grad Celsius schütteln.Am Ende der Inkubation spülen Sie das Gewebe mit 10 Millilitern 0,2%Triton X-100 in PBS auf einem Orbitalshaker bei 100 Umdrehungen pro Minute für eine Stunde. Gefolgt von eintauchen in 15 Milliliter von 0,2%Triton X-100, 10%DMSO und 3%BSA in PBS für 12 Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln. Zur Färbung des weißen Fettgewebes.Übertragen Sie das Gewebe in 300 Mikroliter 0,2%Triton X-100, 10%DMSO und 3%BSA in PBS, ergänzt mit den primären Antikörpern von Interesse in einem 1,5 Milliliter Mikrorohr schützen es vor Licht mit Aluminiumfolie und legen Sie das Rohr in eine 50 Milliliter Falcon Tube. Legen Sie die Röhre in den Orbital-Shaker für eine zweitägige Inkubation bei 37 Grad Celsius mit Schütteln. Am Ende der Inkubation spülen Sie das Gewebe zweimal in 10 Milliliter von 0,2%Triton X-100, 10%DMSO und 3%BSA in PBS für fünf Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln und Schutz vor Licht.Nach der zweiten Spülung waschen Sie das Gewebe in 10 Milliliter frische 0,2%Triton X-100, 10% DMSO und 3%BSA und PBS für 16 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, dann das Gewebe in ein 1,5 Milliliter Rohr mit 300 Mikrolitern 0,2%Triton X-100, 10% DMSO und 3%BSA in PBS übertragen, ergänzt mit den entsprechenden Sekundärantikörpern und schützen das Röhrenlicht mit Aluminiumfolie vor Licht. Nach einer zweitägigen Inkubation bei 37 Grad Celsius auf einem Shaker, waschen Sie das Gewebe zweimal in 10 Milliliter von 0,2%Triton X-100, 10% DMSO und 3%BSA in PBS für fünf Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln vor Licht geschützt. Nach der zweiten Wäsche spülen Sie das Gewebe in ein Rohr mit 10 Millilitern frisch0,2%Triton X-100, 10%DMSO und 3%BSA in PBS für 16 bis 48 Stunden bei 37 Grad Celsius mit Schütteln und Lichtschutz.Gefolgt von einer zweistündigen Wäsche in 10 Milliliter PBS allein bei 37 Grad Celsius mit Schütteln und Lichtschutz. Für weißes Fettgewebe Clearing am Ende der PBS-Waschanlage tauchen Sie das Gewebe und 10 Milliliter einer aufsteigenden Ethanol-Konzentrationsserie für eine zweistündige Inkubation pro Konzentration bei Raumtemperatur mit lichtgeschütztem Schütteln ein. Am nächsten Morgen tauchen Sie das Gewebe in eine 20-Milliliter-Glasflasche mit einer Plastikkappe ein, die fünf Milliliter Methylsalicylat in einer Dunstabzugshaube enthält.Das weiße Fettgewebe ist in diesem Stadium noch deutlich sichtbar. Schütteln Sie den Behälter mindestens zwei Stunden lang vor Licht bei Raumtemperatur. Das weiße Fettgewebe wird vollständig transplantiert.Für die konfokale 3D-Bildgebung des gebeizten und gereinigten weißen Fettgewebes befestigen Sie eine metallische Bildgebungskammer, die mit einem Glasboden ausgestattet ist und in einer Dunstabzugshaube das Gewebe in die Kammer überträgt. Füllen Sie die Kammer mit frischem Methylsalicylat. Schließen Sie die Montage der Kammer durch Hinzufügen eines kleinen Abdeckungsschlupfes, um das Gewebe zu stabilisieren, und eines großen Abdeckungsschlupfes, um die Kammer zu schließen.Legen Sie die Kammer auf eine invertierte konfokale Mikroskopstufe für die Gewebebildgebung bei geringer Vergrößerung, um einige Kubikzentimeter 3D-Karten der gesamten Fettgewebeprobe zu erzeugen. Verwenden Sie nach der 3D-Kartengenerierung ein 20-fache Seweitemluftobjektiv, das ein gutes Verhältnis zwischen Auflösung und Tiefe bietet, um mehrere Bereiche für die Gewebeprobenahme bei höherer Vergrößerung auszuwählen. Für die Zellsegmentierung konvertieren Sie 3D-Stacks in das Softwareformat, um Speicherplatz freizugeben.Vor dem Öffnen des Zellenmoduls der Software. Ändern Sie die Zelldetektionseinstellung in Plasmamembranfärbung, und wählen Sie den Fluoreszenzkanal des Markers aus, der zur Abgrenzung der Zellperipherie verwendet wird. Richten Sie dann die Schwellenwerte ein, stellen Sie einen Bereich der erwarteten Zellengrößen bereit, und führen Sie die Segmentierung aus.Die Auswirkungen der Reinigung auf das weiße Fettgewebe von Mensch und Maus können mit bloßem Auge beobachtet werden. Clearing verbessert auch die Bildtiefe des Gewebes, das erfasst werden kann, drastisch. Und erleichtert die Erstellung von 3D-Bildgebung und 3D-Kartengenerierung aus 4X Vergrößerung.Die 3D-Mapping-Zuordnung ermöglicht es ferner, die Auswahl verschiedener Interessengebiete bei einer 20-fachen Vergrößerung bis zu einer Tiefe von zwei Millimetern zu erwerben. Spezifische Färbung von Lipidtröpfchen und Adipozyten kann mit Perilipin bzw. Anti-GLUT4-Antikörpern erreicht werden. Blutgefäße können entweder mit CD31-Antikörper oder intravenöser Injektion von Lectin DyLight 649 kurz vor dem Opfer nachgewiesen werden.Makrophagen und T-Zellen können mit Anti-CD301-Phycoerythrin-Antikörpern und Anti-TCR-Beta-Pazifik-Blau-Antikörpervisualisiert werden. Das periphere Nervennetz kann mit Anti-Tyrosin-Hydroxylase-Antikörper nachgewiesen werden. Anhand dieser Kennzeichnungen können dann die mittlere Größe und Größenverteilung der Adipozyten und die Dichte des Blutgefäßnetzes im Fettgewebe bestimmt werden.Es ist wichtig, die Besatzungszeit zu befolgen, wie gezeigt, da eine schlechte Probenvorbereitung nicht zu einer guten Bildqualität führt. Dieses Protokoll kann mit einem fortschrittlichen Bildgebungssystem kombiniert oder mit der nachbearbeitungder Bildanalyse-Freeware gekoppelt werden.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Forschung

Biologie

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-PRESTO: Biologische Gewebe Clearing und Immunmarkierung Methoden für Volume Imaging

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

Probenvorbereitung und Bildgebung von Exosomen von Transmissions-Elektronenmikroskopie

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

Visualisierung von 3D weißen Fettgewebe Schachts ganz-Mount Färbung

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

Optische Reinigung von Pflanzengeweben für die Fluoreszenzbildgebung

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...