Name: exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging
Uploaded: 2020-08-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי INSERM, אוניברסיטת קוט ד 'אזור, ועל ידי מענקים מסוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR) באמצעות ההשקעות עבור ה-Labex SIGNALIFE העתידי (ANR-11-LABX-0028-01), התוכנית UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) באמצעות האקדמיה 2 "מתחמי Systèmes" והאקדמיה 4 "Complexité et diversité du vivant", Fondation pour la Recherche Médical (Équipe FRM DEQ20180839587), ואת תוכנית החוקר הצעיר לג'יי.ג'יי (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). אנו מודים גם למתקן ליבת ההדמיה של C3M במימון קונסיל דפרטמנטל דה אלפס-מריטיים ו-Région PACA, אשר נתמך גם על ידי פלטפורמת המיקרוסקופ וההדמיה IBISA Côte d'Azur (MICA). אנו מודים למריון דוסוט על העזרה הטכנית בהכנת רקמות. אנו מודים לאבי קאטריס, הנראות המדעית הבינלאומית של UCA, על קריאת כתב היד.

פרוטוקול זה נבדק ומאומת עבור כל מחסני רקמת השומן של העכבר והאדם הלבן. רקמות שומן אדם ועכבר נאספו בהתאם לחוקים האירופיים ואושרו על ידי ועדות אתיות צרפתיות ושוודיות.
1. קיבעון של רקמת השומן לבן של העכבר והאדם
<ol><li>לטבול את העכבר שנקטפו או רקמות שומן לבן אנושי לפחות 10 מ"ל של PBS ה?...

<ol>
	<li>Pellegrinelli, V., Carobbio, S., Vidal-Puig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+plasticity:+how+fat+depots+respond+differently+to+pathophysiological+cues.">Adipose tissue plasticity: how fat depots respond differently to pathophysiological cues.</a> Diabetologia. 59 (6), 1075-1088 (2016).</li><li>Stern, J. H., Rutkowski, J. M., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adiponectin,+Leptin,+and+Fatty+Acids+in+the+Maintenance+of+Metabolic+Homeostasis+through+Adipose+Tissue+Crosstalk.">Adiponectin, Leptin, and Fatty Acids in the Maintenance of Metabolic Homeostasis through Adipose Tissue Crosstalk.</a> Cell Metabolism. 23 (5), 770-784 (2016).</li><li>Mittendorfer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+metabolic+complications+in+obesity:+adipose+tissue+and+free+fatty+acid+trafficking.">Origins of metabolic complications in obesity: adipose tissue and free fatty acid trafficking.</a> Current Opinion in Clinical Nutrition &amp; Metabolic Care. 14 (6), 535-541 (2011).</li><li>Hammarstedt, A., Gogg, S., Hedjazifar, S., Nerstedt, A., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+Adipogenesis+and+Dysfunctional+Adipose+Tissue+in+Human+Hypertrophic+Obesity.">Impaired Adipogenesis and Dysfunctional Adipose Tissue in Human Hypertrophic Obesity.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 1911-1941 (2018).</li><li>Moreno-Indias, I., Tinahones, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+adipose+tissue+expandability+and+lipogenic+capacities+as+ones+of+the+main+causes+of+metabolic+disorders.">Impaired adipose tissue expandability and lipogenic capacities as ones of the main causes of metabolic disorders.</a> Journal of Diabetes Research. 2015, 970375 (2015).</li><li>Vergoni, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+and+the+Activation+of+the+p53+Pathway+Mediate+Alterations+in+Metabolic+and+Secretory+Functions+of+Adipocytes.">DNA Damage and the Activation of the p53 Pathway Mediate Alterations in Metabolic and Secretory Functions of Adipocytes.</a> Diabetes. 65 (10), 3062-3074 (2016).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Zwick, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+hypertrophy+and+lipid+dynamics+underlie+mammary+gland+remodeling+after+lactation.">Adipocyte hypertrophy and lipid dynamics underlie mammary gland remodeling after lactation.</a> Nature Communication. 9 (1), 3592 (2018).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammatory+changes+of+adipose+tissue+in+late+pregnant+mice.">The inflammatory changes of adipose tissue in late pregnant mice.</a> Journal of Molecular Endocrinology. 47 (2), 157-165 (2011).</li><li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity+increases+the+production+of+proinflammatory+mediators+from+adipose+tissue+T+cells+and+compromises+TCR+repertoire+diversity:+implications+for+systemic+inflammation+and+insulin+resistance.">Obesity increases the production of proinflammatory mediators from adipose tissue T cells and compromises TCR repertoire diversity: implications for systemic inflammation and insulin resistance.</a> Journal of Immunology. 185 (3), 1836-1845 (2010).</li><li>Laforest, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+three+human+adipocyte+size+measurement+methods+and+their+relevance+for+cardiometabolic+risk.">Comparative analysis of three human adipocyte size measurement methods and their relevance for cardiometabolic risk.</a> Obesity. 25 (1), 122-131 (2017).</li><li>Azaripour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+survey+of+clearing+techniques+for+3D+imaging+of+tissues+with+special+reference+to+connective+tissue.">A survey of clearing techniques for 3D imaging of tissues with special reference to connective tissue.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 51 (2), 9-23 (2016).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Chi, J., Crane, A., Wu, Z., Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipo-Clear:+A+Tissue+Clearing+Method+for+Three-Dimensional+Imaging+of+Adipose+Tissue.">Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e58271 (2018).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+Clearing+of+the+Mouse+Central+Nervous+System+Using+Passive+CLARITY.">Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY.</a> Journal of Visualized Experiments. (112), e540225 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+imaging+of+optically+cleared+tissue+using+a+simplified+CLARITY+method+and+on-chip+microscopy.">3D imaging of optically cleared tissue using a simplified CLARITY method and on-chip microscopy.</a> Science Advances. 3 (8), 1700553 (2017).</li><li>Ke, M. T., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+fixed+brain+samples+using+SeeDB.">Optical clearing of fixed brain samples using SeeDB.</a> Current Protocols in Neuroscience. 66, 22 (2014).</li><li>Hahn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+fluorescent+whole+mouse+brains+using+stabilised+organic+media+(sDISCO).">High-resolution imaging of fluorescent whole mouse brains using stabilised organic media (sDISCO).</a> Journal of Biophotonics. 12 (8), 201800368 (2019).</li><li>Spalteholz, W., Hierzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von Menchlichen und Tierichen Pr&#228;paraten und Seine Theoretischen. , (1911).</li><li>Shields, K. J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Adipose+Tissue+Proteomics.">Differential Adipose Tissue Proteomics.</a> Methods in Molecular Biology. 1788, 243-250 (2018).</li><li>Bourlier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+phenotype+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+macrophages.">Remodeling phenotype of human subcutaneous adipose tissue macrophages.</a> Circulation. 117 (6), 806-815 (2008).</li><li>Hagberg, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+Cytometry+of+Mouse+and+Human+Adipocytes+for+the+Analysis+of+Browning+and+Cellular+Heterogeneity.">Flow Cytometry of Mouse and Human Adipocytes for the Analysis of Browning and Cellular Heterogeneity.</a> Cell Reports. 24 (10), 2746-2756 (2018).</li><li>Hill, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+populations+direct+inflammatory+versus+physiological+changes+in+adipose+tissue.">Distinct macrophage populations direct inflammatory versus physiological changes in adipose tissue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 115 (22), 5096-5105 (2018).</li><li>Acosta, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+transcriptomics+suggest+that+human+adipocyte+progenitor+cells+constitute+a+homogeneous+cell+population.">Single cell transcriptomics suggest that human adipocyte progenitor cells constitute a homogeneous cell population.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 250 (2017).</li><li>Coppack, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+changes+in+obesity.">Adipose tissue changes in obesity.</a> Biochemical Society Transactions. 33, 1049-1052 (2005).</li><li>Cancello, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+macrophage+infiltration+and+chemoattractant+gene+expression+changes+in+white+adipose+tissue+of+morbidly+obese+subjects+after+surgery-induced+weight+loss.">Reduction of macrophage infiltration and chemoattractant gene expression changes in white adipose tissue of morbidly obese subjects after surgery-induced weight loss.</a> Diabetes. 54 (8), 2277-2286 (2005).</li><li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipocyte+differentiation+and+transdifferentiation:+plasticity+of+the+adipose+organ.">Adipocyte differentiation and transdifferentiation: plasticity of the adipose organ.</a> Journal of Endocrinology Investigation. 25 (10), 823-835 (2002).</li><li>Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obesity-induced+inflammatory+changes+in+adipose+tissue.">Obesity-induced inflammatory changes in adipose tissue.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (12), 1785-1788 (2003).</li><li>Li, X., Mao, Z., Yang, L., Sun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-staining+Blood+Vessels+and+Nerve+Fibers+in+Adipose+Tissue.">Co-staining Blood Vessels and Nerve Fibers in Adipose Tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e59266 (2019).</li><li>Gustafsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+live-cell+conventional+fluorophore+nanoscopy+with+ImageJ+through+super-resolution+radial+fluctuations.">Fast live-cell conventional fluorophore nanoscopy with ImageJ through super-resolution radial fluctuations.</a> Nature Communication. 7, 12471 (2016).</li></ol>

השינויים המתרחשים בתוך רקמת השומן במהלך ההתקדמות הפתולוגית, כגון זה של השמנת יתר, הוא בסיסי להבנת המנגנונים מאחורי הפתולוגיה. מחקרים חלוציים שחשפו מנגנונים כאלה ברקמת שומן התבססו על גישות גלובליות כגון פרוטאומיקה רקמת שומןשלמה 21, ציתוםזרימה 22,23</...

השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסת רקמת שומן והפכה לבעיה גדולה ברחבי העולם לבריאות הציבור, בהתחשב בכך שאנשים עם השמנת יתר יש סיכון מוגבר לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, מחלות כבד וכמה סוגי סרטן.
פונקציה פיזיולוגית בסיסית של רקמת שומן היא לווסת גלוקוז כל הגוף הומאוסטאזיסשומנים 1,,2. במהלך תקופת ההאכלה, adipocytes (כלומר, התאים העיקריים של רקמת שומן) לאחסן את עודף הגלוקוז והשומנים המסופקים על ידי ארוחה לתוך טריגליצרידים. במהלך הצום, adipocytes לשבור את הטריגליצרידים לתוך חומצות שומן לא esterified גליצרול כדי לקיים את הביקוש האנרגיה של הגוף. במהלך התפתחות השמנת יתר, רקמת שומן להרחיב על ידי הגדלת הגודל (היסטרופיה) ו / או את המספר (היפרפלזיה) של adipocytes1,כדי להגדיל את קיבולת האחסון שלהם. כאשר ההתפשטות של רקמת שומן מגיע לגבול שלה, משתנה מאוד קבוע בקרב חולים, שומנים הנותרים מצטברים לתוך איברים מטבוליים אחרים כולל שרירים וכבד3, 4,המוביל לכשל התפקודישלהם וייזום סיבוכים אירוביים הקשורים להשמנת יתר1,,5. לכן, זיהוי המנגנונים השולטים בהרחבת רקמת שומן הוא אתגר קליני מרכזי.
השינויים המורפולוגיים המתועדים בתוך רקמות שומן במהלך השמנת יתר קשורים לתפקוד הפתולוגי שלה. מספר הליכי כתמים שימשו לתיאור ארגון הרקמות של רקמת השומן, כולל actin6, סמני כלידם 7, סמנים שומנים-טיפות8, וסמניםספציפיים תא חיסוני9,,10. עם זאת, בגלל הקוטר העצום של adipocytes (50 כדי 200 μm)11, זה חיוני לנתח חלק גדול של הרקמה כולה בשלושה ממדים על מנת לנתח במדויק את השינויים המבניים הדרמטיים AT שנצפו במהלך השמנת יתר. עם זאת, מכיוון שהאור אינו חודר רקמה אטומה, הדמיה ב3D בתוך דגימות רקמה גדולה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסץ אינה אפשרית. שיטות של ניקוי רקמות כדי להפוך אותם שקופים דווחו בספרות(לסקירה, ראה 12)המאפשר אחד לנקות רקמות ולבצע מעמיק, מיקרוסקופ פלואורסק של רקמות שלם. שיטות אלה מציעות הזדמנויות חסרות תקדים להעריך את הארגון הסלולרי 3D ברקמה בריאה וחלויה. לכל אחת מהשיטות המתוארות יש יתרונות וחסרונות, ולכן יש לבחור בקפידה בהתאם לרקמות הנחקרות (לסקירה,ראה 13). ואכן, גישות מסוימות דורשות תקופת דגירה ארוכה ו/או שימוש בחומרים או תרכובותיקרים, רעילים או קשים להשגה של 14, 15,,15,16,,17,,18,,19. תוך ניצול של אחת התרכובות הראשונות ששימשו לפני מאה שנה על ידי ורנר Spalteholzכדי לנקות רקמות 20, הקמנו פרוטוקול ידידותי למשתמש ולא יקר כי הוא מותאם היטב עבור ניקוי של כל העכבר ומחסני רקמת שומן אנושי בכל מעבדה עם ציוד טיפוסי כולל מכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ confocal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microtubes</td>
			<td>Eppendorff tubes - Dutscher</td>
			<td>33528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL plastic tubes</td>
			<td>Falcon tubes - Dutscher</td>
			<td>352096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 mm round glass coverslip</td>
			<td>Mariendfeld</td>
			<td>0117580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL glass bottle</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-605-150</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rabbit-alexa647-conjugated antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-605-152</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A6003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD301-PE antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE145703</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab215912</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial 3D analysis software - IMARIS</td>
			<td>Oxford instrument</td>
			<td></td>
			<td>with Cell module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope - Nikon A1R</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Stock Concentration: 5 mg/mL; dilution 1/1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D6750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glut4 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-53566</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin-DyLight649</td>
			<td>Vector Lab</td>
			<td>DL-1178-1</td>
			<td>Stock Concentration : 2 &#181;g/&#181;L; IV Injection: 50 &#181;L/mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metallic imaging chamber equipped with glass bottom - AttoFluor Chamber</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A7816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M6752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perilipin antibody</td>
			<td>Progen</td>
			<td>651156</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCR-&#946;-PB antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>BLE109225</td>
			<td>Dilution: 1/100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TH antibody</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>ab112</td>
			<td>Dilution: 1/50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>P416</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3d imaging

השמנת יתר היא בעיה גדולה ברחבי העולם בריאות הציבור שמגביר את הסיכון לפתח מחלות לב וכלי דם, סוכרת סוג 2, ומחלות כבד. השמנת יתר מאופיינת בעלייה במסה של רקמת שומן (AT) בשל היפרפלזיה אדפוציט ו/או היסטרופיה, מה שמוביל לשיפוץ עמוק של המבנה התלת מימדי שלה. אכן, היכולת המקסימאלית של AT להתרחב במהלך השמנת יתר היא חיונית להתפתחות של פתולוגיות הקשורות להשמנת יתר. הרחבת AT זה היא מנגנון הוםוסטטי חשוב כדי לאפשר הסתגלות לעודף צריכת אנרגיה ולהימנע שפיכת שומנים מזיקים לאיברים מטבוליים אחרים, כגון שריר וכבד. לכן, הבנת השיפוץ המבני שמוביל לכישלון של הרחבת AT היא שאלה בסיסית עם ישימות קלינית גבוהה. במאמר זה, אנו מתארים שיטת ניקוי פשוטה ומהירה המשמשת באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי לחקור את המורפולוגיה של רקמת שומן לבנה של עכבר ואדם לבן על ידי הדמיית פלורסנט. שיטת ניקוי AT ממוטבת זו מבוצעת בקלות בכל מעבדה סטנדרטית המצוידת במכסה מנוע כימי, שייקר מסלולי מבוקר טמפרטורה ומיקרוסקופ פלורסנט. יתר על כן, תרכובות כימיות בשימוש זמינים. חשוב לציין, שיטה זו מאפשרת לפתור את מבנה 3D AT על ידי הכתמת סמנים שונים כדי לדמיין באופן ספציפי את adipocytes, רשתות עצביות וסקולריות, ואת התפלגות תאי החיסון המולדת ואדפטיבית.

באמצעות ההליך המתואר כאן ומסוכם איור 1, הצלחנו להכתים ולטהר אופטית את רקמת השומן האנושית והעכבר הלבנה כפי שהוצגה בדמות 2A ו-איור 2B, בהתאמה. הרקמה הנוקתה הועברה לתא ההדמיה המתכתי כדי לבצע הדמיה קונפוקאלית(איור 3א). ההבהרה שיפרה ...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging at JoVE.com

Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging

כאן, אנו מתארים שיטת סליקה פשוטה, זולה ומהירה כדי לפתור את המבנה 3D של רקמת שומן לבנה עכבר ואדם באמצעות שילוב של סמנים כדי לדמיין כלי דם, גרעין, תאים חיסוניים, נוירונים, וחלבונים מעיל שומנים-טיפות על ידי הדמיה פלואורסצנטית.

חקר מבנה רקמת שומן על ידי ניקוי מתילסיילאט והדמיה תלת-ממדית

Obesity is a major worldwide public health issue that increases the risk to develop cardiovascular diseases, type-2 diabetes, and liver diseases. Obesity ...

פרוטוקולים אלה מאפשרים ניתוח של מבנה תלת מימדי של אדם גדול מאוד על מיקרוסקופיה בלט רקמת שומן עכבר. להקל על הקישור של תפקוד פתולוגי עם שינויים מבניים ברקמת השומן. תהליך ניקוי זה הם פשוטים מאוד, מותאם היטב כדי לנקות את האדם על רקמת שומן עכברים חמים ולהשתמש ממס רעיל פחות כגון אתנול או מתיל salicylate לעומת פרוטוקולים ברורים אחרים.התחל על ידי טבילת העכבר שנקטף או רקמת שומן לבן אנושי לפחות 10 מיליליטר של פורמלדהיד כוח 4% ב PBS בצינור פלסטיק 15 מיליליטר עדיף תחת מכסה המנוע הכימי. לנער את הרקמה על צלחת מתגלגלת בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת לפני העברת הצינור לצלחת מתגלגלת בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר לשטוף את רקמת השומן הלבן קבוע ב 10 מיליליטר של PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את כל העקבות של תיקון ולהעביר את הרקמה לצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.3% גליצין ב PBS עבור דגירה של שעה אחת בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולית ב 100 מהפכות לדקה.כאשר קבוצות אלדהיד חינם הנותרים כבר מרווה, לטבול את הרקמה בצינור 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ב PBS עבור דגירה של שעתיים עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה לטפל ברקמה עם 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ו 20% DMSO עם רועד ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר לטבול את הרקמה בצינור פלסטיק 15 מיליליטר המכיל 10 מיליליטר של 0.1%Tween 20, 0.1% טריטון X-100, 0.1% deoxycholate ו 20% DMSO ב PBS עבור דגירה לפחות 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד.בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמה עם 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100 ב PBS על שייקר מסלולית ב 100 מהפכות לדקה במשך שעה אחת. ואחריו טבילה ב 15 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10% DMSO ו 3%BSA ב PBS במשך 12 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. להכתמת רקמת השומן הלבנה.העבר את הרקמה ל-300 מיקרוליטרים של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS, בתוספת הנוגדנים העיקריים המעניינים בצינור מיקרו 1.5 מיליליטר להגן עליו מפני אור עם רדיד אלומיניום ולמקם את הצינור לתוך צינור פלקון 50 מיליליטר. מניחים את הצינור לתוך שייקר מסלולית עבור דגירה של יומיים ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות. בסוף הדגירה שוטפים את הרקמה פעמיים ב-10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS למשך חמש שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות והגנה מפני אור.לאחר השטיפה השנייה לשטוף את הרקמה ב 10 מיליליטר של טריטון X-100 טריטון טרי, 10% DMSO ו 3%BSA ו PBS במשך 16 עד 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעידות, לאחר מכן להעביר את הרקמה לצינור 1.5 מיליליטר המכיל 300 microliters של 0.2% טריטון X-100, 10%DMSO ו 3%BSA ב PBS, בתוספת נוגדנים משניים המתאימים ולהגן על הצינור מפני אור באמצעות רדיד אלומיניום. לאחר דגירה של יומיים ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר, לשטוף את הרקמה פעמיים ב 10 מיליליטר של 0.2% טריטון X-100, 10% DMSO ו 3% BSA ב PBS במשך חמש שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד מוגן מפני אור. לאחר הכביסה השנייה, שטפו את הרקמה לצינור המכיל 10 מיליליטר של טריטון X-100 טריטון טרי, 10%DMSO ו-3%BSA ב-PBS למשך 16 עד 48 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עם הגנה מפני רעידות ואור.ואחריו שטיפה של שעתיים ב 10 מיליליטר של PBS לבד ב 37 מעלות צלזיוס עם רועד והגנה קלה. עבור ניקוי רקמת שומן לבן בסוף לשטוף PBS לטבול את הרקמה ו 10 מיליליטר של עולה שליחת סדרת ריכוז אתנול עבור דגירה של שעתיים לכל ריכוז בטמפרטורת החדר עם רועד מוגן מפני אור כאמור. למחרת בבוקר לטבול את הרקמה בבקבוק זכוכית 20 מיליליטר עם כובע פלסטיק המכיל חמישה מיליליטר של מתיל סליסילאט במכסה המנוע אדים.רקמת השומן הלבנה עדיין נראית בבירור בשלב זה. לנער את המיכל להגן עליו מפני אור בטמפרטורת החדר לפחות שעתיים. רקמת השומן הלבנה הופכת להשתלה לחלוטין.עבור הדמיה קונפוקלית תלת מימדית של רקמת השומן הלבנה המוכתמת והמנוקה, הר תא הדמיה מתכתי המצויד בתחתית זכוכית ותוך מכסה המנוע של האדים מעביר את הרקמה לתא. מלאו את התא במתיל סליסילאט טרי. לסיים את ההרע של התא על ידי הוספת להחליק כיסוי קטן כדי לייצב את הרקמה להחליק כיסוי גדול כדי לסגור את התא.מניחים את התא על שלב מיקרוסקופ קונפוקל הפוך עבור הדמיית רקמות בהגדלה נמוכה כדי ליצור כמה מפות 3D סנטימטר מעוקב של מדגם רקמת השומן כולו. לאחר יצירת מפה תלת-מימדית, השתמשו ביעד אוויר למרחקים ארוכים פי 20 המספק יחס טוב בין הרזולוציה לעומק כדי לבחור מספר אזורים לדגימת רקמות בהגדלה גבוהה יותר. לפילוח תאים, המירו ערימות תלת-מימדיות לתבנית התוכנה כדי לפנות שטח זיכרון.לפני פתיחת מודול התא של התוכנה. שנה את הגדרת זיהוי התאים לכתמי קרום פלזמה ובחר את ערוץ הפלואורסצנט של הסמן המשמש לתיחום הפריפריה של התא. לאחר מכן הגדר את ערכי הסף, ספק טווח של גדלי התאים הצפויים והפעל את הפילוח.ההשפעות של ניקוי על רקמת שומן לבן אדם ועכבר ניתן לראות בעין בלתי. ניקוי גם משפר באופן דרסטי את עומק התמונה של הרקמה כי הוא מסוגל להיות נרכש. ומקל על הדמיה תלת-ממדית של רקמות שלמות ועל יצירת מפה תלת-ממדית מתוך הגדלה של פי 4.מיפוי תלת-מימדי מאפשר עוד יותר לרכוש את הבחירה של תחומי עניין שונים בהגדלה של פי 20 לעומק של שני מילימטרים. כתמים ספציפיים של טיפות השומנים והאדיפוזיטים ניתן להשיג באמצעות נוגדנים perilipin ו anti-GLUT4 בהתאמה. כלי דם ניתן לזהות באמצעות נוגדן CD31 או הזרקה תוך ורידי של Lectin DyLight 649 זמן קצר לפני ההקרבה.ניתן לדמיין מקרופאגים ותאי T באמצעות נוגדן פיקוריתרין נגד CD301 ונוגדן כחול בטא פסיפיק נגד TCR. רשת העצבים ההיקפיים ניתן לזהות באמצעות נוגדן אנטי טירוסין Hydroxylase. באמצעות תיוגים אלה ניתן לקבוע את הגודל והגודל הממוצעים של האדיפוזיטים ואת צפיפות רשת כלי הדם בתוך רקמת השומן.זה חיוני כדי לעקוב אחר זמן הכיבוש כפי שהוכח כי הכנה מדגם לקוי לא יגרום איכות תמונה טובה. פרוטוקול זה יכול להיות משולב עם מערכת הדמיה מתקדמת או ניתן לשילוב לאחר עיבוד תמונה ניתוח תוכנה חופשית.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

ACT-PRESTO: Biological Tissue Clearing and Immunolabeling Methods for Volume Imaging

ACT-Presto: סליקה רקמות ביולוגיות ושיטות immunolabeling הדמיה נפח

The identification and exploration of the detailed organization of organs or of the whole body at the cellular level are fundamental challenges in ...

Sample Preparation and Imaging of Exosomes by Transmission Electron Microscopy

הכנת הדוגמא והדימות של Exosomes על ידי במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

Exosomes are nano-sized extracellular vesicles secreted by body fluids and are known to represent the characteristics of cells that secrete them. The ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

הדמיה של מבנה שומן לבן תלת-ממד באמצעות צביעת כולה-הר

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

Optical Clearing of Plant Tissues for Fluorescence Imaging

ניקוי אופטי של רקמות צמחים להדמיית פלואורסצנטיות

It is challenging to directly observe the internal structure of multi-layered and opaque plant specimens, without dissection, under a microscope. In ...

Semi-Automated Isolation of Murine White Adipose Tissue

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator

Semi-Automated Isolation of the Stromal Vascular Fraction from Murine White Adipose Tissue Using a Tissue Dissociator (Video) | JoVE 

בידוד חצי אוטומטי של מקטע כלי הדם הסטרומלי מרקמת השומן הלבנה באמצעות דיסוציאטור רקמות

The in vitro study of white, brown, and beige adipocyte differentiation enables the investigation of cell-autonomous functions of adipocytes and their ...